丹栝方對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠糖脂代謝及活性氧、胸主動脈核因子κB表達及其mRNA表達的影響

歐陽金明 楊明華

1 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

2 浙江省中藥研究所 浙江 杭州 310016

筆者通過實驗研究，分析丹栝方對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠糖脂代謝及活性氧（ROS）、胸主動脈核因子κB（NF-κB）及其mRNA表達的影響。結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：選擇我院實驗中心提供的80只雄性SPF級糖尿病GOTO-KAKIZAKI大鼠作為研究對象，糖尿病均為自發(fā)，均為13周齡，平均體質量346.98±25.13g；同時選擇我院實驗中心提供的20只雄性SPF級Wistar大鼠開展研究，均為13周齡，平均體質量362.85±12.37g。根據(jù)每籠5只將大鼠獨立飼養(yǎng)在通氣籠具系統(tǒng)中，設定溫度21～23℃，濕度45.0%～55.0%，飼料配方：由實驗中心提供普通飼料，高脂飼料由2.00%膽固醇、87.63%普通飼料、0.07%丙基硫氧嘧啶、10.00%精煉豬油和0.30%豬膽鹽構成。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 藥物：丹栝方屬中藥方劑，配伍嚴謹，方劑組成如下：丹參、白僵蠶9g，瓜蔞（栝蔞）12g，川芎、郁金、薤白各10g，赤芍6g。加水煎煮成1g/ml丹栝方藥液（內含原生藥1∶1）。辛伐他?。ê贾菽硸|制藥有限公司，國藥準字J20180007，20mg/片）配制為懸濁液，濃度0.25mg/ml。二甲雙胍（山東力諾制藥有限公司，國藥準字H37023557，0.25g）準確配制為懸濁液，濃度18.75mg/ml。

1.2.2 造模：取80只GOTO-KAKIZAKI大鼠,2次快速血糖平均水平≥11.1mmol/L視作糖尿病成模大鼠。所有GOTO-KAKIZAKI大鼠給予高脂飼料喂飼，腹腔注射10mg/（kg?d）NOS抑制劑-L-NAME（N-硝基L-精氨酸甲酯），持續(xù)喂飼2周，介導動脈粥樣硬化發(fā)生。6個月后，于顯微鏡下觀察動脈形態(tài)。給予每只大鼠皮下注射2U/d諾和靈N，持續(xù)注射10d，結果顯示大鼠的易激惹癥狀不斷減輕。于第14d檢測血糖水平約為10mmol/L，停止胰

1.2.3 分組和干預方法：根據(jù)體質量對GOTO-KAK‐IZAKI糖尿病成模大鼠進行分層，依據(jù)血糖水平，按隨機數(shù)表法分成丹栝方組20只，應用8ml/（kg·d）丹栝方治療；二甲雙胍組20只，應用150mg/（kg·d）二甲雙胍治療；辛伐他汀組20只，應用2mg/（kg·d）辛伐他汀治療；模型組20只，給予8ml/（kg·d）無菌水喂飼；同期選擇20只同齡、同體質量Wistar大鼠納入正常對照組，給予普通飼料喂飼。在預實驗基礎上干預管理6個月后，各組大鼠不禁水但禁食12h獲取組織標本。

1.2.4 測定指標：對大鼠的毛發(fā)和精神狀態(tài)、食量、活動狀況、體質量等進行觀察。6個月后，各組大鼠均接受12h禁食，經(jīng)腹腔注射0.3ml/100g的10%水合氯醛。麻醉后于腹部正中線位置剖開，分離腹主動脈血管，抽取血液10ml后置于3000r/min離心處理10min，提取血清，放于-20℃冰箱內凍存，待測。另抽取1ml血液，置于10%EDTA二鈉中混勻，經(jīng) 3000r/min離心處理后提取血清，放于-20℃冰箱內凍存，備用。采集大鼠胸椎動脈弓組織置于4%多聚甲醛固定，實施HE染色；后將部分胸主動脈置入RNA液內進行保存，備用，檢測其mRNA。

1.2.5 檢測基礎指標：經(jīng)全自動生化儀對大鼠的空腹血糖（FBG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）等指標進行監(jiān)測，并經(jīng)特定蛋白分析儀檢測糖基化血紅蛋白（HbA1c）表達水平；同時，經(jīng)雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法測定ROS表達，嚴格按試劑盒要求開展實驗操作，試劑盒每列設定8孔，并每組設8個標本。

1.2.6 免疫組化法檢測胸主動脈NF-κB陽性表達率：經(jīng)免疫組化法測定胸主動脈NF-κB表達，嚴格按試劑盒要求實施操作，于顯微鏡下對細胞內陽性表達進行觀察，若分布棕黃色顆粒代表陽性細胞表達。

1.2.7 RT-PCR測定主動脈NF-κB mRNA陽性表達：經(jīng)RT-PCR法測定主動脈NF-κB mRNA表達，包括提取總RNA、逆轉錄制備cDNA、設計/合成引物、RT-PCR擴增cDNA，所有操作均嚴格按說明書要求實施。經(jīng)Rotor-Gene 6.0軟件依據(jù)反應的熒光對數(shù)據(jù)、標準品濃度進行實時監(jiān)控，對CT值進行計算。

1.3 統(tǒng)計學處理：應用SPSS 23.0研究統(tǒng)計學數(shù)據(jù)進行處理，計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗；計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基礎情況：各組大鼠接受干預前狀態(tài)表現(xiàn)良好，活潑好動且被毛光澤，但產(chǎn)生易激惹征象。實驗期間，辛伐他汀組、二甲雙胍組和模型組的大鼠分別死亡2只、4只、4只；丹栝方組和正常對照組大鼠未死亡。干預前各組大鼠的體質量對比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但干預完成時模型組、丹栝方組、二甲雙胍組、辛伐他汀組GOTO-KAKIZAKI大鼠的體質量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相較于干預前，干預后模型組和丹栝方組大鼠的體質量增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；正常Wistar大鼠的體質量隨著觀察時間延長而顯著增高。見表1。

2.2 各組FBG和HbA1c：干預后模型組大鼠的FBG、HbA1c水平均高于正常對照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 干預前后各組大鼠的體質量對比（±s，g）

表1 干預前后各組大鼠的體質量對比（±s，g）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與干預前比較，bP＜0.05。

干預后518.65±19.41b 374.53±23.55ab 368.24±30.97ab 357.62±30.89a 347.76±25.13a組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數(shù)20 16 20 18 16干預前362.27±11.64 359.82±29.76 357.29±23.43 358.36±24.32 356.84±25.19

表2 干預后各組大鼠的FBG和HbA1c水平比較（±s）

表2 干預后各組大鼠的FBG和HbA1c水平比較（±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組HbA1c（%）5.52±0.26#9.23±1.07 7.38±0.91#8.40±0.79#7.74±1.03#例數(shù)20 16 20 18 16 FBG（mmol/L）3.04±0.47#10.78±0.73 6.25±1.11#7.49±1.85#6.37±0.69#

2.3 各組血脂指標和ROS水平：模型組大鼠LDL-C及TC、HDL-C水平均高于正常對照組；模型組大鼠LDL-C和TC、TG、ROS水平均高于丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組；丹栝方組大鼠LDL-C和TC、TG水平均低于二甲雙胍組；丹栝方組大鼠HDL-C水平高于辛伐他汀組，上述差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠干預24周后血脂指標、ROS表達水平對比（±s，mmol/L）

表3 各組大鼠干預24周后血脂指標、ROS表達水平對比（±s，mmol/L）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與丹栝方組比較，eP＜0.05；與辛伐他汀組比較，fP＜0.05。

ROS 22.29±2.34 22.18±1.97 18.86±3.20#17.54±3.31#16.98±1.95#組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數(shù)20 16 20 18 16 LDL-C 0.58±0.33#13.84±1.17 7.26±1.12#8.15±2.01#9.13±0.94#e TC 2.39±0.24#16.38±1.15 9.87±0.83#10.54±2.03#11.68±0.95#e HDL-C 0.75±0.16#2.11±0.18 2.41±0.13f 1.75±0.24 2.06±0.25 TG 1.99±0.52 1.73±0.16 0.79±0.22#1.27±0.25#1.02±0.37#e

表4 各組大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA陽性表達率（±s，%）

表4 各組大鼠的NF-κB、NF-kB mRNA陽性表達率（±s，%）

注：與模型組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，*P＜0.05。

NF-κB mRNA 20.17±3.28#43.94±0.52 32.18±0.23#*16.34±0.05#*36.85±0.31#組別正常對照組模型組丹栝方組辛伐他汀組二甲雙胍組例數(shù)20 16 20 18 16 NF-κB陽性表達1.49±0.31#10.82±0.83 6.20±0.86#6.73±0.79#6.92±0.73#

2.4 各組NF-κB、NF-κB mRNA陽性表達率：模型組大鼠NF-κB陽性表達率、NF-κB mRNA陽性表達率均高于正常對照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；丹栝方組、辛伐他汀組大鼠的NF-κB mRNA陽性表達率均低于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 各組免疫組化法結果：于顯微鏡下觀察NF-κB陽性表達多處于中膜平滑細胞、內膜內皮細胞相關細胞核內，能發(fā)現(xiàn)褐色染色顆粒。正常組大鼠血管內膜偶見陽性表達；模型組呈強陽性表達，能見密集分布的褐色染色顆粒；而辛伐他汀組為陽性表達，內膜能發(fā)現(xiàn)分布較多褐色染色顆粒；但較弱于模型組；同時，丹栝方組、二甲雙胍組為弱陽性表達，能見散在分布的褐色染色顆粒。微量核酸-蛋白定量儀定量提取各組大鼠胸主動脈的總RNA發(fā)現(xiàn)，OC260/OC280值全部處于1.8～2.0范圍。

3 討論

近年來，隨著臨床深入研究氧化應激發(fā)現(xiàn)，促進患者血糖和血脂水平恢復正常，或是將氧化應激產(chǎn)生阻斷，將氧化應激產(chǎn)物消除，能有效降低氧化應激；但因氧化應激、肥胖、增齡、不良環(huán)境、吸煙和缺乏運動等相關因素影響，難以徹底消除氧化應激[1]。ACCORC（劃時代控制糖尿病心血管風險行動）研究結果顯示，開展嚴格的及強化的降壓和降糖、降脂干預，能有效減輕糖尿病大血管病變，預防或緩解糖尿病微血管病變[2]。研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥的多靶點作用存在多效性特點，如丹栝方具有適度的氧化應激調控能力，能夠在降低患者糖代謝指標、改善患者血液黏度的基礎上，在預防心血管并發(fā)癥風險中亦能起到良好的作用[3]。研究結果表明，體內氧化應激因子是造成糖尿病患者并發(fā)動脈粥樣硬化綜合征的主要指標機制和影響因素；而血液中的高脂、高糖通過刺激代謝系統(tǒng)，分泌氧化應激因子，進而對糖尿病患者的血管內皮細胞造成永久性損傷[4]。相關研究指出，氧化應激為心血管疾病、胰島素抵抗及糖尿病等相關病變發(fā)生的基礎，故認為對氧化應激進行干預，能有效防治糖尿病和其血管并發(fā)癥[5]。

中醫(yī)學認為，糖尿病是一種氣血津液疾病，機體痰濁易生和代謝失調為糖尿病發(fā)生重要原因，長時間可導致痰瘀互結及脈絡失養(yǎng)。丹栝方作為中藥制劑，將方內丹參和栝蔞作為君藥，具有化痰活血的作用；其中丹參性寒能入營血，而栝蔞性寒、潤，兩者合用發(fā)揮活血化瘀、清熱祛邪、養(yǎng)護營陰等功效，達到標本兼治作用；方內川芎、赤芍、白僵蠶及郁金作為臣藥，能增強活血化瘀及祛邪作用；薤白等佐藥理氣散結、寬胸通陽。諸藥合用，能強化痰瘀同治及清潤通絡功效。相關研究顯示，赤芍多糖和川芎多糖均能清除自由基和超氧陰離子；丹參能抵抗大鼠動脈粥樣硬化，增加超氧化物歧化酶表達，減少丙二醛表達[6-7]。

研究結果發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內高指標葡萄糖會通過人體代謝系統(tǒng)分解生成丙酮酸，而丙酮酸一旦通過三羧酸循環(huán)為線粒體呼吸鏈提供過多供氫體，會大幅增加體內生成活性氧[8]?；钚匝踝鳛槿梭w主要細胞中的轉導因子，抑制三磷酸甘油醛脫氫酶活性，誘發(fā)心血管并發(fā)癥。藥理學研究顯示，丹栝方能使高糖培養(yǎng)的內皮細胞中ROS表達顯著降低[9]。本研究結果顯示，丹栝方能明顯減少高糖高脂動脈硬化模型大鼠循環(huán)血液內活性氧表達水平。丹栝方能發(fā)揮調脂和調糖作用，對高糖和高脂釋放的ROS進行抑制，并能對NF-κB的陽性表達、NF-κB mRNA表達進行調控，阻斷氧化應激引起的炎癥反應[10]。本研究表明，模型組大鼠NF-kB陽性表達率、NF-κB mRNA陽性表達率均高于正常對照組、丹栝方組、辛伐他汀組、二甲雙胍組；丹栝方組、辛伐他汀組大鼠的NF-κB mRNA陽性表達率均低于二甲雙胍組；提示丹栝方能有效調節(jié)糖脂代謝，減輕氧化應激，預防糖尿病動脈粥樣硬化。

綜上所述，丹栝方可調節(jié)糖尿病動脈粥樣硬化大鼠的血糖和血脂，減輕氧化應激，改善糖尿病動脈粥樣硬化情況。但因糖尿病和動脈粥樣硬化的連接環(huán)節(jié)較為復雜，涉及抗炎、內皮細胞保護、細胞趨化、抗增殖和細胞黏附等情況，后期需開展深入研究。