農(nóng)桿菌介導轉化黑曲霉條件優(yōu)化及脂肪酶表達

朱思遠 ， 徐 巖 ， 喻曉蔚 *

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.宿遷市江南大學產(chǎn)業(yè)技術研究院，江蘇 宿遷223814）

黑曲霉被美國食品藥品監(jiān)督局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA) 定 義 為 基 本 安 全（Generally Recognized As Safe，GRAS)菌株[1]，在食品工業(yè)中具有良好的應用前景。黑曲霉在工業(yè)酶制劑、有機酸發(fā)酵方面應用廣泛，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥以及基礎生物學研究中具有重要作用[2]。

目前常見的轉化絲狀真菌的方法，包括農(nóng)桿菌介導轉化法、原生質體-PEG轉化法、電轉化法、限制酶介導轉化法、脂質體轉化法、醋酸鋰轉化法、基因槍轉化法[3]等，各有優(yōu)缺點。De Groot等[4]首先將農(nóng)桿菌轉化法應用于絲狀真菌Aspergillus awarmori的轉化，并證明了在原核生物和絲狀真菌之間能夠進行DNA轉移，而且轉化效率比泡盛曲霉常規(guī)的PEG轉化方法提高了600倍。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌。在農(nóng)桿菌轉化中通常采用雙元載體，一個是帶有T-DNA的微型克隆質粒（mini-Ti載體），一個是帶有Vir區(qū)的輔助質粒。根癌農(nóng)桿菌將T-DNA轉移進宿主細胞主要是依賴于輔助質粒上一系列vir基因的表達，而這些vir基因的表達受小分子的酚類和糖類物質的雙重調節(jié)，誘導物乙酰丁香酮 （acetosyringone，AS）和羥基乙酰丁香酮（hydroxyacetosyringone，OH-AS） 在誘導 vir 基因活化過程中起主導作用[5]。一系列毒力蛋白的刺激活化使得在克隆載體上2個邊界的底部鏈重復區(qū)（RBLB)斷開，導致T-DNA的釋放，并且繼續(xù)在其它毒力蛋白的作用下將T-DNA進行運輸轉移，通過農(nóng)桿菌細胞與宿主細胞之間的接觸，將轉移的TDNA靶向細胞整合到基因組中，從而實現(xiàn)基因的插入、靶向替換或者敲除的作用[6]，見圖1。

根癌農(nóng)桿菌介導轉化具有如下優(yōu)點：1）轉化操作簡便，避免了原生質體制備過程中復雜的操作過程及其他方法中的設備要求[5]；2）轉化效率高，并且轉化材料可用范圍廣，已有報道利用農(nóng)桿菌介導轉化可以成功轉化分生孢子、菌絲體、原生質體及子實體[7]；3)轉化子大部分為單拷貝插入，便于進行遺傳分析；4)重組子遺傳穩(wěn)定，同源整合效率高，可用于進行絲狀真菌基因靶向敲除，重復性好，是一種有效的基因靶向工具[8-9]。不同種類的根癌農(nóng)桿菌對于不同物種的侵染效率存在差異，并且不同的轉化條件也會導致轉化效率的不同[10-11]。與細菌及酵母等真菌不同的是，絲狀真菌的轉化中存在較為嚴重的假陽性問題，篩選板上生長的轉化子并不一定為陽性，所以在優(yōu)化條件獲得較多轉化子的同時也需要考慮陽性率。

圖1 克隆質粒通過農(nóng)桿菌介導轉化絲狀真菌原理Fig.1 Cloning plasmids were transformed to filamentous fungi by Agrobacterium mediation

作者利用2種根癌農(nóng)桿菌介導轉化黑曲霉，確定了轉化黑曲霉的最適條件，并且分別構建了組成型啟動子gpdA與誘導型啟動子glaA表達同源黑曲霉脂肪酶的載體，通過農(nóng)桿菌介導轉化黑曲霉，利用羅丹明橄欖油平板初篩[12]，快速確定產(chǎn)酶轉化子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 菌株：黑曲霉CICC2169、CICC2475、CICC2089，農(nóng)桿菌 EHA105、AGL1，大腸桿菌JM109均由作者所在實驗室保藏。

質 粒 ：pCAMBIA1301-gpdA，pCAMPEP，pCAM RCL-glaA由作者所在實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基（1 L） 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。

2）YEB培養(yǎng)基（1 L） 酵母提取物1 g，蛋白胨5 g，牛肉膏 5 g，蔗糖 5 g，MgSO4·7H2O 0.493 g；pH 7.0，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂2 g/dL。

3）PDA培養(yǎng)基 （1 L） 稱取37 gPDA粉末，定容至1 L。

4）IM 誘導培養(yǎng)基 （1 L）[13]K2HPO42.05 g，KH2PO41.45 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.15 g，CaCl20.066 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 48 g，葡萄糖1.8 g，甘油5 mL，蒸餾水定容至940 mL；在121℃條件下濕熱滅菌20 min，待冷卻至50℃時加入 40 mL、1 mol/L 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES），1 mL、200 mmol/L乙酰丁香酮（AS）。在上述配方中補加瓊脂粉15 g為誘導固體培養(yǎng)基（IMA），試管液體配方同上，用前加入MES及AS至所需量。

2-（N-嗎啡啉）乙磺酸母液（MES）（1 mol/L）：用天平稱取 19.52 g 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES），加入80 mL蒸餾水，用KOH溶液（5 mol/L）調節(jié)至 pH 5.3，100 mL容量瓶定容，用0.22 μm濾膜過濾除菌，-20℃保存。

乙酰丁香酮母液 （AS）（200 mmol/L）： 稱取0.196 2 g乙酰丁香酮，用5 mL二甲基亞砜（DMSO）溶解，0.22 μm有機濾膜過濾除菌，-20℃保存

5）羅丹明橄欖油平板（1 L） KCl 0.5 g，K2HPO41 g，NaNO33 g，MgSO40.5 g，葡萄糖 2.5 g，淀粉 2.5 g，麥芽糖2.5 g，橄欖油乳化劑 10 mL，羅丹明母液1 mL（母液 0.01 g/mL）。橄欖油乳化劑為V4%PVA∶V橄欖油=3∶1。

1.1.3 主要試劑 潮霉素hyg、利福平Rif、頭孢噻肟cefo、乙酰丁香酮：購自上海生工公司；Primestar HS、限制性內(nèi)切酶等：購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉潮霉素敏感度測試 利用潮霉素為篩選標記，首先對作者所在實驗室保藏的3株黑曲霉（CICC2169、CICC2475、CICC2089）進行潮霉素抗性敏感度測試。配制PDA平板，分別添加潮霉素hyg 抗性， 使終質量濃度為 100、200、300、400、500μg/mL。將黑曲霉分別點種到不同hyg抗性的平板上。

1.2.2 農(nóng)桿菌轉化條件的確立及優(yōu)化 圖2所示為農(nóng)桿菌轉化的基本流程，初始轉化條件如下：

圖2 農(nóng)桿菌轉化基本流程示意圖Fig.2 Process of Agrobacterium-mediated transformation

1）黑曲霉孢子準備 將黑曲霉在平板上培養(yǎng)5 d，使其充分產(chǎn)孢。利用生理鹽水洗下孢子利用4層擦鏡紙過濾，利用血球計數(shù)板計數(shù)，使孢子濃度在107個/mL備用。

2）農(nóng)桿菌準備與預培養(yǎng) 將質粒通過凍融法轉化[14]農(nóng)桿菌中，含有雙元載體的農(nóng)桿菌，在平板上劃線活化后轉接YEB試管中培養(yǎng)24 h，進行農(nóng)桿菌的預培養(yǎng)，轉接至IM+AS試管中使其OD600在0.2左右，培養(yǎng)至OD600為0.7備用。

3）黑曲霉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng) 將準備好的黑曲霉和農(nóng)桿菌，各取100 μL進行充分混合，均勻涂布于含有玻璃紙的IM+AS平板上。置于22℃下避光共培養(yǎng)36 h，轉膜至初篩培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初篩培養(yǎng)基上添加潮霉素及頭孢噻肟。初篩板生長的轉化子轉接至復篩格子板進行傳代復篩。

對以下條件進行優(yōu)化：共培養(yǎng)材料（萌發(fā)與非萌發(fā)孢子）、兩種農(nóng)桿菌（AGL1與EHA105）的轉化效率進行比較、誘導劑乙酰丁香酮濃度 （0～400 μmol/L）、共培養(yǎng)溫度（17～26 ℃）、農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時的 OD600值（0.5～1.0 以上）、共培養(yǎng)時間（12～72 h）。

1.2.3 脂肪酶表達載體構建 構建黑曲霉脂肪酶ANL表達載體，分別以組成型啟動子甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gpdA）和誘導型啟動子糖化酶基因啟動子（glaA）來啟動脂肪酶基因的表達。首先基于NCBI對于黑曲霉脂肪酶基因進行查找，設計引物P1-P8，以黑曲霉基因組為模板，擴增出包含3段內(nèi)含子的ANL脂肪酶基因序列，后通過重疊延伸PCR去除ANL中的內(nèi)含子序列，將4段ANL拼接，可獲得除去內(nèi)含子的ANL基因。構建過程用到的引物見表1。

1）組成型啟動子gpdA表達載體構建 以pCAMPEP質粒為載體構建組成型表達載體pCAMANL-gpdA，包括將表達基因替換為黑曲霉脂肪酶ANL基因，以及將原有潮霉素基因hyg啟動子CaMV35S替換為gpdA，構建過程見圖3。

表1 引物表Table 1 Primer table

圖3 pCAMANL-gpdA表達載體構建示意圖Fig.3 Construction of pCAMANL-gpdA expression vector

2）誘導型啟動子glaA表達載體構建 以pCAMRCL-glaA質粒為模板構建誘導型表達載體pCAMANL-glaA。將proRCL基因通過ApaI和BglⅡ酶切連接替換為ANL基因，構建流程見圖4。其中pCAMRCL-glaA的啟動子PglaA序列是以黑曲霉2475基因組為模板，擴增PglaA+glaA信號肽序列，并在信號肽后加入kex2酶切位點。

1.2.4 轉化子鑒定 轉化子在初篩生長后轉至復篩格子板復篩，通過復篩生長的轉化子，轉接土豆葡萄糖試管培養(yǎng)生長，提取基因組進行鑒定，黑曲霉基因組提取采用苯酚氯仿抽提法[15]。轉化子基因組利用引物P12、P14和引物P12、P15進行鑒定，確定是否有目標條帶。將轉化子接種羅丹明橄欖油平板，初步確定產(chǎn)酶情況。

圖4 pCAMANL-glaA表達載體構建示意圖Fig.4 ConstructionofpCAMANL-glaA expression vector

2 結果與討論

2.1 黑曲霉的潮霉素抗性敏感度測試

利用潮霉素為篩選標記，首先對實驗室保藏的3株黑曲霉CICC2169、CICC2475和CICC2089進行了潮霉素抗性敏感度測試，結果見表2。CICC2475、CICC2089對于潮霉素有著較高的耐受性，對潮霉素不敏感，會導致篩選困難。CICC2169對于潮霉素有較高的敏感度，野生型菌株在200 μg/mL的條件下不生長，因此選擇黑曲霉CICC2169作為轉化的宿主菌。

表2 3株黑曲霉潮霉素抗性敏感度測試Table 2 Sensitivity of A.niger to hygromycin B

2.2 農(nóng)桿菌轉化黑曲霉的條件優(yōu)化

將質粒pCAMBIA1301-gpdA轉化農(nóng)桿菌，獲得陽性克隆，然后考察陽性農(nóng)桿菌轉化黑曲霉的最適條件。分別對于共培養(yǎng)材料的選擇、EHA105農(nóng)桿菌和AGL1農(nóng)桿菌轉化效率、誘導劑乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌初始OD值、共培養(yǎng)時間進行優(yōu)化，并且從轉化子個數(shù)和陽性率2個方面評估最佳條件。

選擇共培養(yǎng)材料，分別以不萌發(fā)的黑曲霉新鮮孢子和剛萌發(fā)孢子進行比較，結果表明，萌發(fā)孢子進行共培養(yǎng)轉化時，黑曲霉的生長速度明顯快于農(nóng)桿菌，導致后續(xù)篩選中假陽性較高，而以不萌發(fā)孢子為轉化材料時，兩者的生長可基本平衡，獲得的轉化子90%以上均為陽性轉化子，因此后續(xù)實驗以不萌發(fā)的新鮮孢子為共培養(yǎng)材料。許多已報道的文獻是選擇萌發(fā)的黑曲霉孢子進行實驗[16]，萌發(fā)的孢子已破壁生長，原理上更容易被農(nóng)桿菌侵染，但在本研究中效果并不明顯，而且會導致較高的假陽性。

考察兩種農(nóng)桿菌轉化黑曲霉的效率。將農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1301-gpdA和AGL1/pCAMBIA 1301-gpdA向黑曲霉CICC2169轉化。如圖5所示，利用農(nóng)桿菌AGL1獲得的轉化子個數(shù)約是利用農(nóng)桿菌EHA105獲得的轉化子個數(shù)的14倍。所以，選擇農(nóng)桿菌AGL1進行后續(xù)轉化實驗。

優(yōu)化了誘導劑乙酰丁香酮（AS）的濃度，分別為0、100、200、300、400 μmol/L。以 AGL1/pCAMBIA1301-gpdA進行介導轉化，在其他條件相同的情況下，進行培養(yǎng)，結果見圖6。不添加AS時，沒有獲得轉化子，在200 μmol/L和300 μmol/L的條件下轉化率都相對較高，且差異不大，因此選擇200 μmol/L為AS誘導濃度。

圖5 農(nóng)桿菌轉化效率比較Fig.5 Effect of Agrobacterium species on transformation efficiency

圖6 不同濃度AS轉化效率比較Fig.6 Effect of concentration of AS in inducing medium on transformation efficiency

對共培養(yǎng)溫度進行優(yōu)化，在AS濃度為200 μmol/L 的條件下，分別以 17、20、23、26 ℃為溫度梯度進行共培養(yǎng)。以AGL1/pCAMBIA1301-gpdA進行介導轉化，結果見圖7。隨著溫度的升高，轉化子個數(shù)逐漸增多，但是在利用26℃培養(yǎng)時，孢子萌發(fā)速度較快，黑曲霉生長較快，結束共培養(yǎng)時已經(jīng)有大量菌絲生長，產(chǎn)生連片現(xiàn)象，后期生長出的轉化子有較高的假陽性，因此我們選擇23℃作為共培養(yǎng)溫度。

圖7 共培養(yǎng)溫度優(yōu)化Fig.7 Effect of co-culture temperature on transformation efficiency

對于共培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌初始OD600值進行優(yōu)化，以AGL1/pCAMBIA1301-gpdA進行介導轉化，結果見圖8。在AS濃度為200 μmol/L、共培養(yǎng)溫度23℃的條件下，農(nóng)桿菌生長到OD600為0.9～1.0，此時進行共培養(yǎng)所獲得轉化子個數(shù)較多，并且保持較高的陽性率。

圖8 共培養(yǎng)初始農(nóng)桿菌OD600優(yōu)化Fig.8 Effect of Agrobacterium OD600during co-culture on transformation efficiency

對共培養(yǎng)時間進行優(yōu)化，在AS濃度為200 μmol/L，以23℃的共培養(yǎng)溫度，初始農(nóng)桿菌OD600為0.9～1.0 之間，共培養(yǎng)時間設有 12、24、36、48、60、72 h，結果見圖9。12 h沒有獲得轉化子，在24～48 h內(nèi)，隨著時間的增加轉化子個數(shù)逐漸增加，培養(yǎng)60 h和72 h時，共培養(yǎng)結束時已經(jīng)產(chǎn)生較多（60 h）以及滿板（72 h）的菌絲，轉化培養(yǎng)時轉化子個數(shù)不可計，并且陽性率明顯下降，因此選擇48 h為共培養(yǎng)時間。

圖9 共培養(yǎng)時間優(yōu)化Fig.9 Effect of co-culture time on transformation efficiency

實驗結果表明，適合CICC2169的轉化條件為，不萌發(fā)的新鮮孢子與OD600培養(yǎng)至0.9～1.0的農(nóng)桿菌以1∶1的比例混合后，在AS濃度在200 μmol/L的IM平板上，23℃避光培養(yǎng)48 h后進行轉膜。最佳轉化效率為（60±5）個轉化子/106個孢子，并且陽性率保持在90%以上。

2.3 脂肪酶表達載體的構建

以黑曲霉CICC2475基因組為模板，擴增ANL基因1 110 bp，此時基因含有內(nèi)3段含子序列，通過重疊延伸PCR將內(nèi)含子去除，獲得891 bp的片段，結果見圖10。

圖10ANL基因PCR電泳圖Fig.10 ANL gene

按照以上方法進行轉化子構建，構建完成的轉化子利用引物P11，P13進行鑒定。挑選條帶大小正確的轉化子測序，結果正確，黑曲霉脂肪酶基因ANL組成型啟動子pCAMANL-gpdA表達載體和誘導型啟動子pCAMANL-glaA表達載體構建完成。

2.4 陽性轉化子鑒定及轉化子產(chǎn)酶初篩

將構建完成的2種表達載體分別通過凍融法轉化至農(nóng)桿菌AGL1中獲得AGL1/pCAMANL-gpdA和AGL1/pCAMANL-glaA，并利用優(yōu)化后的方法將AGL1/pCAMANL-gpdA和AGL1/pCAMANL-glaA分別轉化黑曲霉CICC2169中，獲得的陽性轉化子分別命名glaA-ANL和gpdA-ANL，初篩平板為 PDA+200 μg/mL hyg+100 μg/mL cefo， 復篩平板為PDA+200 μg/mL hyg，轉化子進行3次傳代后，提取基因組進行轉化子鑒定。glaA-ANL轉化子利用引物P12、P15進行鑒定，條帶大小為2 111 bp為陽性轉化子，gpdA-ANL轉化子利用引物P12、P14進行鑒定，條帶大小為1 615 bp為陽性轉化子，見圖11。

將陽性轉化子轉接至羅丹明橄欖油平板進行產(chǎn)酶初篩。對于黑曲霉脂肪酶ANL轉化子進行羅丹明橄欖油平板鑒定，轉化子大多出現(xiàn)了明顯的水解圈，而對照原始菌并沒有紅色水解圈出現(xiàn)，由于插入位置的不同，導致不同的轉化子可能有不同的產(chǎn)酶水平。其中組成型啟動子gpdA轉化子的水解圈比誘導型啟動子glaA轉化子更加明顯，見圖12。

圖11 轉化子基因組鑒定Fig.11 Identification of transformants

3 結 語

在本研究中，對農(nóng)桿菌介導轉化黑曲霉的共培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，最終確定條件為107個/mL不萌發(fā)的新鮮孢子與OD600培養(yǎng)至0.9～1.0的農(nóng)桿菌以 100 μL∶100 μL 的比例混合后，在 AS 濃度在 200 μmol/L的IM平板上，23℃避光培養(yǎng)48 h后進行轉膜至含有頭孢噻肟的初篩平板，其中頭孢噻肟的作用為殺死農(nóng)桿菌，在共培養(yǎng)結束后及時殺死農(nóng)桿菌，避免由于農(nóng)桿菌過量生長抑制轉化子生長。有報道[17]以硝化纖維膜作為膜材料進行培養(yǎng)效果最好，但是價格較為昂貴，本過程中以較廉價的轉膜材料玻璃紙進行直接轉膜培養(yǎng)，不采用倒置反貼的過程，不僅縮短農(nóng)桿菌轉化時間進程，還減少了轉化子損失。但是宿主菌和農(nóng)桿菌的種類不同，可能會存在不同的轉化效率及陽性率[11]。

在進行脂肪酶的表達初試中，采用羅丹明橄欖油平板對于產(chǎn)酶轉化子進行了初篩，表達的脂肪酶通過水解橄欖油產(chǎn)生脂肪酸，脂肪酸會與羅丹明相互作用而顯色，顏色越深并且水解圈越大，表明脂肪酶表達量越高。轉化黑曲霉脂肪酶ANL基因的陽性克隆在平板上有較明顯的顯色，由于農(nóng)桿菌介導轉化進行基因插入的位置是隨機的，所以可能導致產(chǎn)酶水平存在差異，可以通過轉化子顯色圈的顏色和大小進行較為直觀的活性篩選。對照菌株本身內(nèi)源產(chǎn)少量脂肪酶，但是由于表達量過低，并不顯色及產(chǎn)生水解圈。在黑曲霉中進行基因的表達，可能會受到密碼子偏好性、轉錄水平或翻譯等不同方面的影響，在接下來的工作中，我們將重點提高目標基因的表達量。