食醋釀造過程中條件致腐微生物的分離鑒定及強產(chǎn)氣菌群TYF-LIM-L09的生長特征

李 敏， 李 瑤， 趙 魁， 王 鶴， 何永吉， 范曉軍*

（1.太原理工大學 化學化工學院，山西 太原 030024；2.太原市寧化府益源慶醋業(yè)有限公司，山西 太原 030000；3.山西省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西 太原 030006）

食醋是使用含有淀粉、糖的物料或酒精，經(jīng)微生物發(fā)酵釀造或用食用醋酸調(diào)制而成的酸味調(diào)味品或食品。在亞洲國家，人們偏好使用溫和、有甜味的谷物醋來作為面條和壽司的主要調(diào)味料，而在歐洲和美洲人們喜愛食用以水果為原料生產(chǎn)的果醋[1-2]。食醋的主要成分除了醋酸外，還含有氨基酸、有機酸、糖類、維生素、礦物質(zhì)、醇類、酯類等營養(yǎng)成分和風味成分[3-5]。食醋的營養(yǎng)成分和品質(zhì)與發(fā)酵過程中的微生物代謝密切相關[6-7]。近年來，我國食醋生產(chǎn)企業(yè)在夏季高溫氣候條件下時常出現(xiàn)微生物污染情況，且通常伴隨著成品醋返渾、發(fā)粘、脹氣等腐敗現(xiàn)象[8-11]，嚴重地影響著食醋的營養(yǎng)成分和品質(zhì)。

為了深入了解食醋釀造過程中發(fā)生的高溫條件致腐機制，國內(nèi)一些高校、科研院所和企業(yè)對腐敗醋樣中污染微生物及營養(yǎng)成分進行了初步研究。中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院程池等通過使用PCRDGGE技術(shù)比較了正常醋樣和污染醋樣的微生物群落結(jié)構(gòu)，并在此基礎上對兩種醋樣的微生物進行了分離純化和鑒定，得出了污染菌為耐酸乳桿菌的結(jié)論[12]。此外，武漢輕工大學周幗萍等通過顯微形態(tài)觀察與16S rRNA序列分析從變質(zhì)醋樣中鑒定出了頭狀葡萄球菌和少量解淀粉芽孢桿菌，該課題組通過電子舌測試得出變質(zhì)醋中酸度和咸度略有下降，苦味和鮮回味大幅降低，苦回味和澀回味減少等結(jié)論[13]。2017年曹晉宜等科研工作者對比分析了發(fā)粘食醋和正常食醋的感官指標、理化指標、香氣成分，結(jié)果顯示發(fā)粘食醋中總酸、乳酸、乙醇含量明顯上升，而還原糖、總酯、糠醛含量明顯下降。該研究小組通過傳統(tǒng)培養(yǎng)與16S rDNA序列同源性分析方法，并結(jié)合微生物宏基因組分類測序方法得出了引起食醋發(fā)粘的微生物主要是牛痘乳桿菌的結(jié)論[14]。以上各研究結(jié)論并不一致，也未深入分析分離菌株的耐熱特性及原因，研究結(jié)論仍不能準確地解釋食醋發(fā)酵生產(chǎn)中僅在高溫時節(jié)出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，食醋釀造行業(yè)內(nèi)研究者亦難以從中獲得一致性指導建議。究其原因，腐敗變質(zhì)醋樣本數(shù)量、分離條件及可靠的分析測試平臺的選擇都會影響相關研究結(jié)果。

乳酸桿菌是一類能使糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的益生菌，在人體內(nèi)起著調(diào)節(jié)免疫功能的作用。乳酸桿菌存在廣泛，其最適生長pH為5.5～6.0，但在pH 3.0～4.5的強酸性環(huán)境中仍能生存[15-19]，這與食醋釀造過程中醋酸發(fā)酵階段的酸性環(huán)境pH 3.5～4.5相一致[20]，但是乳酸桿菌對高溫耐受能力相對較弱，能夠耐受43℃以上高溫條件的乳酸桿菌更鮮有報道[21-22]。夏季高溫時節(jié)醋酸釀造過程中醋醅中心最高溫度可達48～50℃[23]，通常狀況下乳酸桿菌并不能耐受這樣的高溫條件[24]，因此對條件致腐分離株的耐高溫特性研究十分必要。此外，食醋釀造腐敗現(xiàn)象不僅發(fā)生在醋酸發(fā)酵階段，高溫條件下酒精發(fā)酵階段也偶有發(fā)生，對篩選菌株的酒精耐受研究亦不容忽視。

在本研究中，課題組從5個不同批次的腐敗醋樣中分離獲得了46株細菌及4個穩(wěn)定菌群，其中編號為TYF-LIM-L09的菌群在多種培養(yǎng)條件下均表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象，因此對其進行了微生物宏基因組分類測序，并分析了該菌群的生長特征、溫度和乙醇耐受、產(chǎn)氣能力及關鍵酶活性特征，以期對食醋釀造高溫條件致腐微生物有更全面、深入的認識。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株 5個不同批次的腐敗醋樣中分離獲得46株細菌及4個菌群；大腸桿菌BL21、地衣芽孢桿菌PWD-1為作者所在實驗室保存菌株。

1.1.2 MRS培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨 10，牛肉粉 8，酵母粉4，葡萄糖20，磷酸二氫鉀2，檸檬酸氫二銨2，無水乙酸鈉5，硫酸鎂 0.58，硫酸錳 0.19，瓊脂 14；吐溫-80 1 mL，115℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑 蛋白胨、酵母粉：英國OXOID公司；牛肉粉、檸檬酸氫二銨、葡萄糖、吐溫-80：北京博奧拓達科技有限公司；乙酸鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、無水乙醇、糠醛：均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；瓊脂粉、氨芐青霉素、溴化乙錠、27F、1492R通用引物、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （Diphosphopyridine nucleotide，NAD+）：生工生物工程 （上海）股份有限公司；Taq DNA聚合酶、10×Taq緩沖液、dNTP、細菌基因組DNA提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；瓊脂糖：美國invitrogen公司；DNA Marker：北京全式金公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒：BIOBASIC公司；丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）測定試劑盒：上海索萊寶生物科技有限公司；CO2氣體檢測管：北京北科綠洲安全環(huán)境科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Alphalmager HP型凝膠成像分析儀：美國proteinsimple公司；Multiskan GO型全波長酶標儀：美國賽默飛世爾公司；Mastercycler pro S型PCR儀：艾本德中國有限公司；BT 124S型電子天平：德國賽多利斯股份公司；PB-10型pH計：德國賽多利斯股份公司；YXQ-LS-30S2型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；DYCZ-24DN型迷你水平電泳：北京市六一儀器廠；JY 92-IIN型超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；DHACA型大容量振蕩器：太倉市實驗設備廠；HC-3018型高速冷凍離心機：安徽中科中桂科學儀器有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 腐敗微生物的分離與鑒定 取10 mL腐敗成品醋離心濃縮至200 μL，涂布至MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48 h至出現(xiàn)肉眼可見的菌落后，挑取單菌落擴大培養(yǎng)并使用基因組提取試劑盒分別提取各分離菌的基因組。用通用引物27F、533R和1492R對單菌落進行16S rDNA擴增，擴增產(chǎn)物進行Sanger測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast同源比對檢索，查找與被測菌種在16S rDNA序列相似性最高的物種。

1.3.2 菌群TYF-LIM-L09的宏基因分類測序分析取1 mL TYF-LIM-L09培養(yǎng)菌液，12 000 r/min離心1 min后，用細菌基因組抽提試劑盒提取沉淀中的細菌總DNA。用通用引物338F和806R擴增細菌基因組16S的V3+V4區(qū)，擴增引物序列參見表1。擴增產(chǎn)物建庫質(zhì)檢合格后，在Miseq高通量測序儀進行PE 300 bp雙端測序。對高通量測序數(shù)據(jù)進行過濾、拼接后，進行OUT聚類分析，挑選相似度大于90%的序列歸為一類OTU，進而對被測樣品中分屬不同OTUs的序列數(shù)進行統(tǒng)計，分析樣品中對應的菌群組成。

表1 細菌16S rDNA PCR擴增引物Table 1 16S rDNA PCR amplification primers of bacteria

1.3.3 菌群TYF-LIM-L09的溫度、乙醇及pH耐受特征 將TYF-LIM-L09菌液以2%的接種體積分數(shù)接種到50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，分別放置于設定溫度為 30、37、40、45、50 ℃，轉(zhuǎn)速為 200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，監(jiān)測各培養(yǎng)物的OD600數(shù)值與培養(yǎng)時間的關系。按照以上接種體積分數(shù)，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下，分別在初始pH 值為6.2±0.2，乙醇體積分數(shù)為 0%、2%、4%、6%、8%、10%的MRS液體培養(yǎng)基以及在不含乙醇，初始pH 值為 5.0、5.5、6.5、7.0、7.5 的 MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)TYF-LIM-L09，分別監(jiān)測各培養(yǎng)物的OD600數(shù)值與培養(yǎng)時間的關系。

1.3.4 菌群TYF-LIM-L09的產(chǎn)氣檢測分析 將菌液以10%的接種體積分數(shù)接種到50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，封口放置于37℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日使用CO2氣體檢測管檢測產(chǎn)氣量，大腸桿菌和地衣芽孢桿菌為對照菌。

按同樣的接種體積分數(shù)分別在乙醇體積分數(shù)為0%、2%、4%、6%、8%、10%的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)TYF-LIM-L09；另外分8個梯度在pH 4.0～7.5的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)強產(chǎn)氣菌TYF-LIML09，封口放置于37℃、200 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，次日使用CO2氣體檢測管檢測產(chǎn)氣量，分析乙醇、pH值對TYF-LIM-L09產(chǎn)氣量的影響。

1.3.5 TYF-LIM-L09的關鍵酶活性測定 粗酶液的處理：待OD600值達到1.2時收集TYF-LIM-L09培養(yǎng)菌液，加入pH 7.4的PBS緩沖液后破碎菌體，離心取上清液獲得粗酶液。

1）丙酮酸激酶酶活測定 用試劑盒測定丙酮酸激酶活力，具體操作方法根據(jù)試劑盒的說明書進行。

2）丙酮酸脫羧酶酶活測定 在200 μL體系中加入pH 6.0、100 mmol/L磷酸緩沖液，1 mol/L丙酮酸鈉溶液，6.4 mmol/L NADH，3.5 μL粗酶液， 在波長340 nm處檢測反應液5 min內(nèi)每分鐘吸光度值的變化。

3）醇脫氫酶酶活測定 在200 μL體系中加入pH 9.0、0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液，0.1 mol/L 糠醛溶液，0.1 mol/L NADH，10 μL 粗酶液，在波長340 nm處檢測反應液5 min內(nèi)每分鐘吸光度值的變化。

酶活單位定義：1酶活單位（1U）等于每分鐘氧化 1 μmol NADH 生成 1 μmol NAD+的酶量。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐敗微生物的分離與鑒定

課題組選取了5個不同批次的腐敗醋樣，編號為 TYF、TYH、TYJ、TYK 和 TYM，相關理化指標見圖1。將從以上腐敗醋樣中分離獲得的50株細菌的16S rDNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中GENBANK做同源比對檢索，得出鑒定結(jié)果，具體見表2。分離獲得的菌株中44株菌來自8個已知屬，分別為魯梅利桿菌屬、腸球菌屬、漫游球菌屬、乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、短波單胞菌屬和類芽孢桿菌屬，另外2株分離菌株尚無已知定義屬。此外，在對分離到的單菌落進行16S rDNA測序分析時發(fā)現(xiàn)，有4個的結(jié)果顯示為套峰，說明這4個單菌落在組成上可能形成了固定群落，因此根據(jù)其主峰僅對其進行了屬歸類。

圖1 正常醋樣與腐敗醋樣的理化指標Fig.1 Physicochemical indicators of normal and spoiled vinegar samples

表2 腐敗樣醋中分離菌株的16S rDNA BLAST序列分析結(jié)果Table 2 BLAST results of 16S rDNA sequences of selected bacteria from spoiled vinegar

續(xù)表2

2.2 菌群TYF-LIM-L09的強產(chǎn)氣現(xiàn)象與宏基因組分類測序分析結(jié)果

在培養(yǎng)TYF-LIM-L09的過程中觀察到了明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象，見圖2，據(jù)此推斷該菌為夏季高溫條件致腐關鍵微生物。但經(jīng)數(shù)次劃線分離培養(yǎng)后其16S rDNA PCR產(chǎn)物測序結(jié)果依舊顯示為套峰，推測其為穩(wěn)定的微生物群落，鑒于此，采用微生物宏基因組分類測序方法對其進行了分析。分析結(jié)果顯示，TYF-LIM-L09確實為共生菌群，其中優(yōu)勢菌集中于厚壁菌門（50.4%）和變型菌門（17.57%），其中乳酸桿菌屬微生物最高達45.77%，見表3。

圖2 TYF-LIM-L09培養(yǎng)過程中的產(chǎn)氣現(xiàn)象Fig.2 Gas production of TYF-LIM-L09 during the cultivation process

表3 菌群TYF-LIM-L09宏基因組分類測序分析Table 3 Metagenomic analysis of bacterial consortium TYF-LIM-L09

2.3 菌群TYF-LIM-L09的溫度、乙醇及pH耐受實驗結(jié)果

在研究溫度與TYF-LIM-L09生長特征關系時發(fā)現(xiàn)，對數(shù)生長期50℃時菌體生長最快，而30℃時培養(yǎng)10 h后菌體才開始快速生長；培養(yǎng)20 h后45℃生長的菌體OD值最大，說明該溫度條件下生物量積累最高，見圖3。TYF-LIM-L09對乙醇的耐受實驗結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中乙醇體積分數(shù)的增高，菌體的生長受到更大程度的抑制。當乙醇體積分數(shù)為2%時，菌體生長與對照組相比無明顯變化；4%和6%時菌體生長速率明顯降低，體積分數(shù)達8%時菌體的最大OD值為0.868，是對照組的46.1%，乙醇體積分數(shù)10%時TYF-LIM-L09無生長現(xiàn)象。綜合該菌對乙醇的耐受特征，其能耐受的乙醇體積分數(shù)可高達8%，具有很好的酒精耐受能力[25]。隨著培養(yǎng)基pH值降低，菌體的生長受到不同程度的影響，其中在pH 5.5的培養(yǎng)基中，菌體在培養(yǎng)8 h后才開始生長，生長速率與pH≥6.0的培養(yǎng)基相比生長緩慢。在pH 5.0的培養(yǎng)基中未檢測到菌體生長，說明該菌能耐受的pH值為5.5。

圖3 在不同溫度、乙醇體積分數(shù)以及pH培養(yǎng)條件下TYF-LIM-L09的生長特征Fig.3 Growth characteristics of TYF-LIM-L09 under different temperatures，alcohol concentrations and pH values

2.4 TYF-LIM-L09的產(chǎn)氣檢測分析

在 37 ℃、pH 6.2±0.2、200 r/min的條件下使用MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)TYF-LIM-L09、大腸桿菌BL21、地衣芽孢桿菌PWD-1，24 h后檢測產(chǎn)氣量。TYF-LIM-L09產(chǎn)氣現(xiàn)象十分突出，經(jīng)檢測產(chǎn)生的氣體為CO2，體積分數(shù)高達71.43%；而大腸桿菌BL21、地衣芽孢桿菌PWD-1產(chǎn)生的CO2體積分數(shù)分別為0.41%和0.50%。

在 pH 6.2±0.2、37 ℃、200 r/min的條件下檢測培養(yǎng)基中乙醇體積分數(shù)對產(chǎn)生CO2的影響，見圖4（a）。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)基中乙醇體積分數(shù)的增加，TYF-LIM-L09的CO2產(chǎn)出量逐漸降低，當乙醇體積分數(shù)為8%或更高時，幾乎沒有CO2產(chǎn)生。圖4（b）顯示了在37℃、200 r/min條件下，培養(yǎng)基初始pH值對TYF-LIM-L09產(chǎn)生CO2的影響。結(jié)果顯示，在pH 4.0～5.0條件下，培養(yǎng)物幾乎沒有CO2產(chǎn)生；pH 5.5～7.5時均有CO2產(chǎn)生并且pH 6.0時的產(chǎn)氣量最大。

2.5 TYF-LIM-L09的糖代謝關鍵酶活性

丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶是葡萄糖代謝途徑中的關鍵酶，與丙酮酸、CO2、乙酸、乙醇的生成密切相關[26]。由于在培養(yǎng)過程中TYF-LIML09表現(xiàn)出了較強的生產(chǎn)CO2的特性，因此使用粗酶液測定了TYF-LIM-L09的糖代謝關鍵酶活性，表4中數(shù)據(jù)從酶學方面驗證了該菌群的糖代謝能力。

3 結(jié)語

課題組從5個不同批次的腐敗醋樣中分離獲得了來源于8個已知屬的44株細菌，2株未知屬的菌株及4個穩(wěn)定菌群。其中，乳酸桿菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬在相關研究中已經(jīng)報道過，而魯梅利桿菌屬、短波單胞菌屬、腸球菌屬、漫游球菌屬和類芽孢桿菌屬均是在本研究中首次分離獲得，說明腐敗醋樣本數(shù)量以及樣本的釀造工藝來源對條件致腐微生物的分離和篩選有著重要的影響。

圖4 TYF-LIM-L09在不同乙醇體積分數(shù)以及不同pH的培養(yǎng)條件下產(chǎn)氣量的變化情況Fig.4 Gas production by TYF-LIM-L09 under different alcohol concentrations and pH values

表4 TYF-LIM-L09粗酶液的丙酮酸激酶、丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶活性Table 4 Activities of pyruvate kinase，pyruvate decarboxylase，alcohol dehydrogenase in the cell-free supernatant of TYF-LIM-L09

本研究就強產(chǎn)氣菌群TYF-LIM-L09的組成結(jié)構(gòu)和生長特征進行了深入研究，首次發(fā)現(xiàn)了導致脹氣的關鍵微生物以穩(wěn)定的群落形式存在，這也從另一方面解釋了前期相關研究中對食醋釀造條件致腐微生物鑒定結(jié)果不一致的問題。課題組在TYF-LIM-L09的分離過程中使用了不同的選擇性培養(yǎng)基，進行了多輪次劃線分離，但單菌落的16S rDNA擴增結(jié)果始終為套峰，所以判斷其為共生菌群，并對TYF-LIM-L09進行了宏基因組分類測序分析，分析結(jié)果也驗證了之前的判斷。TYF-LIM-L09的宏基因組分類測序分析結(jié)果顯示，其由乳酸桿菌屬、假單胞菌屬、短波單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、金黃色葡萄球菌屬等不同種屬的微生物組成，這當中就含有前期研究中報道較多的乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬[27]。分析結(jié)果表明，條件致腐微生物的耐高溫性質(zhì)可能與其組成結(jié)構(gòu)有關，同時也很好地解釋了前期研究中分離獲得的乳酸桿菌與致腐微生物耐高溫特性之間的矛盾。

食醋釀造高溫腐敗現(xiàn)象雖然多發(fā)生在醋酸發(fā)酵階段，但在低濃度酒精發(fā)酵階段也偶有發(fā)生，且腐敗的成品醋多伴隨著拉絲、脹氣等變質(zhì)現(xiàn)象。結(jié)合食醋高溫腐敗現(xiàn)象特征，作者對TYF-LIM-L09的溫度、乙醇、pH耐受及產(chǎn)氣特征做了系統(tǒng)的研究，該菌群表現(xiàn)出了很好的乙醇耐受和產(chǎn)氣能力，研究結(jié)果很好地支持了TYF-LIM-L09為引起食醋腐敗的關鍵微生物。

隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)引起食醋釀造高溫腐敗現(xiàn)象的微生物組成較為復雜，這些不同種群來源的微生物在營養(yǎng)代謝方面相互依賴、互為補充，形成了穩(wěn)定的共生體系。探索研究核心致腐微生物菌群營養(yǎng)代謝特征的有效方法有利于揭示食醋釀造高溫條件致腐現(xiàn)象的本質(zhì)，對解決食醋釀造高溫腐敗問題也有著重要意義。