β-N-乙酰葡萄糖苷內(nèi)切酶Endo S異源表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化

楊 敏， 趙 愷， 濮晶晶， 洪皓飛， 趙鑫銳， 吳志猛

（江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)粒 表達(dá)宿主Escherichia coli

Endo S（EC 3.2.1.96）是一種來(lái)源于化膿鏈球菌的β-N-乙酰葡萄糖苷內(nèi)切酶，屬于糖苷水解酶GH18家族。其主要的生物學(xué)功能是特異性水解免疫球蛋白G（IgG）可結(jié)晶區(qū)（Fc片段）N糖鏈，作用位點(diǎn)為N糖鏈核心五糖中兩個(gè)N-乙酰葡萄糖胺之間的糖苷鍵[1]。由于IgG抗體糖基化修飾影響抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）及補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒作用等一系列免疫反應(yīng)[2-4]，endo S逐步被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于自身免疫疾病治療[5-7]和抗體糖基修飾功能化改造[8-10]。隨著endo S應(yīng)用的增多，對(duì)其需求量也越來(lái)越大，但是目前關(guān)于endo S異源表達(dá)發(fā)酵優(yōu)化研究較少，在一定程度上限制了endo S的應(yīng)用。

2001年，Mattias Collin等第一次利用pET30a載體克隆了完整的endo S基因，并在BL21（DE3）pLys中成功表達(dá)，但是未實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)純化，也未對(duì)其產(chǎn)量進(jìn)行報(bào)道[1]；隨后該課題組又利用載體pGEX表達(dá)了與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶 （GST）標(biāo)簽融合表達(dá)的endo S，純化后并把GST標(biāo)簽切除得到endo S純蛋白質(zhì)，其表達(dá)量未報(bào)道[11]；2012年，Wei Huang等報(bào)道使用上述表達(dá)體系BL21（DE3）-pGEX-GST-endo S在以L(fǎng)B為發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1 mmol/L IPTG、25℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h后蛋白質(zhì)產(chǎn)量為40 mg/L發(fā)酵液[9]。同年，Goodfellow等以pGEX-4T-1為載體，BL21（DE3）為宿主表達(dá)了密碼子優(yōu)化后的GST-endo S，產(chǎn)量大約10 mg/L發(fā)酵液[12]。2013年，Trastoy等人在C端融合霍亂弧菌MARTX毒素半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域 （his6-CPD）的載體pCPD上表達(dá)endo S，宿主同樣為BL21（DE3），通過(guò)鎳柱純化，肌醇六磷酸處理最后得到endo S蛋白，同樣蛋白質(zhì)表達(dá)情況未進(jìn)行報(bào)道[13]。以上關(guān)于endo S表達(dá)的研究多以獲得蛋白質(zhì)為目的，未對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化且已報(bào)道產(chǎn)量不高。

作者構(gòu)建了endo S外源表達(dá)重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-endo S，并在搖瓶水平優(yōu)化重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶條件，使endo S表達(dá)量得到大幅提升。BL21（DE3）：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存提供；質(zhì)粒pET28a：購(gòu)自Novagen有限公司；模板質(zhì)粒pET30aendo S：由上海藥物所黃蔚課題組提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

2）TB培養(yǎng)基 蛋白胨12.0 g，酵母提取物24.0g，甘油4.0 mL，900 mL去離子水溶解后高壓滅菌。冷卻至60℃后，加入100 mL滅菌的含1.7 mol/L KH2PO4和7.2 mol/L K2HPO4的溶液混勻。

3）SOB培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉5.0，蛋白胨20.0，NaCl 0.5，KCl 0.2。

4）2×YT培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉10.0，蛋白胨16.0，NaCl 5.0；pH 7.0。

5）SB培養(yǎng)基（g/L） 酵母粉20.0，蛋白胨30.0，MOPS 10.0；pH 7.0。

1.1.3 引物和主要試劑 Endo S基因和pET28a空載擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。質(zhì)粒提取試劑盒：購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；膠回收試劑盒：購(gòu)自賽默飛世爾科技；T4DNA聚合酶：購(gòu)自大連TaKaRa公司；histag蛋白純化磁珠：購(gòu)自蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司；Nu PAGE預(yù)制膠：購(gòu)自Invitrogen；唾液酸糖肽SGP：自提??；其他試劑：均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 PCR引物Table 1 Primers for endo S and vector cloning

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Endo S基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 以質(zhì)粒pET30a-endo S為模板，用表1中正反向引物通過(guò)PCR擴(kuò)增endo S基因和pET28a載體。首先用T4 DNA聚合酶消化擴(kuò)增得到線(xiàn)性載體及目的基因，按表2所示加入反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度22℃，時(shí)間45 min。反應(yīng)結(jié)束后，在上述體系中迅速加入1 μL dCTP（100 μmol/L）混勻終止反應(yīng)，放置在冰上，加入10 μL退火緩沖液（5×），于PCR儀中退火：75 ℃處理10 min，然后每8秒降低0.1～25℃，退火完成，柱回收。柱回收完成后，限制性?xún)?nèi)切酶DpnI處理回收片段去除模板質(zhì)粒，37 ℃反應(yīng)1 h，轉(zhuǎn)化預(yù)先融化的BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡納抗性平板37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR，最后挑選陽(yáng)性克隆子送至公司測(cè)序，將測(cè)序正確的菌株制成甘油菌-80℃保存。

表2 T4DNA聚合酶處理反應(yīng)體系Table 2 Reaction system ofDNA treated with T4 polymerase

1.2.2 糖苷內(nèi)切酶endo S初步表達(dá) 挑取保藏的重組甘油菌接種至液體LB培養(yǎng)基 （含終質(zhì)量濃度10μg/mL的卡納霉素），37℃、250 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。將上述種子液以4%接種體積分?jǐn)?shù)接入TB發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、250 r/min培養(yǎng)至OD為0.6， 加入終濃度250 μmol/L的IPTG于30℃誘導(dǎo)12 h。發(fā)酵液9 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入10 mmol/L、pH 8.0的 Tris-HCl緩沖液（含500 mmol/L NaCl）重懸菌體，碾磨儀破碎，設(shè)定程序?yàn)椋侯l率60 Hz，工作1 min間隔30 s，8個(gè)循環(huán)。菌體破碎后于4℃、9 000 r/min離心20 min除去菌體碎片，上清液即為粗酶液。蛋白質(zhì)純化步驟參照BeaverBeadsTM組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)純化磁珠使用說(shuō)明書(shū)，蛋白質(zhì)洗脫液利用截留相對(duì)分子質(zhì)量30 000的超濾管（Millipore）進(jìn)行濃縮脫鹽處理。

1.2.3 菌體生物量測(cè)定 采用比色法，將菌液稀釋一定倍數(shù)于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD值。

OD600=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.5 蛋白質(zhì)電泳 12 μL蛋白質(zhì)樣品與4 μL Nu PAGE?LDS Sample Buffer（4×）混合均勻，99 ℃變性10 min。蛋白膠為Nu PAGE預(yù)制膠（分離膠質(zhì)量濃度12 g/dL），電泳緩沖液為pH 7.3的NuPAGE?MES SDS電泳緩沖液，每孔上樣量10 μL，電壓120 V電泳2 h左右。

1.2.6 糖苷內(nèi)切酶活性鑒定 以唾液酸糖肽SGP為底物，反應(yīng)體系見(jiàn)表3。37℃反應(yīng)，HPLC檢測(cè)條件為：DIKMA C18-A反向色譜柱 （250 mm×4.6 mm），柱溫40℃，214 nm檢測(cè)，梯度洗脫條件見(jiàn)表4。

表3 Endo S催化唾液酸糖肽SGP水解反應(yīng)體系Table 3 Reaction system of SGP hydrolysis catalyzed by endo S

表4 梯度洗脫條件Table 4 Gradient elution condition

1.2.7 糖苷內(nèi)切酶endo S表達(dá)優(yōu)化

1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 在1.2.2的基礎(chǔ)上，選用5種培養(yǎng)基作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基，分別為L(zhǎng)B、TB、SB、2×YT和SOB培養(yǎng)基，30℃誘導(dǎo)12 h后，振蕩混勻，測(cè)定菌體濃度，取5 mL發(fā)酵液離心收集菌體，800 μL緩沖液重懸，破壁離心，收集上清液，500 μL純化磁珠結(jié)合目的蛋白質(zhì)，洗滌，最后用150 μL體積10 mmol/L、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液 （含500 mmol/L NaCl和500 mmol/L咪唑）洗脫蛋白質(zhì)測(cè)定表達(dá)量。

2）氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶表達(dá)的影響 去除基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，分別加入與基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氮含量相等的各類(lèi)氮源（蛋白胨工業(yè)級(jí)胰蛋白胨、工業(yè)級(jí)牛肉浸膏、酪蛋白、檸檬酸三銨、氯化銨、硫酸銨、魚(yú)粉蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、尿素）進(jìn)行培養(yǎng)，條件同上。

3）碳源對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶表達(dá)的影響 以上述氮源優(yōu)化不加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照，加入與初始TB發(fā)酵培養(yǎng)基中碳含量相等的各類(lèi)碳源 （糊精、可溶性淀粉、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘油）進(jìn)行培養(yǎng)，條件同上。

4）無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶表達(dá)的影響 以上述碳氮源優(yōu)化后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基設(shè)置對(duì)照組，再分別在上述優(yōu)化培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L的各種無(wú) 機(jī) 鹽 （CaCl2、CuSO4、FeSO4、CoCl2、MnSO4、LiCl、ZnCl2、MgSO4、NiSO4）進(jìn)行培養(yǎng)，條件同上。

5）培養(yǎng)基其余組分的影響 以只含優(yōu)化后氮源的培養(yǎng)基作對(duì)照，分別加入酵母粉、NaCl和甘油，培養(yǎng)條件同上。

6）發(fā)酵溫度和時(shí)間對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶表達(dá)影響以上述最終優(yōu)化培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在1.2.2基礎(chǔ)上， 誘導(dǎo)表達(dá)溫度設(shè)置16、20、26、30、37 ℃共5個(gè)梯度， 分別誘導(dǎo)4、8、12、24、36 h后測(cè)定菌體量和蛋白質(zhì)表達(dá)量。

7）培養(yǎng)基pH對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶表達(dá)的影響 調(diào)節(jié)優(yōu)化后培養(yǎng)基初始pH值為5、6、7、8、9，按照1.2.2所述以及上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定菌體量及蛋白質(zhì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Endo S基因和pET28a載體的克隆

采用特異性引物endo S-F/R、28a-F/R引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，成功克隆出長(zhǎng)度2 900 bp左右endo S基因和5 300 bp左右的線(xiàn)性載體，對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收并測(cè)定回收DNA濃度，回收后片段電泳見(jiàn)圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收電泳圖Fig.1 PCR amplification of DNA

2.2 重組載體的構(gòu)建

通過(guò)不依賴(lài)連接反應(yīng)的克隆方法 （LIC）實(shí)現(xiàn)endo S基因與線(xiàn)性載體重組，在沒(méi)有dNTP存在情況下，利用了T4 DNA聚合酶3’-5’端的外切酶活性以及大腸桿菌的自我修復(fù)機(jī)制，具體見(jiàn)圖2?；蚝洼d體等摩爾數(shù)混合，T4DNA聚合酶從3'-5'端開(kāi)始對(duì)基因和線(xiàn)性載體上的同源片段進(jìn)行消化，退火后載體與基因上的同源臂互補(bǔ)配對(duì)，形成含有缺口的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后在大腸桿菌中得到修復(fù)形成完整環(huán)狀質(zhì)粒。通過(guò)抗性平板篩選和菌落PCR，將擴(kuò)增到與目的基因大小一致條帶的陽(yáng)性克隆送至公司測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與endo S基因序列一致，說(shuō)明endoS基因成功連接至pET28a載體。

圖2 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.2 Construction of recombinant plasmid

2.3 Endo S表達(dá)及純化

重組表達(dá)菌株構(gòu)建完成后，對(duì)endo S進(jìn)行初步誘導(dǎo)表達(dá)。設(shè)置不添加誘導(dǎo)劑IPTG的空白對(duì)照，見(jiàn)圖3。SDS-PAGE分析可以發(fā)現(xiàn)，與endo S大小108 000相吻合的目的條帶，初步表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)量大約為50 mg/L發(fā)酵液。

圖3 重組endo S表達(dá)SDS-PAGE分析圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of endo S expression

2.4 Endo S酶活驗(yàn)證

唾液酸糖肽SGP是一種來(lái)源于雞蛋黃的N糖肽，是endo S天然小分子底物。以SGP為底物驗(yàn)證endo S的糖苷內(nèi)切酶活性，反應(yīng)示意圖見(jiàn)圖4。HPLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程見(jiàn)圖5。反應(yīng)1 h后保留時(shí)間在15.5 min的底物SGP峰1明顯下降，同時(shí)在保留時(shí)間17.2 min出現(xiàn)一個(gè)新峰2，飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）分析該新峰物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為863.286，與SGP糖鏈水解后的產(chǎn)物2理論相對(duì)分子質(zhì)量862.476[M+H]+相符，見(jiàn)圖6，說(shuō)明表達(dá)的endo S具有糖苷內(nèi)切酶活性。

圖4 Endo S催化SGP水解示意圖Fig.4 Reaction scheme of SGP hydrolysis

圖 5SGP水解HPLC監(jiān)測(cè)圖Fig.5 HPLC diagrams of SGP hydrolysis

圖6 產(chǎn)物2 MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.6 MALDI-TOF MS of product 2

2.5 Endo S搖瓶水平表達(dá)優(yōu)化

2.5.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 首先選擇5種基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別為L(zhǎng)B、TB、SB、SOB和2×YT，對(duì)其進(jìn)行篩選，考察對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。不同培養(yǎng)基對(duì)菌體濃度及蛋白質(zhì)表達(dá)有顯著影響，TB培養(yǎng)基最利于菌體生長(zhǎng)，2×YT培養(yǎng)基雖然菌體生長(zhǎng)情況沒(méi)有TB培養(yǎng)基好，蛋白質(zhì)表達(dá)量卻是5種培養(yǎng)基中最高的，考慮到本研究主要目的是對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行優(yōu)化，因此最終選擇2×YT作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

圖7 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選Fig.7 Screening of basal mediums

2.5.2 氮源種類(lèi)優(yōu)化 氮源是微生物主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，是構(gòu)成生命物質(zhì)核酸、蛋白質(zhì)的主要元素。分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氮含量相等的蛋白胨、工業(yè)級(jí)牛肉浸膏、工業(yè)胰蛋白胨、酪蛋白、檸檬酸三銨、氯化銨、魚(yú)粉蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、尿素這十種氮源，菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)情況見(jiàn)圖8?？梢园l(fā)現(xiàn)相比于菌體生長(zhǎng)，氮源種類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)影響更大，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更有利于蛋白質(zhì)表達(dá)，其中牛肉浸膏作為氮源時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)量最高，因此最終選擇牛肉浸膏作為氮源。

圖8 培養(yǎng)基氮源優(yōu)化Fig.8 Optimization of nitrogen sources

2.5.3 碳源種類(lèi)優(yōu)化 碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基必不可少的組成成分之一，為菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)提供碳骨架，微生物細(xì)胞碳含量約占其干重的50%。分別在培養(yǎng)基中添加與初始TB發(fā)酵培養(yǎng)基碳含量相等的糊精、可溶性淀粉、乳糖、半乳糖等一系列碳源，結(jié)果見(jiàn)圖9。當(dāng)以甘油為碳源時(shí)，無(wú)論是菌體生長(zhǎng)情況還是蛋白質(zhì)表達(dá)量，相比其他碳源都具有明顯優(yōu)勢(shì)，可能是由于甘油相對(duì)于其他碳源更利于菌體吸收，因此選擇添加甘油作為碳源。

圖9 培養(yǎng)基碳源優(yōu)化Fig.9 Optimization of carbon sources

2.5.4 無(wú)機(jī)鹽的影響 無(wú)機(jī)鹽在維持菌體生命活動(dòng)中扮演著重要的角色，首先它是構(gòu)成菌體的一般成分，其次它還是一些酶的輔因子，起到調(diào)節(jié)酶活性的作用，另外無(wú)機(jī)鹽還能維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓、調(diào)節(jié)pH值等。考慮到不同目的蛋白表達(dá)對(duì)無(wú)機(jī)鹽的需求不一樣，通過(guò)在培養(yǎng)基中添加終濃度1 mmol/L的 CaCl2、CuSO4、FeSO4、CoCl2、MnSO4、LiCl、ZnCl2、MgSO4、NiSO4這9種無(wú)機(jī)鹽考察其對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。與對(duì)照組相比，這幾種無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)都沒(méi)有促進(jìn)作用，反而存在不同程度的抑制，因此不進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽的添加。

圖10 培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化Fig.10 Optimization of mineral salts

2.5.5 其他組分的影響 以只含優(yōu)化后氮源的培養(yǎng)基作對(duì)照，分別加入其余3種組分酵母粉、甘油和NaCl進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖11。可以發(fā)現(xiàn)酵母粉、NaCl和甘油都有利于蛋白質(zhì)表達(dá)量的提高，對(duì)于菌體生長(zhǎng)，除了NaCl沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，酵母粉和甘油都能有效提高菌體濃度，因此選擇保留上述優(yōu)化培養(yǎng)基中的酵母粉和NaCl，也證明了前面優(yōu)化結(jié)果的可靠性。

圖11 培養(yǎng)基其他組分的影響Fig.11 Effect of other components in the medium

2.5.6 發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期的影響 溫度是影響微生物生長(zhǎng)代謝的最重要因素之一。在一定范圍內(nèi)，溫度升高有利于菌體生長(zhǎng)繁殖，但是一般來(lái)說(shuō)其最適生長(zhǎng)溫度不一定是其生理過(guò)程的最適溫度，比如代謝產(chǎn)物的積累。在大腸桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中，很多情況下提高誘導(dǎo)表達(dá)溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊不充分或錯(cuò)誤折疊而以包涵體的形式出現(xiàn)，適當(dāng)降低誘導(dǎo)溫度、延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間能夠讓蛋白質(zhì)在翻譯后有充分的時(shí)間進(jìn)行正確折疊，減少包涵體的形成。進(jìn)一步考察了誘導(dǎo)溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)以及endo S表達(dá)的影響，見(jiàn)圖12。菌體生長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間在12 h之內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌體濃度整體呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。但是當(dāng)發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，相對(duì)高的發(fā)酵溫度如30℃和37℃，反而不利于菌體積累；對(duì)于蛋白質(zhì)表達(dá)，適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間有利于蛋白質(zhì)的積累，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，表達(dá)的可溶性蛋白質(zhì)反而減少，在20℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)24 h酶表達(dá)量最高，因此選擇該培養(yǎng)條件作為最終發(fā)酵條件。

圖12 誘導(dǎo)溫度和時(shí)間對(duì)酶表達(dá)量和菌體生長(zhǎng)的影響Fig.12 Effectoftemperatureand timeon protein expression and strain growth

2.5.7 發(fā)酵初始pH的影響 為考察培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，將上述優(yōu)化培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，結(jié)果見(jiàn)圖13。 培養(yǎng)基pH值的改變對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不明顯，但是對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)影響較大，在pH 8.0時(shí)菌體蛋白質(zhì)表達(dá)量最高，當(dāng)pH值低于7.0或高于8.0，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)都有明顯抑制，說(shuō)明發(fā)酵培養(yǎng)基過(guò)酸過(guò)堿都不利于endo S的表達(dá)，因此選擇調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值至8.0。

圖13 培養(yǎng)基初始pH的影響Fig.13 Effect of initial pH of cultural medium

2.5.8 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 優(yōu)化前發(fā)酵條件為：TB培養(yǎng)基，30℃誘導(dǎo)12 h，優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成如下（g/L）：酵母粉10.0，甘油4.0，牛肉浸膏25.4，NaCl 5.0；pH 8.0，培養(yǎng)條件為20℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h。分別以?xún)煞N培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵結(jié)束后純化測(cè)定蛋白質(zhì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖14。優(yōu)化后蛋白質(zhì)表達(dá)量為225 mg/L發(fā)酵液，相比優(yōu)化前提高了3.5倍。

圖14 Endo S表達(dá)優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證Fig.14 Optimization results of endo S expression

3 結(jié) 語(yǔ)

從2001年endo S被發(fā)現(xiàn)可以特異性水解IgG上Fc片段N糖鏈，其逐漸被開(kāi)發(fā)作為抗體糖基化功能改造工具酶和自身免疫疾病潛在藥物。但近年關(guān)于endo S的研究多涉及基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面，關(guān)于表達(dá)發(fā)酵優(yōu)化的研究很少，限制了其在抗體藥物改造等方面的應(yīng)用。因此，作者克隆了化膿鏈球菌來(lái)源的endo S基因，構(gòu)建BL21（DE3）-pET28a-endo S重組表達(dá)菌株，并驗(yàn)證表達(dá)蛋白糖苷內(nèi)切酶活性，在搖瓶水平優(yōu)化蛋白質(zhì)表達(dá)，確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分（g/L）：酵母粉10.0，甘油4.0，牛肉浸膏25.4，NaCl 5.0；pH 8.0。最優(yōu)培養(yǎng)條件：20℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h，最終蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)225 mg/L發(fā)酵液，是優(yōu)化前的4.5倍，同時(shí)也是目前報(bào)道最高產(chǎn)量的5.6倍。