調控乙酰CoA合成酶表達促進乙酸利用及GlcNAc合成

馬文龍 ， 劉延峰 ， 呂雪芹 ， 李江華 ， 劉 龍 ， 堵國成 *

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

N-乙酰氨基葡萄糖 （N-acetyl-glucosamine，GlcNAc），又稱為2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖，是一種具有生物活性的氨基單糖。GlcNAc及其衍生物 （氨基葡萄糖，N-乙酰-D-神經氨酸和1，6-脫水N-乙酰胞壁酸）在藥品和保健品領域有著廣泛的應用，比如因其具有消炎和抗腫瘤的作用，與硫酸軟骨素組合使用替代塞來昔布治療關節(jié)炎，可以避免塞來昔布的副作用；作為膳食補充劑，可以增強人的免疫力[1-3]。另外，研究表明GlcNAc作為藥物輔料，由于其溶解性好，安全性高，無副作用，可以作為化學交換飽和轉移磁共振成像對比劑應用于腫瘤診斷[4-5]。而且，利用氨基葡萄糖將金納米顆粒-石墨烯氧化物官能化后，可以降低非特異性毒性，提高抗菌活性，將其作為一種有效的抗菌劑，在制造醫(yī)療器械和廢水處理中具有良好的應用潛力[6-7]。

在之前的研究中，我們通過阻斷重組枯草芽孢桿菌中心碳代謝副產物乙偶姻溢流，得到GlcNAc高產菌株BSGN10，其在3 L發(fā)酵罐中恒pH補料分批發(fā)酵，GlcNAc產量可達48.9 g/L[8]。然而在搖瓶發(fā)酵中，由于乙酸的積累，抑制了細胞生長和GlcNAc合成，限制了后續(xù)菌株改造。解決乙酸溢流的方法有許多，如強化內源乙酰CoA合成酶 （編碼基因acsA）或異源琥珀酰-CoA-乙酸CoA轉移酶（編碼基因aarC）表達，增強細胞同化乙酸的能力，將乙酸轉化為乙酰-CoA，為GlcNAc合成提供乙?；w；雖然該方法可以減弱乙酸毒性，但由于琥珀酰-CoA在反應中轉化為琥珀酸，琥珀酸（pKa=4.21）與乙酸（pKa=4.75）具有相近的解離常數，琥珀酸的積累也會產生毒性[9-10]；而且該方法可能會形成乙酸—乙酰-CoA—乙酸之間的無效循環(huán)，從整體經濟性考慮，這不是解決乙酸溢流的較優(yōu)策略。也可以異源表達異檸檬酸裂解酶（編碼基因aceB）和蘋果酸合酶（編碼基因aceA）構建乙醛酸循環(huán)體，減少乙酸生成，但乙醛酸循環(huán)體與GlcNAc合成途徑競爭前體AcCoA，不利于GlcNAc合成[11]。由于乙酸可以經乙酰輔酶A（Ac-CoA）合成酶AcsA催化生成Ac-CoA，為GlcNAc的合成提供前體，所以為了促進GlcNAc的合成和乙酸的利用，作者對AcsA的表達進行了調控，見圖1。

已有研究表明，全局轉錄調控因子CodY通過結合到acsA 5′UTR區(qū)域阻礙轉錄，抑制酶AcsA的表達[12-17]；而且AcsA翻譯后在K549位點受乙?；揎椂Щ頪18-19]。為了提高酶AcsA的表達量和活性，作者首先對CodY結合位點進行了突變，以解除全局轉錄調控因子CodY對acsA轉錄的抑制；在此基礎上，對AcsA549位的Lys進行定點飽和突變，解除乙酰化修飾。通過以上改造，使得acsA的轉錄水平提高了43%，AcsA胞內比酶活提高到66.7 mU/mg。最終在搖瓶發(fā)酵中乙酸積累量降低至3.6 g/L，相比出發(fā)菌株降低了43%；同時GlcNAc產量提高到5.0 g/L，相比出發(fā)菌株提高了163%。該研究思路與方法為解決枯草芽孢桿菌乙酸溢流提供了借鑒，為進一步提高GlcNAc產量奠定了基礎。

圖1 重組枯草芽孢桿菌中GlcNAc合成途徑及乙酸代謝途徑Fig.1 Synthetic pathway of GlcNAc and metabolism pathway of acetate in Bacillus subtilis

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒 本研究所用的菌株和質粒詳見表1。

1.1.2 主要試劑 Prime STAR （max）DNA聚合酶、PCR產物純化試劑盒、T4 DNA連接酶以及定量PCR試劑盒：購自TaKaRa公司；限制性內切酶EcoR I和DpnI：購自Thermo公司；酵母粉和蛋白胨：購自Oxoid公司；其他常規(guī)試劑：均為國產分析純；引物合成及測序：均由上海生工有限公司完成。實驗中，博來霉素、卡那霉素和氨芐青霉素的添加質量濃度分別為 25、25、100 μg/mL。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH 7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸銨6，葡萄糖60，磷酸氫二鉀15，硫酸鎂3，七水硫酸亞鐵0.06，無水氯化鈣 0.06。

表1 本文所用的菌株及質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒pcreK的構建 pcreK構建過程見圖2。首先以枯草芽孢桿菌168的基因組DNA為模板，以pcrek-L-F和pcrek-L-R為引物，擴增得到creK-L；再將質粒p7Z6用限制性快切酶EcoR I線性化；然后以膠回收后的creK-L為大引物，以EcoR I線性化的質粒p7Z6為模板擴增，將PCR產物直接轉化E.coliJM109，次日用引物pcrek-L-F/pcrek-L-R進行菌落PCR驗證，并挑取條帶大小約2 000 bp的克隆子測序確認[21]。其次，以枯草芽孢桿菌168的基因組DNA為模板，以pcrek-R-F和pcrek-R-R為引物，擴增得到creK-R；然后以膠回收后的creK-R為大引物，直接擴增上述得到的陽性克隆子，PCR產物經 DpnI消化后轉化E.coliJM109，次日用引物pcrek-R-F/pcrek-R-R進行菌落PCR驗證，并挑取條帶大小約850 bp的克隆子測序確認，得到質粒pcreK。所用引物序列見表2。

1.2.2 acsA 5′UTR區(qū)域內CodY結合位點的突變首先，在質粒上對CodY結合位點進行相應突變。以質粒pcreK為模板，選取適當引物，按照Quik Change Site-directed Mutagenesis kit進行定點突變。然后，挑取測序正確的陽性克隆子，以引物對CreKL-F/CreK-L-R擴增后柱回收PCR產物，轉化BSGN10，對基因組上相應位點進行突變。

1.2.3 AcsA K549飽和突變 AcsA K549飽和突變采用兼并引物的方式進行。首先，以pcreK為模板，以K549-F/K549-R為引物，在質粒上對AcsAK549進行飽和突變。然后，挑取測序正確的陽性克隆子，以引物對CreK-L-F/CreK-L-R擴增后柱回收PCR產物，轉化BSGN10，對基因組上相應位點進行突變。

1.2.4 GlcNAc搖瓶發(fā)酵 種子培養(yǎng)：挑取平板上新鮮轉化的單菌落接種到25 mL LB液體培養(yǎng)基（250mL平底三角瓶）中于37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)8～10 h。

圖2 pcreK質粒的構建Fig.2 Construction of plasmid pcreK

搖瓶發(fā)酵：將種子液按接種體積分數5%接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中 （250 mL擋板三角瓶），在37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.5 檢測方法 發(fā)酵液中GlcNAc、乙酸和葡萄糖質量濃度用HPLC檢測[8]；乙酰輔酶A合成酶活性通過檢測反應液中NADH吸光值的變化測定[22]；蛋白質質量濃度用碧云天Bradford試劑盒測定。

表2 本文所用的引物及序列Table 2 Primers used in this study

2 結果與討論

2.1 CodY結合位點突變對acsA轉錄和乙酸積累的影響

全局轉錄調控因子CodY在革蘭氏陽性菌中非常保守，其通過感知胞內GTP和支鏈氨基酸濃度，感知胞外營養(yǎng)物質變化，通過改變對不同結合位點的親和力，改變對不同基因的結合，調控相應基因的表達和胞內碳氮代謝流分配，適應胞外環(huán)境的變化[12，15，17]。 如圖 3（a）所示，在acsA5’UTR 區(qū)域內，CodY結合序列為tATaTTtTaAAAATT（小寫堿基表示與保守序列的差異；CodY結合回文保守序列為AATTTTCWGAAAATT，紅色堿基表示最保守的堿基）[14]。Belitsky B R和Sonenshein A L通過突變保守的A10，解除了CodY對ispA、rapA和rapE的抑制[17]。作者在借鑒Belitsky B R和Sonenshein A L研究的基礎上，對回文序列中A10、A10-A11及對應的T6及T5-T6進行了突變，以減弱CodY的結合，并將t7、a9分別突變?yōu)镃7、G9，以增強CodY的結合，作為對照。

如圖3（b）所示，將保守堿基突變?yōu)槠渌麎A基均不同程度地促進了基因acsA的轉錄。其中，最保守堿基A10突變效果尤其明顯，突變株CodY-5和CodY-6中acsA轉錄水平分別提高了35%和43%，同時乙酸積累量分別降低了15%和23%，為5.5 g/L和 5.2 g/L。雖然 T6、T5-T6 與 A10、A10-A11 在回文序列中處于對應的位置，但是突變后效果并不明顯，CodY-1和CodY-2中acsA轉錄水平僅僅提高了5%和12%，乙酸積累量也僅僅降低了5%和8%，為6.4 g/L和6.2 g/L。同時，將非保守堿基t7、a9分別突變?yōu)楸Ｊ氐腃7、G9后，對acsA轉錄和乙酸利用都沒有明顯的影響?；谝陨戏治?，選擇突變株CodY-6進行下一步的改造。

圖3 CodY結合位點突變對acsA轉錄和乙酸積累的影響Fig.3 Effects of CodY binding sequences mutation on acsA transcription and acetate accumulation

2.2 AcsAK549飽和突變對AcsA酶活和乙酸積累的影響

乙?；c磷酸化類似，調控著生物體內許多重要的生理功能，如受體信號轉導、RNA處置和代謝控制等[23-24]。如圖4（a）所示，枯草芽孢桿菌乙酸利用途徑也受乙酰化調控，該途徑中的關鍵酶AcsA在其Lys549位點被乙酰基轉移酶AcuA乙?；?，導致其活性喪失，利用乙酸的能力降低。雖然在大腸桿菌中已有通過調控AcsA表達促進乙酸利用的報道，但是在枯草芽孢桿菌中很少有相關的報道[22，25]。

為了探究AcuA乙?；瘜σ宜崂玫挠绊懀髡邔ζ湟阴；稽c進行了突變。如圖4（b）所示，將Lys549突變?yōu)槠渌?9種氨基酸雖然可以解除乙酰化修飾，但是由于不同氨基酸其空間位阻或者帶電荷性質的不同，對酶AcsA活性和乙酸利用的影響也不盡相同。將Lys549突變?yōu)閴A性氨基酸Arg或者His，對乙酸利用沒有明顯影響；而將Lys549突變?yōu)樗嵝园被幔ˋsp，Glu）或極性中性氨基酸（Cys，Met，Gln，Asn，Ser，Thr，Trp，Tyr），不利于乙酸利用；當將Lys549突變?yōu)榉菢O性氨基酸Gly和Pro時，明顯促進乙酸利用，乙酸積累量分別減少了25%和19%，為3.6 g/L和4.0 g/L。乙酸積累量的減少，說明通過突變解除乙酰化修飾后，提高了酶AcsA的活性。如圖4所示，將Lys549突變?yōu)镚ly后胞內比酶活為66.7 mU/mg，相比BSGN10-CodY6提高了44%，相比出發(fā)菌株BSGN10提高了76%。

2.3 GlcNAc搖瓶發(fā)酵

雖然以上研究表明，通過促進乙酸利用途徑中AcsA轉錄以及通過解除乙?；揎椏梢蕴岣逜csA的活性，促進乙酸的利用，但是其對細胞生長和產物GlcNAc合成的影響仍然未知。為了考察調控AcsA表達對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產GlcNAc性能的影響，挑選乙酸產量顯著降低的菌株BSGN10-CodY6和BSGN10-CodY6-AcsAK549G進行搖瓶發(fā)酵，與出發(fā)菌株BSGN10進行了比較。

如圖 4（d）所示，發(fā)酵 30 h后，菌株 BSGN10-CodY6和BSGN10-CodY6-AcsAK549G的GlcNAc產量分別為3.2 g/L和5.0 g/L，是出發(fā)菌株BSGN10的1.7和2.6倍；同時菌株BSGN10-CodY6和BSGN10-CodyY-AcsAK549G的生物質積累量（DCW）分別為 3.5 g/L和 5.3 g/L，是出發(fā)菌株BSGN10的1.3和1.9倍。以上結果表明，調控AcsA表達不但可以促進乙酸利用，而且可以提高菌株的發(fā)酵性能。

3 結語

增強枯草芽孢桿菌對乙酸的利用能力，提高其發(fā)酵性能，對于代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產高附加值的生物化學品具有重要的意義。已有研究通過在枯草芽孢桿菌中構建乙醛酸循環(huán)，促進Ac-CoA與乙醛酸縮合生成蘋果酸，通過促進Ac-CoA的消耗，促進乙酸的利用[11]。但是對于GlcNAc的生產而言，由于需要Ac-CoA為GlcNAc提供乙?；?，構建乙醛酸循環(huán)會減少Ac-CoA的供給，不利于GlcNAc的合成。由于Ac-CoA合成酶AcsA以乙酸為底物，催化其轉化為Ac-CoA，可以為GlcNAc提供乙?；?，所以促進酶AcsA的表達不但可以提高菌株利用乙酸的能力，而且可以提高其發(fā)酵產GlcNAc的性能。由于GlcNAc的合成消耗Ac-CoA，可以促進乙酸的利用，為了進一步提高重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵產GlcNAc的能力，后續(xù)研究將通過強化GlcNAc合成途徑中關鍵酶GNA1和GlmS的表達，加強Ac-CoA的消耗，繼續(xù)減少或消除乙酸積累。

圖4 AcsAK549飽和突變對乙酸積累、AcsA酶活和GlcNAc合成的影響Fig.4 Scheme of the AcsA acetylation and its effects on acetate utilization and GlcNAc production