星豹蛛細(xì)胞色素CYP3001U15基因克隆與生物信息學(xué)分析

任彥鴻，王雅麗，趙 瑞，田國強(qiáng)，燕晶晶，李 銳

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

蛛形綱是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，除了少數(shù)蜱螨亞綱等是重要的田間害蟲外，其余多為捕食性蜘蛛，其中，星豹蛛（Pardosa astrigera）屬狼蛛科（Lycosidae）豹蛛屬（Pardosa），在我國廣泛分布，是一種捕食游獵型蜘蛛[1-3]，具有食量大、耐饑餓、習(xí)性兇猛等特點(diǎn)，可以捕食蚜蟲、玉米螟、棉鈴蟲、黏蟲等農(nóng)業(yè)害蟲，是一種重要的田間捕食性天敵優(yōu)勢種[4-5]。

細(xì)胞色素P450酶，又稱為多功能血紅素氧化酶、微粒體氧化酶等，具有上億年的歷史，是一個(gè)由結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因超家族編碼的同工酶所組成的超家族酶系[6-7]，該酶系通過單加氧作用使代謝廢物或外源物失活，在波長450 nm處有最大吸收峰值，其名稱由此而來[8-9]。其對殺蟲劑和環(huán)境有害化學(xué)物質(zhì)等外源物均具有解毒代謝作用，其含量和活性能被有關(guān)藥物或殺蟲劑誘導(dǎo)，從而增加。在昆蟲和蜘蛛等節(jié)肢動(dòng)物的抗藥性研究中，細(xì)胞色素P450是代謝抗性的第一道屏障[10-11]，對蛻皮激素、保幼激素和信息素等內(nèi)源物及合成代謝和殺蟲劑等外源物的解毒代謝具有重要作用[12-13]，是抗藥性的重要生化機(jī)制之一。而目前在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍以噴施化學(xué)殺蟲劑為主要手段，不僅對害蟲產(chǎn)生了“3R”效應(yīng)，也對天敵蜘蛛造成了生存威脅。細(xì)胞色素P450在昆蟲領(lǐng)域已有大量研究，但在天敵蜘蛛方面還未見報(bào)道。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)有害生物生態(tài)防控課題組通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出星豹蛛66條細(xì)胞色素P450基因，進(jìn)一步篩選分析后預(yù)測其中5條基因與殺蟲劑代謝有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選取其中一條基因（在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中編號為Unigene6361），利用RT-PCR技術(shù)克隆得到星豹蛛CYP3001U15基因，并通過生物信息學(xué)方法對該基因序列進(jìn)行分析，以期對星豹蛛細(xì)胞色素P450代謝殺蟲劑等外源次生物質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

星豹蛛（Pardosa astrigera）采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站（37°26′N，111°32′E）。將星豹蛛置于小試管中單頭飼養(yǎng)，并在管內(nèi)放置濕棉球保濕，培養(yǎng)環(huán)境為人工氣候箱（T＝（29±1）℃，RH＝50%±5%，L∶D＝16∶9，上海一恒儀器有限公司），以果蠅（Drosophila melanogaster）作為主要食物，每次飼喂5頭果蠅，每隔1 d投喂一次。

果蠅來自于室外水果誘集，以玉米粉培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方（單份）為：瓊脂1.4 g，白糖10 g，玉米粉14 g，蒸餾水120 mL，丙酸（AR）0.8 mL。

1.2 主要試劑

BIOZOL總RNA提取試劑（杭州博日科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、膠回收純化試劑盒和pGM-Simple-T Fast Cloning試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 星豹蛛總RNA的提取及cDNA的合成 星豹蛛總RNA的提取方法參考BIOZOL試劑說明書進(jìn)行，經(jīng)超微量核酸蛋白測定儀（Scandrop200，德國）檢測；cDNA的合成參考試劑盒說明書進(jìn)行，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CYP3001U15基因克隆 以合成的星豹蛛cDNA為模板，通過設(shè)計(jì)引物F：5′-TCATTCCCTCA GAGATATGG-3′；R：5′-TTGGTGTCACATAAATCA GC-3′，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增星豹蛛CYP3001U15序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，53℃退火30 s，72℃延伸80 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)總體系為25μL，包括cDNA 1μL，引物F 1μL，引物R 1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測并回收純化后連接到pGM-Simple-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布至含有Amp抗性的LB平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜；次日篩選單克隆菌，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證后以50%甘油凍存，交由上海生工進(jìn)行測序。

1.3.3 CYP3001U15基因及其編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析 使用DNAMAN 9.0軟件進(jìn)行序列拼接，用NCBIORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找并翻譯基因開放閱讀框。使用Genedoc進(jìn)行多序列對比；利用ExPasy-ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白基本理化性質(zhì)；使用SingalP 3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig nalP-3.0/）軟件分析蛋白信號肽，使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）工具預(yù)測蛋白跨膜區(qū)；利用Cell-Ploc 2.0軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）軟件預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；使用SWISSMODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）軟件預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)；使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP3001U15基因克隆

提取的星豹蛛總RNA經(jīng)超微量核酸蛋白檢測儀檢測，質(zhì)量濃度為800ng/μL，OD260/OD280值為1.93，可以用于下一步試驗(yàn)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），測序結(jié)果經(jīng)ORF Finder查找發(fā)現(xiàn)，基因CYP3001U15開放閱讀框1 074 bp，編碼357個(gè)氨基酸（圖2）。利用Blast P工具搜索同源序列并用Genedoc軟件進(jìn)行多重比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），星豹蛛CYP3001U15與其他蛛形綱物種的氨基酸序列比對覆蓋率均達(dá)到99%以上，而序列一致性比對發(fā)現(xiàn)，與大腹園蛛（Araneus ventricosus，GBM07777.1）和溫室擬肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum，XP_015904766.1）的序列一致性最高，均為55%；與金絲蛛（Trichonephila clavipes，PRD33972.1）、隆頭蛛（Stegodyphus mimosarum，KFM58273.1）和肩突硬蜱（Ixodes scapularis，XP_029851585.1）物種的序列一致性分別為53%、52%和38%，蛋白序列特征基序如圖3所示。

2.2 CYP3001U15編碼的蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam軟件預(yù)測分析結(jié)果顯示，CYP3001U15編碼357個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)其在大腸桿菌體內(nèi)的半衰期大于10 h，在哺乳動(dòng)物的網(wǎng)狀紅細(xì)胞中和酵母中的半衰期分別為30、20 h；原子總數(shù)為5 808，推導(dǎo)的分子式為C1877H2896N494O531S10，分子質(zhì)量為42 ku，正電荷殘基為47個(gè)，負(fù)電荷殘基為52個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)47.85，為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為85.69，總平均親水系數(shù)為-0.388，說明其親水性較差，脂溶性良好，屬于脂溶性蛋白。編碼的總氨基酸序列中，Leu（異亮氨酸）占比最高，為9.2%；其次為Glu（谷氨酸），占比8.1%；Cys（半胱氨酸）含量最低，為0.8%。

2.3 CYP3001U15跨膜預(yù)測、信號肽和亞細(xì)胞定位分析

使用TMHMM工具進(jìn)行跨膜預(yù)測分析，結(jié)果顯示，CYP3001U15編碼產(chǎn)物不存在跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP3.0軟件預(yù)測CYP3001U15編碼產(chǎn)物的信號肽，結(jié)果顯示，其不存在信號肽；使用Cell-Ploc 2.0軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，其定位在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

2.4 CYP3001U15編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SOPMA工具預(yù)測CYP3001U15編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖4），CYP3001U15編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋占比最多，為47.62%；無規(guī)則卷曲占38.66%；β折疊占8.96%；β轉(zhuǎn)角占比最少，為4.76%。

2.5 CYP3001U15編碼的蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用SWISSMODEL工具在線預(yù)測CYP3001U15編碼產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖5），建模模板為CYP450 3R1（No：3c6g.2.A），在4—356位置建模，序列相似度為37%，模型覆蓋率達(dá)到97%。

2.6 CYP3001U15基因編碼蛋白與其他蛛形綱物種系統(tǒng)發(fā)育樹分析

利用在線BlastP在數(shù)據(jù)庫中尋找與CYP3001U15基因編碼蛋白同源的細(xì)胞色素P450蛋白序列，選取大腹園蛛（Araneus ventricosus）、隆頭蛛（Stegodyphus mimosarum）、溫室擬肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum）、金絲蛛（Trichonephila clavipes）、肩突硬蜱（Ixodes scapularis）、狄斯瓦螨（Varroa destructor）、染色大絨螨（Dinothrombium tinctorium）、梅氏熱厲螨（Tropilaelaps mercedesae）、二斑葉螨（Tetranychus urticae）和桑紅葉螨（Tetranychus cinnabarinus），并使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示（圖6），星豹蛛CYP3001U15基因編碼產(chǎn)物與大腹園蛛（Araneus ventricosus）和溫室擬肥腹蛛（Parasteatoda tepidariorum）聚于同一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近；其次與隆頭蛛（Stegodyphus mimosarum）和金絲蛛（Trichonephila clavipes）親緣關(guān)系較近；與染色大絨螨（Dinothrombium tinctorium）、二斑葉螨（Tetranychus urticae）和 桑 紅 葉 螨（Tetranychus cinnabarinus）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 結(jié)論與討論

本研究利用RT-PCR手段從星豹蛛中克隆獲得一條包含完整開放閱讀框的細(xì)胞色素P450基因，其編碼的氨基酸序列和蛛形綱其他物種都包含有細(xì)胞色素P450典型的“EXXR”（X代表任意密碼子）保守特征基序，該特征基序?qū)儆贙螺旋保守區(qū)，其中，殘基“E”和“R”在所有細(xì)胞色素P450中非常保守，血紅素結(jié)合區(qū)“FXXGXXXCXG”在CYP3001U15基因中為“FSVGKRSCPG”，螺旋I區(qū)的“A/GGXD/ETT/S”保守序列在星豹蛛中保守為“AGSDTVRQS”，該保守序列在不同物種中存在較大差異，如在飛蝗細(xì)胞色素P450中高度保守為“AGFETS”[14]，說明不同物種的細(xì)胞色素P450基因存在差異，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物出現(xiàn)差異性，所以細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的抗藥性出現(xiàn)差異性。CYP3001U15基因經(jīng)國際CYP450命名委員會(huì)命名，確認(rèn)其屬于CYP3家族，該家族是整個(gè)細(xì)胞色素P450酶系最大的一個(gè)家族，對于昆蟲細(xì)胞色素P450而言，CYP6、CYP9、CYP28、CYP300和CYP400（如CYP408、CYP413）等眾多家族成員都屬于CYP3家族[15-17]，其中，哺乳動(dòng)物的CYP3家族有代謝藥物的功能；而昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物的CYP6和CYP9等家族已被證實(shí)與代謝植物次生物和外源物有關(guān)[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)，果蠅抗DDT品系的CYP6A2蛋白含量較敏感品系高，達(dá)40倍[20]。

目前，普遍認(rèn)為細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的抗藥性是通過解毒酶基因的擴(kuò)增和大量表達(dá)導(dǎo)致酶活性的升高[21]，以及多條P450基因共同作用下的結(jié)果，如棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）抗氰戊菊酯品系中發(fā)現(xiàn)一種嵌合體，可以使CYP337B1和CYP337B2相互交換改變，即2條基因作用下導(dǎo)致棉鈴蟲對氰戊菊酯抗性提高[22]。細(xì)胞色素P450是生物體內(nèi)重要的代謝酶類，仍需進(jìn)行有效的多種試驗(yàn)并進(jìn)行技術(shù)手段的創(chuàng)新，更全面地認(rèn)識(shí)細(xì)胞色素P450的功能和作用。

本試驗(yàn)以捕食性天敵蜘蛛星豹蛛為研究對象，通過克隆星豹蛛CYP3001U15基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究結(jié)果對星豹蛛代謝外源物及后續(xù)深入研究該基因星豹蛛體內(nèi)解毒代謝能力提供了一定理論基礎(chǔ)，也對天敵蜘蛛綠色防控策略提供了參考。

志謝：特別感謝David R.Nelson教授為星豹蛛CYP3001U15基因命名。