中華蜜蜂氣味受體AcerOr2基因最佳干擾片段的篩選

郭麗娜，趙慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉鎖

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，山西太谷030801）

蜜蜂的嗅覺系統(tǒng)是需要多種蛋白分子參與的復(fù)雜的化學(xué)信號通訊過程，其嗅覺感知起始于表達(dá)在嗅覺受體神經(jīng)元（OSNs）上的特異性氣味受體（Olfactor Receptor，ORs）識別并區(qū)分周圍環(huán)境（包括群內(nèi)及外界環(huán)境）中的氣味分子，相應(yīng)的氣味分子與其同源的特異性氣味受體ORs結(jié)合激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，打開離子通道，從嗅覺受體神經(jīng)元向大腦發(fā)送電信號，并產(chǎn)生氣味相關(guān)動作電位。昆蟲OR具有與哺乳動物的G蛋白偶聯(lián)受體截然相反的7個跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（即N端位于細(xì)胞內(nèi)，C末端位于細(xì)胞外），與哺乳動物氣味受體之間無同源性[1-3]。在昆蟲體內(nèi)，氣味受體主要位于嗅覺神經(jīng)元樹突上[4-5]，參與嗅覺信號識別的初始過程。每個嗅覺神經(jīng)元表達(dá)2類氣味受體：高度保守的共受體Orco和傳統(tǒng)的氣味受體[6-9]，其中，傳統(tǒng)的氣味受體在不同昆蟲間差異較大，可分為性信息素受體和普通受體[10-12]；而Orco在不同昆蟲間則高度保守[1，3]，不可以識別氣味分子，但能幫助傳統(tǒng)的氣味受體在樹突膜上的折疊和正確定位。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院蜜蜂研究課題組在之前的研究中從中華蜜蜂（Apis cerana cerana）克隆并鑒定出一個共受體基因AcerOr2（GenBank登錄號：JN 792581），并且發(fā)現(xiàn)在工蜂觸角發(fā)育的各個階段AcerOr2都有表達(dá)[13]，與意大利蜜蜂（Apis cerana）共受體AmelOr2有類似的表達(dá)譜[14]，結(jié)果表明，中華蜜蜂共受體AcerOr2可能參與了性別和分工等嗅覺感知過程。蜜蜂的氣味受體在其親屬辨認(rèn)、采集食物、工蜂監(jiān)督和防御等行為上起著重要的作用[15]，但是與果蠅和蚊子等其他昆蟲相比，有關(guān)蜜蜂Ors功能的研究相對較少。

本研究通過構(gòu)建相應(yīng)的AcerOr2干擾質(zhì)粒，并篩選出最佳的干擾序列，旨在為將來通過RNAi進(jìn)一步研究AcerOr2功能的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試蜜蜂 中華蜜蜂（Apis cerana cerana）飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中蜂試驗場。取封蓋子脾放置于人工氣候箱（溫度32℃、相對濕度65%±5%），待出房后將蜜蜂放置于飼喂盒（10 cm×5 cm）中（將培養(yǎng)箱溫度調(diào)整為28℃，濕度不變）。

1.1.2 主要試劑、菌株、質(zhì)粒 TrizolRReagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCRKit和SYBR SYBRRPremix Ex TaqTMIIKit購自TaKaRa公司；JM109、T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒、WizardRSVGel and PCRClean-Up System試劑盒和pGEMRT Easy載體購自Promega公司；Eco R I和Bam H I購自NEB公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自O(shè)mega公司；Plasmid Mini Kit購自康為世紀(jì)公司；TOP10、昆蟲細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自生工生物工程有限公司；辣根過氧化物酶酶標(biāo)羊抗兔β-actin、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光底物等購自Boster公司；AcerOr2多克隆抗體購自北京京成天脈公司。

1.2 方法

1.2.1 AcerOr2基因dsRNA的合成 以NCBI上AcerOr2（JN792581）和GFP（JQ064510.1）基因cDNA編碼區(qū)（ORF）為模板，使用Primer Premier 6.0設(shè)計目的基因AcerOr2的3個不同片段大小的引物和內(nèi)參GFP的1個片段引物（表1），并在引物5′端添加T7啟動子序列（TAATACGACTCACTATAGGG）。以克隆測序后確認(rèn)含有目的基因AcerOr2部分序列的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min）。使用WizardRSV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒（Promega）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，使其滿足體外合成dsRNA的量。根據(jù)T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒操作手冊，使用T7 RNA聚合酶將上述回收的DNA產(chǎn)物體外合成dsRNA，濃度測定后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中華蜜蜂飼喂dsRNA試驗 試驗設(shè)置ds-GFP、dsAcerOr2-1、dsAcerOr2-2、dsAcerOr2-3共4個處理組，每組處理重復(fù)3次。取新出房后饑餓2 d的蜜蜂，每只使用移液槍飼喂10μgdsRNA，后置于恒溫箱（溫度28℃，相對濕度65%）中飼養(yǎng)。每天更換新鮮飼料并采集樣品。

1.2.3 RNA干擾效果檢測

1.2.3.1 qPCR檢測干擾效果 采集飼喂dsRNA后4日齡的蜜蜂液氮速凍，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行qPCR檢測（95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，57℃退火40s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min）。所用引物列于表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.3.2 蛋白質(zhì)印跡檢測干擾效果 采用昆蟲細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，以每孔上樣10μL進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，半干后轉(zhuǎn)至NC膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。一抗AcerOr2（1∶1 000）4℃過夜，二抗驢抗兔IgG室溫溫育2 h，ECL顯色，經(jīng)顯定影處理后，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗，統(tǒng)計方法采用Duncan test（P＜0.05）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 dsRNA模板合成檢測

以中華蜜蜂（Apis cerana cerana）氣味受體AcerOr2（JN792581）和GFP（JQ064510.1）基因全長為模板，克隆得到含有T7啟動子的AcerOr2和GFP基因片段后，測序驗證，結(jié)果顯示（圖1、2），氣味受體AcerOr2的3個大小不同片段的dsRNA合成模板和GFP的1個dsRNA合成模板均已加上T7啟動子（綠色），該產(chǎn)物可以回收用于下一步dsRNA合成。

2.2 體外合成的dsRNA檢測

將合成的大小不同片段的dsRNA經(jīng)濃度檢測結(jié)果顯示，其質(zhì)量濃度均在8～10μg/μL。隨后各取1μL 10倍稀釋后進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，體外合成的中華蜜蜂AcerOr2（4～6）和GFP（7）的dsRNA片段大小與目標(biāo)片段大小一致，可用于后續(xù)的基因沉默。

2.3 最佳干擾片段篩選

用qPCR檢測不同片段的干擾效果，結(jié)果如圖4所示，飼喂3個片段大小不同的dsRNA（dsRNA AcerOr2-1（411 bp）、dsRNA AcerOr2-2（205 bp）、dsRNA AcerOr2-3（471 bp））后對AcerOr2的表達(dá)量干擾效果不一樣，且3個片段dsRNA分別以69.72%±0.49%、47.26%±0.25%、73.17%±0.97%的抑制率抑制AcerOr2的表達(dá)，其中，471 bp的dsRNA AcerOr2-3抑制效率最佳。因此，選擇其進(jìn)行后續(xù)干擾試驗。

用Western Blot進(jìn)一步檢測不同片段干擾效果，結(jié)果如圖5所示，與飼喂dsGFP對照組相比，飼喂 dsRNA AcerOr2-1、dsRNA AcerOr2-1、dsRNA AcerOr2-3后目的蛋白的表達(dá)量均有不同程度降低，其中以dsRNA AcerOr2-3抑制率最佳。綜合上述RNA檢測結(jié)果，合成的dsRNA干擾片段在蛋白和RNA水平均能干擾AcerOr2的表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

RNA干擾是由小的非編碼雙鏈RNA誘發(fā)的真核細(xì)胞中基因沉默的現(xiàn)象，具有高效、快速、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)等特點，是昆蟲嗅覺相關(guān)蛋白功能研究常用的方法[16]。能否順利將外源dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞是誘發(fā)RNAi效應(yīng)成功與否的關(guān)鍵。

將外源dsRNA導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)并誘發(fā)RNAi常用的方法主要有浸泡法、注射法、飼喂法[17-18]。其中，飼喂法是所有方法中操作最簡便且是對昆蟲造成機(jī)械損傷最小的方法，該方法最先是由FIRE發(fā)現(xiàn)，通過飼喂線蟲Caenorhabditis elegans dsRNA可以誘發(fā)RNA干擾效應(yīng)[19]。隨后在蟋蟀（Gryllus bimaculatus）[20]、白蟻（Reticulitermes flavipes）[21]、意大利蜜蜂（Apis melliferads）[22]等多種昆蟲上都通過飼喂法成功干擾相關(guān)基因的表達(dá)。本研究采用飼喂法，并誘發(fā)中華蜜蜂體內(nèi)氣味受體RNA干擾效應(yīng)，可為中華蜜蜂AcerOr2基因功能研究提供理論基礎(chǔ)。

許多研究證明，長鏈dsRNA較短鏈dsRNA在昆蟲中干擾效果更明顯。例如在對果蠅（Drosophila）胚胎的RNA干擾中發(fā)現(xiàn)，長度為300～1 000 bp的dsRNA干擾活性最大，且RNAi效果隨dsRNA鏈的增長而增強(qiáng)[23]。而對于同源性很高的基因，長鏈dsRNA則可能造成非靶標(biāo)基因沉默的現(xiàn)象，這時短鏈dsRNA的干擾效果最好。本研究對中華蜜蜂氣味受體AcerOr2設(shè)計并合成了3個不同大小的dsRNA片段進(jìn)行RNAi，結(jié)果顯示，411 bp的短鏈dsRNA沉默效果最好，說明本試驗所選的基因dsRNA片段大小對RNAi作用效果明顯。

GFP是在水母中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，中華蜜蜂體內(nèi)沒有該蛋白質(zhì)，所以在昆蟲RNAi中常被用作對照，以排除核酸本身對中華蜜蜂的影響；通過比較得出，目的基因表達(dá)量下降確實是由飼喂目的基因dsRNA所引起，而不是由飼喂外源基因dsRNA所引起。

與飼喂dsRNA GFP對照組相比，RNA干擾后中華蜜蜂體內(nèi)AcerOr2蛋白相對表達(dá)量顯著下降，而內(nèi)參β-actin蛋白相對表達(dá)量沒有發(fā)生變化，說明內(nèi)源性目的基因AcerOr2被特異性抑制，并不是由于其他基因的沉默所導(dǎo)致。

本研究結(jié)果表明，通過飼喂中華蜜蜂dsRNA介導(dǎo)RNAi的方法對氣味受體AcerOr2基因在其體內(nèi)的干擾效果進(jìn)行初步檢測，結(jié)果顯示，飼喂dsAcerOr2后能顯著降低中華蜜蜂體內(nèi)Acer Or2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，研究結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步研究中華蜜蜂氣味受體AcerOr2功能打下了基礎(chǔ)。