百香果葉片植株再生快繁技術(shù)

蘇 艷，楊寶明，王麗花，李永平，黃玉玲，李迅東，尹可鎖，張藝萍，楊超振

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（昆明），國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南昆明650205；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南元謀651300）

百香果（Passiflora edulis Sims）又名雞蛋果、西蕃蓮、洋石榴，屬西蕃蓮科西蕃蓮屬的滕本植物，為熱帶亞熱帶多年生植物；果實富含人體所必需的17種氨基酸、多種維生素、類胡蘿卜素和微量元素，營養(yǎng)價值極高；可溶性固形物含量5%～16%，總酸量3.8%～4.0%，甜酸適中，素有“果汁之王”的美譽。其根、莖、葉可入藥，具有消炎、止痛、活血、強身等功效[1-2]。

近年來，隨著百香果的綜合開發(fā)[3-6]和高產(chǎn)栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用[7-11]，其種植面積逐年加大，主要集中種植于廣西、廣東、云南、海南、福建等地[12-16]，市場對種苗的需求也越來越大。目前，種苗的繁殖方式主要有3種：用種子播種繁殖；用滕蔓扦插繁殖；用接穗嫁接繁殖。其中，種子播種繁殖，浪費果實、生長周期長、用工量大；扦插繁殖，需要大量滕蔓、易傳播病害、加快品種退化；嫁接繁殖，種苗質(zhì)量好，但占地面積大、成苗周期長、種苗價格高。3種繁殖方法均存在占地、耗時、周期長、生長成本高等問題，受季節(jié)、環(huán)境、天氣等影響，同時還會加劇病害傳播[17-18]。因此，應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，建立百香果無性快繁體系，是產(chǎn)業(yè)化、規(guī)范化生產(chǎn)百香果優(yōu)質(zhì)種苗最有效的途徑[19-20]。

本試驗以百香果種子無菌實生苗的子葉、真葉以及田間枝條莖尖嫩葉為外植體，開展百香果組培快繁技術(shù)試驗，旨在為百香果組培苗適宜的生產(chǎn)方式提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料于2017年7月采自云南省昆明市石林縣百香果種植園。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選擇 于晴天選擇生長健壯、長勢良好、無病蟲害的紫果百香果實及3～4 cm長莖尖。

1.2.2 外植體滅菌 果實滅菌。將果實放在自來水下沖洗，并用肥皂水刷洗果實表面（注意果實表面不能破損）；清洗干凈后，在無菌工作臺內(nèi)，用75%酒精反復(fù)擦拭果實表皮4～5次，備用。

莖尖的滅菌。剪除莖尖不要的老葉，用自來水反復(fù)沖洗，再用肥皂水清洗，清洗干凈后，在無菌工作臺內(nèi)，先用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%的氯化汞溶液浸泡10 min；然后用無菌水沖洗4～5次，再用無菌濾紙吸干表面水分，備用。

1.2.3 種子無菌實生苗的培養(yǎng) 將經(jīng)無菌處理的果實從中部切開，挑選個大、飽滿的種子直接接種到經(jīng)過滅菌處理的裝有珍珠巖（含水量為80%左右）的培養(yǎng)瓶中，經(jīng)35～40 d培養(yǎng)，即可得到高度為4～5 cm的實生苗。

1.2.4 外植體愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 將經(jīng)無菌培養(yǎng)得到的實生苗按子葉、真葉部位切割；田間莖尖直接將未完全展開的嫩葉切割下來，分別接種到1～8號處理的培養(yǎng)基中，于第35天統(tǒng)計出愈率及不定芽分化情況。每處理接種5瓶，每瓶接種1塊，3次重復(fù)。

1.2.5 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的愈傷組織或芽叢，切割為0.5 cm2左右的小塊，接種到9～14號處理的培養(yǎng)基中，于第25天統(tǒng)計不定芽的分化率及分化情況。每處理接種5瓶，每瓶接種1塊，3次重復(fù)。

1.2.6 腋芽培養(yǎng) 將經(jīng)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的芽或芽叢，分割為含2～3個莖節(jié)的莖段或含2～3個芽的芽叢，接種到15～22號處理的培養(yǎng)基中，于第25天統(tǒng)計芽的分化率及生長情況。每處理接種3瓶，每瓶接種1塊，3次重復(fù)。

1.2.7 生根壯苗培養(yǎng) 將經(jīng)腋芽培養(yǎng)得到的芽，切割為含2～3節(jié)的植株，接種到23～27號處理的生根培養(yǎng)基中，30 d統(tǒng)計生根率及根系生長情況。每處理接種5瓶，每瓶接種5株，3次重復(fù)。

1.2.8 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g/L、瓊脂5 g/L，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照強度為1 600～2 000 lx，光照時間為12 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對百香果外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表1 不同處理對不同葉片愈傷組織誘導(dǎo)分化的影響

由表1可知，無菌實生苗的子葉、真葉經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)均可產(chǎn)生愈傷組織；最容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的部位是子葉，最難誘導(dǎo)的部位是大田莖尖嫩葉；在1～8號處理中，子葉愈傷組織分化早、生長快，接種18 d左右開始分化愈傷組織，出愈率達100%，并在產(chǎn)生愈傷組織的同時還有大量不定芽分化；其次為真葉，最高出愈率為33%；大田莖尖嫩葉沒有愈傷組織分化，接種10 d后葉片逐漸變黃或死亡，這可能與滅菌時間過長有關(guān)。從8個處理的培養(yǎng)基總體培養(yǎng)效果相比來看，以7號處理的培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好、誘導(dǎo)能力最強。因此，MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L為最佳子葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.2 不同處理對叢生芽誘導(dǎo)分化的影響

由表2可知，叢生芽的分化數(shù)與細胞分裂素的種類和濃度直接相關(guān)，6-BA和KT都能誘導(dǎo)叢生芽的產(chǎn)生；從9～14號6個處理的培養(yǎng)效果來看，6-BA的作用效果明顯好于KT，6-BA更適合叢生芽的誘導(dǎo)和增殖，但當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度超過1.0 mgL時，培養(yǎng)物的基部容易產(chǎn)生大量的愈傷組織，影響叢生芽的生長，叢生芽密集，芽叢生長緩慢，不長高，叢生芽的分化數(shù)量反而呈下降趨勢，說明高濃度的6-BA會抑制芽的增殖。因此，MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L為誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基。

表2 不同處理芽叢的分化生長情況

2.3 不同處理對腋芽增殖的影響

將經(jīng)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的芽或芽叢切割為帶2～3個莖節(jié)的莖段或分割為含2～3個芽的芽叢，接種到15～22號處理的培養(yǎng)基中，通過促進腋芽萌發(fā)、生長的方式實現(xiàn)植株的增殖。由表3可知，6-BA和IBA配合使用的效果要好于6-BA和NAA配合，在6-BA質(zhì)量濃度相同時，加入IBA的處理，腋芽萌發(fā)早、數(shù)量多、生長快、長高明顯、植株基部愈傷組織?。患尤隢AA的處理，腋芽萌發(fā)數(shù)量較少、腋芽生長緩慢，不長高，植株基部產(chǎn)生大量愈傷組織，接觸培養(yǎng)基的葉片易發(fā)生卷曲等情況。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、IBA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時，腋芽萌芽數(shù)量達2.86個，高度達4.82 cm，是15～22號8個處理中長勢效果最好的處理。因此，腋芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。

表3 不同處理腋芽的生長情況

2.4 生根壯苗培養(yǎng)

表4 不同處理對百香果根系生長的影響

由表4可知，在培養(yǎng)基中添加NAA或NAA和IBA，都能誘導(dǎo)植株生根，不同處理，根系及植株的生長情況各不相同，存在一定的差異；添加NAA的處理生根相對較快，接種20 d左右開始長出根系，根系粗、短、整齊，但根系脆，基部愈傷組織大；NAA和IBA配合使用的處理，生根相對要慢4～5 d，但根系更長一些、細一些，根系的柔韌性更好一些，基部愈傷組織不明顯；在5個處理中，以24、27號這2個處理效果最好，生根率分別為81.3%和65.3%。因此，生根培養(yǎng)基以MS＋NAA 0.3 mg/L為最佳。

3 結(jié)論與討論

本試驗以百香果種子無菌實生苗的子葉、真葉以及田間莖尖嫩葉為繁殖材料，研究葉片植株再生快繁技術(shù)，結(jié)果表明，百香果種子滅菌容易、徹底、污染率低；莖尖嫩枝，存在滅菌不徹底、培養(yǎng)中污染率高等問題，這與史沉魚等[21-22]的研究結(jié)果一致。實生苗的子葉、真葉經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)都能產(chǎn)生愈傷組織，而子葉是最好的無性繁殖材料，愈傷組織分化早、生長快，愈傷組織誘導(dǎo)率可達100%，并在產(chǎn)生愈傷的同時可直接分化不定芽叢，最佳子葉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.2 mg/L；莖尖嫩葉沒有成功，接種15 d后葉片逐漸變黃或死亡，可能與滅菌的方法和時間過長有關(guān)。在叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，相同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA組合使用的效果明顯好于KT和NAA組合，6-BA和NAA配合使用，叢生芽分化數(shù)量多，芽叢粗壯、整齊，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0～1.5 mg/L時，有利于愈傷組織叢生芽的分化和生長，最佳叢生芽分化培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L。在腋芽的增殖培養(yǎng)中，6-BA和IBA促進腋芽萌發(fā)和生長的效果好于6-BA和NAA[22-23]，加入IBA的處理，腋芽萌發(fā)更早，生長更快，植株基部愈傷組織小，長勢良好，但當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度高于1.0 mg/L時，對腋芽的萌芽和生長有抑制作用，最佳腋芽增殖培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋IBA 0.2 mg/L。MS＋NAA 0.3 mg/L培養(yǎng)基適合生根，為最佳生根壯苗培養(yǎng)基。