亞麻薺CsDGAT3基因的鑒定與表達(dá)分析

高慧玲，張 飛，張宏江，高 宇，劉寶玲，薛金愛，苑麗霞，李潤植

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801；2.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中030600）

亞麻薺（Camelina sativa（L.）Crantz）是十字花科植物中一種古老的油料作物。與其他十字花科植物相比，亞麻薺是一種低投入、易栽培的環(huán)保型經(jīng)濟(jì)作物，而且其具有需肥量低、耐旱性強(qiáng)以及抗斑點(diǎn)落葉病和其他病蟲害能力強(qiáng)等特性，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展要求[1-4]。亞麻薺種子中含油量占干質(zhì)量的37%～45%，其中，大多數(shù)為多不飽和脂肪酸，富含亞麻酸和亞油酸。目前，亞麻薺油已成為國際上推崇的最佳食用油[5-6]；同時(shí)，亞麻薺也被應(yīng)用于食品、飼料和工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域，且在生物燃料和植物油的生產(chǎn)上也具有巨大的農(nóng)藝潛力[7]。隨著亞麻薺油市場需求的大幅增長，通過基因工程和基因組編輯方法提高亞麻薺油產(chǎn)量和質(zhì)量等成為研究熱點(diǎn)[8]，深入了解油脂的生物合成及其生物過程的內(nèi)在分子機(jī)制將為亞麻薺的遺傳改良和高價(jià)值產(chǎn)品的可持續(xù)商業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

植物種子油主要為三酰甘油（Triacylglycerol，TAG），作為能量儲(chǔ)存脂質(zhì)，TAG在植物種子萌發(fā)和幼苗形成過程中提供能量和碳來源[9]；此外，TAG也是食品、飼料、燃料和其他油脂化工中碳分子的主要來源。大量報(bào)道表明，二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）是參與TAG生物合成的最后一步?；磻?yīng)的限速酶[10-13]。目前，已發(fā)現(xiàn)DGAT酶的4種類型：DGAT1、DGAT2、DGAT3和WS/DGAT。其中，DGAT1和DGAT2已經(jīng)在大多數(shù)真核生物中得到廣泛研究。一般認(rèn)為，植物DGAT1在種子油脂的合成與積累中起主要作用[14]；而DGAT2更側(cè)重于積累特殊脂肪酸，如在油桐[15]（Vernicia fordii）、蓖麻[16]（Ricinus communis）和斑鳩菊[10]（Vernonia anthelmintica）中發(fā)現(xiàn)DGAT2可以促進(jìn)特殊脂肪酸的合成，但是二者的作用并不相互排斥。而WS/DGAT和DGAT3是分別從擬南芥[17]和花生[18]中最新鑒定出來的，在植物中的研究還相對比較少。擬南芥WS/DGAT雖可促進(jìn)少量TAG的合成，但其主要催化蠟酯的合成[17]。CsDGAT3蛋白無跨膜區(qū)，為可溶性酶蛋白，最初從發(fā)育中的花生（Arachis hypogaea）子葉中分離并驗(yàn)證[18]。目前，在擬南芥、大豆和亞麻薺等油料作物中發(fā)現(xiàn)了DGAT3的同源序列[11，18-20]，但仍未對其功能進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究采用生物信息學(xué)工具，從亞麻薺全基因組數(shù)據(jù)庫中篩選、鑒定亞麻薺CsDGAT蛋白，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，檢測亞麻薺CsDGAT3基因的表達(dá)譜，以期深入了解植物DGAT3功能的多樣性以及為其在生物技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用的亞麻薺由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所種植、儲(chǔ)藏，所選的材料包括亞麻薺的根、莖、葉、花及種子的不同時(shí)期（早期種子（開花后的4～20 d）、中期種子（開花后的22～30 d）和晚期種子（開花后的32～40 d））。

1.2 CsDGAT3基因的鑒定

由于DGAT3基因的功能已在花生中得到驗(yàn)證，以花生AhDGAT3（AAX62735.1）蛋白序列為檢索序列，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=camelina+sativa）下載獲得亞麻薺基因組gDNA、CDS和蛋白序列，隨后在亞麻薺轉(zhuǎn)錄組中篩選并獲得目的基因。

1.3 亞麻薺CsDGAT蛋白的基本結(jié)構(gòu)分析

利用在線ExPasy網(wǎng)站中ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析亞麻薺CsDGAT3的基本理化性質(zhì)；使用在線Target P 1.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）預(yù)測亞麻薺CsDGAT3蛋白的亞細(xì)胞定位；依據(jù)TMHMMServer v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析CsDGAT3蛋白的跨膜區(qū)；采用保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（Conserved Domain Database，CDD）鑒定CsDGAT3蛋白的保守域；采用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）分析亞麻薺CsDGAT3蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.4 亞麻薺CsDGAT3蛋白的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA 6.06軟件對亞麻薺CsDGAT3和花生AhDGAT3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行Clustal W多序列比對；采用鄰位連接法（NJ）對DGAT3蛋白（表1）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 亞麻薺CsDGAT3的表達(dá)檢測

根據(jù)鑒定結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了3個(gè)CDS序列，分別為CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3，并將其與亞麻薺基因組序列進(jìn)行了比較。

qTR-PCR引物采用Primer 6.0設(shè)計(jì)，內(nèi)參基因Actin引物和定量引物如表2所示。使用RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取RNA。使用cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Genstar公司）合成cDNA。使用2×增強(qiáng)型染料實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液（GenStar公司）進(jìn)行qRT-PCR，以Actin作為內(nèi)參；然后用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)分析。每個(gè)樣品至少進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻薺CsDGAT3基因的鑒定

為了驗(yàn)證CsDGAT3基因在亞麻薺TAG生物合成中的作用，以已經(jīng)鑒定出的花生AhDGAT3氨基酸序列為探針，在亞麻薺基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出3個(gè)具有完整開放閱讀框（ORF）候選CsDGAT3基因，即CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3，且CDS序列都含有TRX-like Fd家族的典型結(jié)構(gòu)域?，F(xiàn)將其重新命名（表3），方便后續(xù)進(jìn)行分析。

表3 亞麻薺CsDGAT3基因的序列信息

2.2 亞麻薺CsDGAT3蛋白的理化性質(zhì)

從表4可以看出，CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3基因編碼的蛋白質(zhì)長度分別為361、364、365個(gè)氨基酸，其理化性質(zhì)與花生AhDGAT3相似；脂肪酸指數(shù)和親水性系數(shù)分析表明，Cs-DGAT3是水溶性蛋白質(zhì)；跨膜區(qū)分析進(jìn)一步顯示，均無跨膜結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，CsDGAT3蛋白最有可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。

表4 亞麻薺CsDGAT3和花生AhDGAT3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

2.3 亞麻薺CsDGAT3蛋白的高級結(jié)構(gòu)分析

通過保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（CDD）對CsDGAT3蛋白的保守功能域分析表明，CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3蛋白均含有TRX-like Fd家族的典型結(jié)構(gòu)域，這類TRX-like-Fd結(jié)構(gòu)域含有4個(gè)參與[2Fe-2S]簇結(jié)合的保守半胱氨酸，在DGAT3家族成員中檢測到該結(jié)構(gòu)域是保守的。以ID1m2b.1為模板對CsDGAT3蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示（圖1），CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3與模板（ID1m2b.1）的相似度分別為25.00%、25.00%和23.68%，且均由2個(gè)亞基組成，并且均勻?qū)ΨQ。

2.4 CsDGAT3蛋白氨基酸多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用MEGA 6.06軟件對亞麻薺CsDGAT3和花生AhDGAT3蛋白的氨基酸序列進(jìn)行Clustal W多序列比對，結(jié)果表明，CsDGAT3-1、CsDGAT3-2、CsDGAT3-3和花生AhDGAT3的序列相似性均為35%，CsDGAT3-1與CsDGAT3-2、CsDGAT3-3序列相似性分別為95%和93%；3個(gè)CsDGAT3與花生AhDGAT3-1的氨基酸序列的進(jìn)一步分析結(jié)果如圖2所示，共鑒定出磷酸化位點(diǎn)（Ⅰ區(qū)）、潛在的DGAT基序（Ⅱ區(qū)）以及假定的硫解酶?；福á髤^(qū)）和酪氨酸激酶磷酸化保守位點(diǎn)（Ⅳ區(qū)）幾個(gè)保守基序。亞麻薺CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3所存在的多個(gè)功能位點(diǎn)可能預(yù)示著其活性受其他因素的調(diào)控或相互作用。

采用鄰接法（NJ）對各物種DGAT3蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，亞麻薺3個(gè)CsDGAT3蛋白均聚在一起，且與薺菜CrDGAT3最接近，并且十字花科家族的DGAT3組成了一個(gè)緊密的群體，包括擬南芥、薺菜、山萮菜屬、油菜，表明亞麻薺CsDGAT3可能與其他十字花科植物具有共同的進(jìn)化祖先。進(jìn)一步說明，從亞麻薺中鑒定出的CsDGAT3基因可能編碼TAG的合成。

2.5 亞麻薺CsDGAT3基因的表達(dá)譜分析

為了探究CsDGAT3基因在亞麻薺種子油脂積累中的作用，對亞麻薺CsDGAT3在根、莖、葉、花以及種子發(fā)育的3個(gè)階段（早、中、晚）和萌發(fā)種子（種子萌發(fā)5 d的幼苗）中的表達(dá)譜進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖4所示，CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3基因在亞麻薺各個(gè)組織中均有表達(dá)，但略有差異，CsDGAT3-1在根中的表達(dá)高于CsDGAT3-2和Cs－DGAT3-3；而CsDGAT3-2在花和萌發(fā)種子中的表達(dá)高于CsDGAT3-1和CsDGAT3-3。進(jìn)一步推測，萌發(fā)種子中CsDGAT3-2的高表達(dá)水平可能與擬南芥AtDGAT3基因一樣。AtDGAT3在種子發(fā)芽過程中利用已合成的TAG來提供能量。CsDGAT3-3在發(fā)育中的種子中表達(dá)水平最高，進(jìn)一步推測，CsDGAT3-3可能在種子油的生物合成中起重要作用。

3 結(jié)論與討論

種子油的含油量和脂肪酸組成是大豆、蕓薹屬和亞麻薺屬等油料作物最重要的2個(gè)農(nóng)藝性狀，為了有效地提高這2個(gè)性狀的遺傳改良效果，迫切需要確定影響種子油生物合成和積累的關(guān)鍵基因。越來越多的研究表明，DGAT在真核生物TAG生物合成的最后一步和限速步驟中起著至關(guān)重要的作用[7，21-23]。與研究充分的DGAT1和DGAT2基因家族成員相比，DGAT3基因僅在幾種植物中被鑒定，但其功能尚未驗(yàn)證[11，18-20]。

本研究通過對比花生AhDGAT3序列，從亞麻薺數(shù)據(jù)庫中鑒定獲得3個(gè)亞麻薺DGAT3蛋白，分別命名為CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3。這與亞麻薺基因組是高度未分化的六倍體基因組相吻合[24-25]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不管是單倍體的綠藻如團(tuán)藻（Volvox carteri）和綠色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus）還是主要的二倍體商業(yè)作物如大豆、玉米和水稻，其基因組中都存在1個(gè)或2個(gè)DGAT3基因[26]。DGAT3家族中不同成員的存在可為行使不同的功能提供可能。

理化性質(zhì)分析表明，CsDGAT3-1、CsDGAT3-2和CsDGAT3-3蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)中，為水溶性蛋白。最早在花生中鑒定出能在細(xì)胞質(zhì)中合成TAG的可溶性DGAT酶[18]，而且擬南芥AtDGAT3蛋白和花生的3種AhDGAT3蛋白均被鑒定為水溶性且定位于細(xì)胞質(zhì)中，這與亞麻薺CsDGAT3蛋白的亞細(xì)胞定位相吻合。此特性使得在基因工程中利用DGAT3來提高油料作物的產(chǎn)油量更加便利。

本研究系統(tǒng)發(fā)育分析表明，亞麻薺DGAT3蛋白與薺菜CrDGAT3蛋白具有高度同源性，這可能與2個(gè)物種同屬于十字花科且遺傳封閉有關(guān)。多序列比對結(jié)果顯示，3種亞麻薺CsDGAT3蛋白均具有典型的DGAT保守區(qū)和一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合位點(diǎn)；此外，還鑒定出了其他的幾個(gè)保守的基序，包括磷酸化位點(diǎn)、假定的硫解酶酰基酶和酪氨酸激酶磷酸化保守位點(diǎn)[21]。這些保守的基序可能參與了DGAT3酶的翻譯后修飾，但這些保守的基序?qū)GAT3活性的重要性仍有待通過定點(diǎn)誘變或其他方法進(jìn)行驗(yàn)證。

通過分析基因的表達(dá)模式可以為基因的功能提供線索。本研究分析了3個(gè)CsDGAT3基因在亞麻薺各種組織中的表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)了這3個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的不同表達(dá)模式?？傮w而言，CsDGAT3-1主要在根中表達(dá)，CsDGAT3-2主要在花和萌發(fā)種子中發(fā)揮作用，表明這2個(gè)CsDGAT3基因在這些組織中的功能可能不同；但是，CsDGAT3-3在發(fā)育中的種子中表達(dá)水平高，這與種子油脂的快速積累相協(xié)調(diào)，表明CsDGAT3-3可能對亞麻薺種子中的TAG合成有較大貢獻(xiàn)。YUAN等[12，20]研究發(fā)現(xiàn)，Cs－DGAT1、CsDGAT2和CsPDAT1家族中基因的3個(gè)拷貝和CsPDAT2家族中的2個(gè)同工型基因在各種組織中都有不同的表達(dá)模式，并且不同的基因參與了亞麻薺幼苗的不同脅迫反應(yīng)?？偠灾?，在這些與TAG裝配相關(guān)的酶基因家族中觀察到的不同拷貝的不同表達(dá)模式可能在這些生物的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，表明存在多個(gè)拷貝，不僅不冗余而且還可增加功能多樣性，進(jìn)一步表明，這可能與真核生物在進(jìn)化的過程中脂質(zhì)代謝途徑復(fù)雜性的增加相吻合。

本研究鑒定獲得了亞麻薺的CsDGAT3基因，并解析了其分子特征和表達(dá)譜；3種CsDGAT3被預(yù)測為可溶性酶蛋白，以含有[2Fe-2S]結(jié)構(gòu)域的同源二聚體形式存在。表達(dá)譜分析表明，3種Cs－DGAT3在不同組織中有不同的表達(dá)模式，表現(xiàn)為CsDGAT3-1在根中高表達(dá)、CsDGAT3-2主要在花和萌發(fā)種子中發(fā)揮作用，CsDGAT3-3在發(fā)育中的種子中高表達(dá)。本研究結(jié)果可為全面解析亞麻薺合成調(diào)控機(jī)制以及后續(xù)應(yīng)用基因工程策略提高亞麻薺油脂的富集等方面提供重要的科學(xué)依據(jù)。