特色油料作物油莎豆CeDGAT1基因的鑒定及表達(dá)分析

高 宇，陳 瑩，孫 巖，王曉清，高慧玲，薛金愛，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

莎草科莎草屬植物油莎豆（Cyperus esculentus）是多年生草本植物（野生型），其栽培種為1年生春播作物。油莎豆分蘗力強(qiáng)，須根發(fā)達(dá)，須根頂端可膨大為圓形或橢圓形的地下塊莖。與馬鈴薯等地下塊莖類作物不同，油莎豆地下塊莖含油量可達(dá)35%（干質(zhì)量）以上，且產(chǎn)量和出油率較高，抗逆性及適應(yīng)性強(qiáng)，管理簡單[1]。油莎豆油營養(yǎng)價值與橄欖油相當(dāng)，其抗氧化性強(qiáng)，且健脾健胃，可預(yù)防心血管病以及高血脂等心血管系統(tǒng)疾病，是優(yōu)質(zhì)的保健食用油[2]。同時，油莎豆塊莖油脂也可作工業(yè)用油和化工產(chǎn)品原料油，其制備高品質(zhì)生物柴油的最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)94.5%以上[3]。因此，研究油莎豆塊莖油脂合成和積累機(jī)制，以及培育高產(chǎn)、高油新種質(zhì)，將有助于這種特色油料作物產(chǎn)業(yè)鏈提質(zhì)增效和可持續(xù)發(fā)展。

三酰甘油酯（TAG）是油料作物油脂的主要儲存形式，主要于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成[4]。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）負(fù)責(zé)使用酰基-CoA底物在1，2-二酰甘油（DAG）的sn-3位置進(jìn)行?；?，生成TAG[5]，該酶促反應(yīng)是TAG合成的限速步驟之一，并且在控制油脂積累量和油脂成分方面發(fā)揮重要作用[6]。迄今，植物中已經(jīng)被鑒定出4種類型的DGAT，即DGAT1、DGAT2、水溶性的DGAT3[7]和雙功能蠟酯合酶WS/DGAT[8]。已有研究表明，大豆（Glycinemax）、蒺藜苜（Medicagotruncatula）、旱金蓮（Tropaeolum majus）等植物的不同組織中都檢測到DGAT1基因的表達(dá)，尤其是種子中的表達(dá)量較高，且表達(dá)量同TAG積累趨勢成正比[9]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過量表達(dá)AtDGAT1，會導(dǎo)致種子千粒質(zhì)量和含油量都明顯增加[10]。在擬南芥的ASII突變體中，DGAT1活性降低，含油量下降超過20%[11]。將DGAT1-2基因轉(zhuǎn)入高油玉米（Zea mays）中，其轉(zhuǎn)基因籽粒含油率提高6.19%[12]。與DGAT1基因相比，DGAT2基因在有特異脂肪酸合成的植物中對TAG合成的作用更大，二者之間可能無功能冗余[13]。DGAT3基因編碼的酶蛋白是無跨膜區(qū)，存在于細(xì)胞質(zhì)的水溶性蛋白，明顯區(qū)別于膜結(jié)合的DGAT1和DGAT2家族，且起源不同、獨立進(jìn)化[14]?，F(xiàn)今，DGAT1基因已經(jīng)在不同的植物中被克隆和研究，包括擬南芥、煙草（Nicotiana tabacum）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）、蓖麻（Ricinus communis）、大豆、油桐樹（Vernicia fordii）等。研究顯示，DGAT1對油脂合成和積累具有重要的貢獻(xiàn)和影響[10，15-17]。在我們建立的油莎豆塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)了一個編碼DGAT1的cDNA（CeDGAT1）序列，可能在塊莖油脂生物合成積累中行使重要功能。

本研究通過生物信息學(xué)分析油莎豆CeDGAT1的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育，以及通過實時熒光定量檢測CeDGAT1在油莎豆塊莖不同發(fā)育時期的表達(dá)譜，進(jìn)而鑒定CeDGAT1在油莎豆塊莖油脂及脂肪酸合成途徑中的功能，旨在為提高油莎豆塊莖油脂產(chǎn)量的遺傳改良和解析油脂合成代謝調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試油莎豆種質(zhì)資源

試驗所需的油莎豆種質(zhì)材料為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所保存的晉農(nóng)1號，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站。油莎豆CeDGAT1的編碼序列來源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。

1.2 油莎豆CeDGAT1編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析

用NCBI中的Conserved Domain Database（CDD）庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Strucdd/cdd.shtml）鑒定CeDGAT1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；通過MEME（http：//meme-suite.org/）預(yù)測CeDGAT1蛋白的Motif；利用Expasy網(wǎng)站提供的Protparam工具分析油莎豆CeDGAT1蛋白的氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、理論等電點和原子組成等理化性質(zhì)；使用一系列在線工具分析CeDGAT1蛋白跨膜區(qū)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、疏水區(qū)域（http：//web.expasy.org/protscale/）和信號肽（http：//www.cbs.dtu.dk/Services/SignalP/）；使用PBIL LYON-GE-RLAND和Phyre 2對CeDGAT1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析；使用Genedoc軟件對油莎豆CeDGAT1和擬南芥AtDGAT1進(jìn)行氨基酸的多序列比對分析；使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對油莎豆CeDGAT1和其他物種的DGAT1蛋白序列（表1）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉檢驗值為1 000個循環(huán)，其余值均為默認(rèn)設(shè)置。

表1 不同植物DGAT1氨基酸序列信息

1.3 油莎豆CeDGAT1基因的表達(dá)檢測

表2 定量PCR引物

采用北京全式金公司的Trans ZolPlant試劑盒提取油莎豆發(fā)育塊莖的總RNA；使用Genstar公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；利用Primer 6.0設(shè)計CeDGAT1序列的qRT-PCR引物，以18SRNA為內(nèi)參基因（表2）。熒光定量采用Takara的反應(yīng)體系：定量正向和反向引物各0.4μL、SYBRRPremix Ex TaqⅡ（2×）5μL、ROX Reference Dye（50×）0.2μL、RNase-free H2O 3μL、cDNA模板1μL。反應(yīng)程序為：95℃10 min；95℃15 s，58℃1 min，40個循環(huán)，5次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油莎豆CeDGAT1蛋白的理化性質(zhì)分析

利用CDD分析油莎豆CeDGAT1蛋白的功能結(jié)構(gòu)，與擬南芥相比，油莎豆CeDGAT1蛋白與擬南芥AtDGAT1蛋白都屬于MBOAT超家族，但是CeDGAT1沒有PLN02401功能區(qū)域（圖1）；Motif預(yù)測結(jié)果顯示，CeDGAT1與AtDGAT1結(jié)構(gòu)相似，都包括4個相同的Motif（圖2）。對油莎豆CeDGAT1蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析和鑒定，結(jié)果顯示（表3），CeDGAT1編碼502個氨基酸，分子質(zhì)量為57.68ku，預(yù)測理論等電點為9.23；預(yù)測的不穩(wěn)定系數(shù)為53.33，為不穩(wěn)定蛋白；該蛋白包括8個跨膜結(jié)構(gòu)域；脂肪族系數(shù)和親水系數(shù)表明，該蛋白為疏水性蛋白。CeDGAT1編碼的氨基酸數(shù)較AtDGAT1少，但是二者都是疏水性的跨膜蛋白。

表3 油莎豆CeDGAT1和擬南芥AtDGAT1蛋白的理化性質(zhì)分析

2.2 油莎豆CeDGAT1蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

油莎豆CeDGAT1蛋白是由α-螺旋、延伸鏈、β-折疊、無規(guī)則卷曲組成（圖3），其中，α-螺旋占比最高，為46.06%；其次是無規(guī)則卷曲，占比為35.43%；延伸鏈占比為12.40%；β折疊占比最低，為6.10%，與擬南芥AtDGAT1中二級結(jié)構(gòu)元件組成相同、結(jié)構(gòu)相似。通過Phyre 2在線軟件對At-DGAT1和CeDGAT1進(jìn)行同源建模，預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖4），以c6buhH一種膜蛋白為模板，AtDGAT1和CeDGAT1蛋白與模板的相似性都為58%，二者的三級結(jié)構(gòu)極其相似。

2.3 油莎豆CeDGAT1蛋白的序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用Genedoc對油莎豆CeDGAT1和擬南芥AtDGAT1的序列比對結(jié)果顯示（圖5），CeDGAT1和AtDGAT1的序列相似性為61%；對比其他DGAT1蛋白的保守序列，CeDGAT1的氨基酸序列中包含有預(yù)測的DGAT保守序列：?；?CoA結(jié)合位點、催化活性位點、磷酸泛素結(jié)合位點等；在其預(yù)測的巰基輔酶位點的序列中包含一個保守的脯氨酸，脯氨酸被認(rèn)為參與脂肪酸?；鶊F(tuán)的傳遞[18]；預(yù)測的脂肪酸結(jié)合蛋白位點包括一個酪氨酸磷酸化位點；預(yù)測的DAG/佛波酯結(jié)合序列包含一個保守的苯丙氨酸位點。油莎豆CeDGAT1存在多個功能位點，預(yù)示其可能具有DGAT酶活性。

CeDGAT1與一些已知的DGAT1序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示（圖6），CeDGAT1與單子葉植物高粱SbDGAT1和野生水稻ObDGAT1的親緣關(guān)系比較近；而與擬南芥、蓖麻、花生、大豆的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分別分布于2個分支中。

2.4 油莎豆CeDGAT1在油莎豆不同發(fā)育時期塊莖中的表達(dá)分析

為了檢測油莎豆CeDGAT1在塊莖發(fā)育過程中的表達(dá)情況，通過熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測CeDGAT1在塊莖不同發(fā)育時期的表達(dá)，并以18SRNA為內(nèi)參基因，計算不同發(fā)育時期的表達(dá)情況，結(jié)果顯示（圖7），CeDGAT1在塊莖發(fā)育的不同時期均可表達(dá)，相對表達(dá)量先上升后下降，且在塊莖播種90 d時的表達(dá)量最高，此階段也是塊莖油脂快速富集的時期。

3 結(jié)論與討論

為確保糧油安全和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展，特別是為解決由于植物油用于制備生物柴油而對全球糧食安全的威脅，開發(fā)產(chǎn)油量高的新型植物油脂資源和進(jìn)一步提高現(xiàn)有油料作物的產(chǎn)量，為近幾年研究的一個熱點領(lǐng)域。地下營養(yǎng)器官塊莖富油的油莎豆，產(chǎn)量也高于現(xiàn)有商業(yè)化的大田油料作物，其成為人們聚焦研究的一個新型特色油料作物。DGAT在油脂合成中具有重要作用，使得其成為人們研究的重點。油莎豆自20世紀(jì)被我國引進(jìn)以后，大部分研究偏向油脂提取工藝對油品質(zhì)的影響、生物柴油制備、組分分析、栽培技術(shù)等方面，關(guān)于油莎豆油脂代謝機(jī)制以及提高油脂含量代謝工程的研究日漸備受重視[19-20]。

本研究對油莎豆的CeDGAT1基因功能進(jìn)行了逐步鑒定，結(jié)果顯示，油莎豆CeDAGT1基因編碼502個氨基酸，是不穩(wěn)定的疏水性蛋白，有8個跨膜結(jié)構(gòu)，是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合的跨膜蛋白。功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，油莎豆CeDGAT1蛋白屬于MBOAT超家族，其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)顯示出與擬南芥AtDGAT1極大的相似性。多序列比對結(jié)果顯示，CeDAGT1的氨基酸序列包含DGAT典型的保守區(qū)、?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合位點和催化活性位點，其中，DAG/佛波酯結(jié)合位點是DGAT特有的[21]。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，油莎豆CeDGAT1與單子葉植物高粱、野生水稻親緣關(guān)系較近，推測CeDGAT1具有DGAT酶活性。

油莎豆CeDGAT1基因在塊莖發(fā)育的所有時期均有表達(dá)，在塊莖播種90 d時表達(dá)量達(dá)到最高，表達(dá)趨勢呈單峰曲線?，F(xiàn)在已經(jīng)報道的不同植物的DGAT1，有不同的組織和時空特異性表達(dá)水平?；ㄉ鶤hDGAT1-1在花和種子中的表達(dá)水平高于其他組織，而AhDGAT1-2在根、種子和子葉中顯示出了更高的表達(dá)水平[22]。擬南芥AtDAGT1基因在大部分的組織中都有表達(dá)，但在發(fā)育中的胚胎和花瓣中表達(dá)量最高[23]；紫蘇PfDGAT1在不同組織中均有表達(dá)，且在種子中表達(dá)量最高[24]。據(jù)報道，在煙草和酵母中過量表達(dá)擬南芥AtDAGT1基因大大提高了轉(zhuǎn)化品系的TAG含量[10，25]。在蓖麻中，RcDGAT1在葉片和發(fā)育中的種子之間幾乎沒有差異，并且RcDGAT1在10 DAP（授粉天數(shù)）的表達(dá)最高[26]。在斑鳩菊中，VgDGAT1的表達(dá)水平在胚中遠(yuǎn)高于根、莖、葉和果皮。在種子發(fā)育期間，VgDGAT1表達(dá)水平從早期（10～17 DAP）緩慢增加，然后在24 DAP時急劇上升到最大值，隨后VgDGAT1表達(dá)量逐漸下降[27]。油莎豆發(fā)育中塊莖的油脂含量增加分為含油量低、增加緩慢的早期以及油脂快熟積累的中期和含油量高增長速度逐漸平緩的后期[28]，這種增長趨勢與CeDAGT1的表達(dá)模式相似，因而推測，CeDGAT1在油莎豆塊莖油脂積累中具有重要的作用。

通過對油莎豆塊莖油脂中關(guān)鍵基因的發(fā)掘和驗證，對于解析營養(yǎng)器官大量積累油脂的機(jī)制具有重要的作用。本研究結(jié)果可為后期試驗中利用分子育種和基因工程等手段改良油莎豆品質(zhì)以及提高油莎豆油含量和油產(chǎn)量提供重要理論依據(jù)，也將為油莎豆分子育種提供新思路。