沙棘酵素發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物及抗氧化活性研究

張浩然,范昊安,顧逸菲,王珍珍,沙如意,*,毛建衛(wèi),4,*

(1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023;2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室,浙江杭州 310023;3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023;4.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江紹興 312006)

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)是一種落葉性灌木[1],具有耐旱、抗風(fēng)沙、可以在鹽堿化土地上生存的特性,因此被廣泛用于水土保持,特別是在中國西北部地區(qū),由于沙漠綠化的需要,種植有大量沙棘[2-3]。沙棘為藥食同源植物,其果實含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì),包括人體所需要的各種氨基酸、脂肪酸、維生素、亞油酸、超氧化物歧化酶等活性物質(zhì),以及異鼠李素、槲皮素等7種黃酮類物質(zhì)和多種微量元素,具有增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、保護(hù)肝臟、保護(hù)胃腸道、加快細(xì)胞的造血、抗輻射、抗突變、抗腫瘤等作用[4-8]。

沙棘在食品、醫(yī)藥、輕工、農(nóng)牧漁業(yè)等國民經(jīng)濟(jì)的許多領(lǐng)域都有很好的應(yīng)用前景[2,9]。市面上比較流行的沙棘產(chǎn)品有沙棘果汁、沙棘茶、沙棘鈣片、沙棘膠囊、沙棘果油、沙棘籽油等[3]。沙棘的一個新的研究方向是通過發(fā)酵來制備沙棘酵素,目前,關(guān)于沙棘酵素的研究較少。食用植物酵素(Edible plant source Jiaosu)是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、藥食兩用本草類等為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過較長時間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物、植物本身營養(yǎng)成分和益生菌等功能成分,特別是富有小分子功能成分,研究表明該類產(chǎn)品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能[10-13]。開發(fā)沙棘酵素,加強(qiáng)對于沙棘酵素的研究有利于促進(jìn)沙棘產(chǎn)業(yè)向深層次發(fā)展。

本文以野生沙棘果實為原料,研究沙棘酵素在發(fā)酵過程中總糖、總酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、醋酸、總酚等活性成分含量、抗氧化活性(羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力)變化以及微生物菌落總數(shù)變化規(guī)律,同時利用相關(guān)性分析和主成分分析對各評價指標(biāo)進(jìn)行分析,為沙棘的綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生沙棘果實 采自山西呂梁山,2018年2月采樣;低聚異麥芽糖 由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室提供;雙氧水(H2O2)、福林酚(10%)、鐵氰化鉀、三氯化鐵、蒽酮、甲醇、碳酸鈣、氯化鈉(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇、抗壞血酸(VC)、三氯乙酸、2,2-聯(lián)氮基-雙-二胺鹽(ABTS)(分析純)、磷酸二氫鉀(HPLC級) 上海阿拉丁試劑有限公司;甲醇 HPLC級,美國天地有限公司;葡萄糖、胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂 杭州百思生物科技有限公司;草酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品 國家食品藥品檢測中心;酒石酸 Sigma公司;抗壞血酸、莽草酸、沒食子酸、醋酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

PTX-FA210型電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司;Allegra X-12R離心機(jī) 貝克曼庫爾特有限公司;PHS-3C型精密酸度計 杭州齊威儀器有限公司;KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UV-5500PC型紫外分光光度計 上海市元析儀器有限公司;XMTD-204型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 常州諾基儀器有限公司;Waters e2695型高效液相色譜(配備Waters 2998二極管陣列紫外檢測器) Waters公司;MB-150CL型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 青島明博環(huán)保科技有限公司;20L不銹鋼發(fā)酵罐 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室研制。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 PCA培養(yǎng)基:酵母粉2.5 g,蛋白胨5 g,葡萄糖1 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃濕熱滅菌15 min。

YEPD培養(yǎng)基:酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃濕熱滅菌15 min。

GYCA培養(yǎng)基:酵母粉5 g,蛋白胨3 g,葡萄糖30 g,碳酸鈣10 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃濕熱滅菌15 min。

1.2.2 沙棘酵素的制備 取滅菌、冷卻后的無菌水輕輕沖洗沙棘表面,自然瀝干、打漿,按沙棘∶低聚異麥芽糖∶水的質(zhì)量比3∶3∶1,加入滅菌過的發(fā)酵罐,密閉、室溫發(fā)酵,每隔10 d取一定量發(fā)酵液,8000 r/min條件下離心10 min,保留上層清液備用。

1.2.3 總酚含量測定 采用福林酚法[14]測定樣品中總酚含量。取30 μL沙棘酵素離心上清液,加水至0.5 mL,加入10%福林酚溶液(v/v)2.5 mL,常溫靜置反應(yīng)3 min,加入7.5% Na2CO3溶液(w/v)2 mL,混勻,于25 ℃反應(yīng)1 h,以去離子水為空白,在765 nm下測定吸光度。并以沒食子酸為標(biāo)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 pH測定 參照GB 10468-1989《水果和蔬菜產(chǎn)品pH的測定方法》[15],使用精密pH計測定樣品pH。

1.2.5 總酸含量測定 參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定方法》[16],取樣品0.5 mL,加水定容至50 mL,取10 mL稀釋液于錐形瓶中,以1%酚酞試劑為指示劑,記錄消耗0.01 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定體積,計算總酸含量(以蘋果酸計)。

1.2.6 有機(jī)酸種類及含量測定 樣品配制:用流動相將樣品稀釋5倍,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,采用HPLC檢測有機(jī)酸含量。

混合標(biāo)準(zhǔn)品配制:配制草酸、L-酒石酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、沒食子酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其質(zhì)量濃度分別為0.1、0.1、0.5、0.01、0.1、1、1、0.01、1、0.01、1、0.01 mg/mL。

色譜條件:色譜柱為Atiantis? T3 C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇:磷酸二氫鉀緩沖液(pH2.7)=2∶98 (v/v);流速為1.0 mL/min;柱溫為20 ℃;檢測波長為210 nm；檢測器:二極管陣列檢測器。

1.2.7 總糖含量測定 采用蒽酮-硫酸法[17]測定樣品中總糖含量。分別配制20、40、60、80、120、160 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,各標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL,加入4 mL 2 mg/mL蒽酮-硫酸溶液,混合均勻后置于沸水浴中反應(yīng)10 min,冰浴中冷卻至室溫后,在620 nm處測定其吸光度,繪制得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。沙棘酵素發(fā)酵液樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后,采用上述方法測定總糖含量。

1.2.8 羥基自由基清除能力的測定 取50 μL樣品,加去離子水補(bǔ)至2 mL,加入1.4 mL 6 mmol/L H2O2溶液,0.6 mL 20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L硫酸亞鐵,混勻,37 ℃下恒溫水浴1 h。在510 nm下,以去離子水為空白,檢測樣品吸光度。羥基自由基清除能力計算見式(1)[18-19]。

式(1)

式中,A0是空白對照液的吸光度,A1為樣品測定管的吸光度,A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.9 ABTS自由基清除能力的測定 用5 mmol/L pH7.4的PBS緩沖液將ABTS稀釋到7 mmol/L,加入過硫酸鉀溶液,得到最終濃度為2.45 mmol/L ABTS溶液,在暗處室溫放置12～16 h。使用前,在波長734 nm處,用PBS緩沖液將ABTS溶液稀釋,使其吸光度為0.70±0.02。

取7.5 μL樣品,用上述PBS溶液補(bǔ)足至300 μL,加入5 mL上述ABTS自由基稀釋液,30 ℃下反應(yīng)1 h,734 nm下測吸光度。ABTS自由基清除能力計算見式(2)[20]。

式(2)

式中,A0是空白對照液的吸光度,A1為樣品測定管的吸光度,A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.10 還原力的測定 取50 μL樣品,加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)補(bǔ)足至2.5 mL,加入1%(w/v)鐵氰化鉀水溶液2.5 mL,混合均勻,于50 ℃恒溫反應(yīng)30 min,加入10%(w/v)三氯乙酸水溶液2.5 mL,混勻,避光靜置10 min,取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%(w/v)三氯化鐵水溶液,混勻,在700 nm下,以去離子水為空白,檢測樣品吸光度[21]。

1.2.11 菌落總數(shù)的測定 參照GB 4789.2-2016 《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》[22]的方法,用10倍稀釋法,將體積分?jǐn)?shù)分別為10-2～10-5稀釋菌液涂布于PCA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.2.12 酵母菌菌落數(shù)的測定 參照GB 4789.15-2016 《食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》[23]的方法,用10倍稀釋法,將體積分?jǐn)?shù)分別為10-2～10-5稀釋菌液涂布于YEPD培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.2.13 醋酸菌菌落數(shù)的測定 參照王玉冰[2]的方法,用10倍稀釋法,將體積分?jǐn)?shù)分別為10-2～10-5稀釋菌液涂布于GYCA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復(fù)三次,采用Origin 8.6進(jìn)行繪圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,y=0.0104x-0.0253,R2=0.9998。沙棘酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化如圖2所示。隨著發(fā)酵時間的延長,總酚含量呈先快速上升然后再趨于動態(tài)平衡的趨勢。發(fā)酵到第40 d,總酚含量達(dá)到最高,為1.29 mg/mL。發(fā)酵前40 d,總酚含量快速上升,可能主要與此階段沙棘中多酚類物質(zhì)在高滲透壓作用下逐漸溶出以及微生物代謝有關(guān)。

圖2 發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.2 Changes of total phenolic content during fermentation

2.2 沙棘酵素發(fā)酵過程中總酸含量與pH的變化

總酸在一定程度上可反映酵素發(fā)酵中微生物生長代謝情況,而pH通?？梢宰鳛榕卸ㄎ⑸锷L正常與否的重要指標(biāo)。沙棘酵素發(fā)酵過程中總酸與pH含量變化趨勢如圖3所示,發(fā)酵過程中pH呈先降低再動態(tài)平衡的趨勢,總酸含量整體上呈先快速增加再動態(tài)平衡的趨勢。

圖3 發(fā)酵過程中總酸和pH的變化Fig.3 Changes in total acid and pH during fermentation

在發(fā)酵的前20 d,pH迅速下降,總酸含量明顯提高,這可能是由于原料中有機(jī)酸的大量溶出及醋酸菌等大量微生物代謝產(chǎn)生了醋酸等有機(jī)酸[24-26]。20 d后,pH基本穩(wěn)定,總酸含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢,發(fā)酵到第100 d,總酸含量達(dá)到最高為80.80 mg/mL。沙棘酵素在發(fā)酵過程中的總酸含量和pH變化趨勢與火龍果酵素、蘋果酵素基本一致,只是趨于穩(wěn)定的時間有所區(qū)別(火龍果酵素是40 d,蘋果酵素是14 d),這可能與原料的品種特性以及參與自然發(fā)酵的微生物種類不同有關(guān)[2,27]。

2.3 沙棘酵素發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

各有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。沙棘酵素不同發(fā)酵時間點的樣品中的有機(jī)酸種類及含量變化見表2。由表2可知,沙棘酵素發(fā)酵過程中檢測到草酸、酒石酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、醋酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸和沒食子酸,其中蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸的含量較高,呈先明顯升高再緩慢降低的趨勢。吳紫潔等[28]研究了12個沙棘品種果實中的有機(jī)酸組分,發(fā)現(xiàn)沙棘果實的有機(jī)酸有草酸、奎尼酸、蘋果酸、抗壞血酸和檸檬酸;戴達(dá)勇等[29]研究表明沙棘果粉中蘋果酸含量最高。由表2可知,醋酸和琥珀酸含量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢,其余幾種有機(jī)酸的含量較低且變化不明顯;發(fā)酵過程中未檢測到乳酸;沙棘酵素中醋酸的含量明顯增加,經(jīng)過100 d的發(fā)酵,從0.19203 mg/mL增加到1.31003 mg/mL,這可能是由于在發(fā)酵過程中,醋酸菌代謝旺盛,利用糖生成醋酸。發(fā)酵過程中新檢測到的有機(jī)酸有馬來酸、琥珀酸和沒食子酸,其中琥珀酸含量增加較為顯著,從第20 d開始檢測到琥珀酸,發(fā)酵100 d時,其含量為0.73932 mg/mL。Tsuji等[30]研究表明酵母菌等微生物發(fā)酵形成琥珀酸的路徑有三條:TCA循環(huán)的還原性分支,其主要在完全厭氧條件下活化;TCA循環(huán)的氧化分支,其主要在有氧條件下活化;以及乙醛酸支路。本實驗中琥珀酸含量的增加可能是酵母菌在代謝過程中大量繁殖造成的。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves of organic acids

表2 發(fā)酵過程中12種有機(jī)酸變化Table 2 Changes of twelve organic acids during fermentation

沙棘果實經(jīng)過微生物發(fā)酵后,含量最高的仍為蘋果酸,同時形成了新的有機(jī)酸,包括馬來酸、琥珀酸和沒食子酸,醋酸含量也明顯增加,這對其發(fā)揮生物學(xué)活性具有重要作用和意義。

2.4 沙棘酵素發(fā)酵過程中總糖含量的變化

總糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示,y=0.00274x-0.00368,R2=0.9992。糖作為酵素發(fā)酵過程中微生物利用的主要碳源,其含量變化可以作為微生物代謝的核心指標(biāo)之一。沙棘酵素發(fā)酵過程中的總糖含量變化如圖5所示。發(fā)酵的前30 d,總糖含量快速下降,在這個時間段內(nèi),一方面沙棘果原料中的水分在高糖滲透壓條件下,逐漸滲出,稀釋發(fā)酵液中的糖,使得發(fā)酵液中糖含量降低;另一方面,糖被酵母菌、醋酸菌等微生物作為碳源利用,用于合成和分解代謝[31]。楊小幸等[27]研究表明蘋果酵素中的蔗糖在21 d內(nèi)被分解為葡萄糖和果糖,二者又被酵母菌和醋酸等微生物利用生成乙醇和醋酸等代謝產(chǎn)物。發(fā)酵至第50 d,總糖含量降低至初始總糖含量的49.94%,為0.42 g/mL;之后,總糖含量有緩慢增加的趨勢并逐漸趨于穩(wěn)定,發(fā)酵至第100 d,總糖濃度相比最低點上升5.78%,這可能是由于微生物的生長繁殖和代謝導(dǎo)致發(fā)酵液中的總糖濃度下降與含糖代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生共同影響造成的。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of glucose

圖5 發(fā)酵過程中總糖含量變化Fig.5 Changes in concentration oftotal sugar during fermentation

2.5 沙棘酵素發(fā)酵過程中抗氧化性能評價

2.5.1 羥基自由基清除能力的變化 羥基自由基是人體內(nèi)一種常見的自由基,同時也是一種毒性最強(qiáng)的活性氧自由基,能夠殺死紅細(xì)胞,引起細(xì)胞膜、DNA等結(jié)構(gòu)的氧化損傷[32]。沙棘酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力變化情況如圖6所示,隨著發(fā)酵時間的延長,沙棘酵素對羥基自由基清除能力明顯提高,發(fā)酵至40 d清除率達(dá)到最高為64.44%,隨后清除率趨于穩(wěn)定。Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)沙棘原料的抗氧化能力較低,而本文中沙棘經(jīng)過發(fā)酵后,沙棘酵素的抗氧化能力提高非常明顯。沙棘酵素具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力,可能與其含有的酚類物質(zhì)含量較高有關(guān),Seyda等[34]研究表明酚類物質(zhì)可以提供大量氫離子,經(jīng)過共振雜化會變得穩(wěn)定,從而促進(jìn)了自由基清除能力的提高。

圖6 發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力變化Fig.6 Changes in hydroxyl free radicalscavenging ability during the fermentation

2.5.2 ABTS自由基清除能力的變化 ABTS自由基常被用作親水性和親脂性物質(zhì)的抗氧化能力的評價。沙棘酵素發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力變化情況如圖7所示,發(fā)酵的前40 d,ABTS自由基的清除能力明顯增強(qiáng),發(fā)酵至第40 d時清除率達(dá)到47.45%,40 d之后清除率有明顯上下浮動。Floegel等[35]研究表明與DPPH自由基清除能力相比較,ABTS自由基的抗氧化活性效果更好,特別是對于色素含量較高和親水性原料。Erel等[36]研究表明酚類物質(zhì)與ABTS自由基的清除能力具有顯著的正相關(guān)性,其中酚類物質(zhì)的分子質(zhì)量、羥基取代基的性質(zhì)和芳香環(huán)的數(shù)量起到了關(guān)鍵作用。

圖7 發(fā)酵過程中對ABTS自由基清除能力變化Fig.7 Changes in ABTS free radicalscavenging ability during the fermentation

2.5.3 還原力的變化 還原力是反映抗氧化能力的另一指標(biāo),與多種抗氧化機(jī)制有關(guān),包括還原能、結(jié)合自由基的清除、過氧化物的降解等,樣品的還原能力與吸光度呈正相關(guān)[37-38],通過測定反應(yīng)液在700 nm處的吸光度來評價還原力的大小。沙棘酵素發(fā)酵過程中還原力的變化情況如圖8所示,隨著發(fā)酵時間的延長,還原力明顯提高,至40 d達(dá)到0.55,隨后還原力又緩慢上升并趨于穩(wěn)定的趨勢,整體呈現(xiàn)“先快后慢”的趨勢。

圖8 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.8 Changes in reducing power during fermentation

2.6 沙棘酵素抗氧化活性與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析

沙棘酵素在不同發(fā)酵時間的樣品具有明顯的羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和較高的還原力,這可能與沙棘酵素中含有的總酚、總酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、醋酸、琥珀酸、總糖等代謝產(chǎn)物有關(guān)。沙棘酵素的抗氧化活性影響指標(biāo)眾多,眾多指標(biāo)之間可能會存在著部分信息的冗余,因而可以利用相關(guān)性分析來排除眾多相關(guān)變量的影響,對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果如表3所示。

表3 經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后各參數(shù)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of parameters after normalization

表5 旋轉(zhuǎn)前因子載荷矩陣Table 5 Rotated component matrix

由表3可知,在沙棘酵素發(fā)酵過程中,羥基自由基、ABTS自由基的清除能力和還原力這3個抗氧化指標(biāo)之間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性(P<0.01),總酚、總酸和琥珀酸與3個抗氧化能力指標(biāo)之間具有極顯著的正相關(guān)性(P<0.01),醋酸與3個抗氧化能力指標(biāo)之間具有良好的正相關(guān)性(P<0.05),可見沙棘酵素所含的酚類物質(zhì)和有機(jī)酸等物質(zhì)具有一定的抗氧化作用。總糖含量與抗氧化活性具有極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),說明發(fā)酵過程中微生物利用糖類物質(zhì)代謝產(chǎn)生酚類等活性物質(zhì),從而提高了沙棘酵素的抗氧化活性。潘梓源等[39]研究表明桂圓酵素經(jīng)過微生物發(fā)酵總酚含量是原桂圓水提液的5.05倍,其中新生成的酚類物質(zhì)至少有16種,是多種微生物代謝產(chǎn)生的結(jié)果。

2.7 主成分分析

2.7.1 主成分分析的特征值 為了進(jìn)一步明確沙棘酵素中各變量之間的相互關(guān)系,通過主成分分析對各變量進(jìn)行降維處理。

沙棘酵素主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率如表4所示。以特征值1.0為納入標(biāo)準(zhǔn),提取出2個主成分。其中第1主成分的貢獻(xiàn)率為69.166%,第2主成分的貢獻(xiàn)率為22.305%,二者累積方差貢獻(xiàn)率高達(dá)91.471%,即二者能夠反映原始變量91.471%的信息,可以用于描述大部分變量的信息。其中,第一主成分反映了總糖、羥基自由基清除率、還原力、總酚、ABTS自由基清除率、琥珀酸、總酸、pH和醋酸的變異信息,第二主成分反映了蘋果酸、抗壞血酸和酒石酸的變異信息。因此,對原先的12種變量指標(biāo)進(jìn)行降維處理后獲得2個新的變量,2個新變量分別用F1、F2表示,它們之間的線性關(guān)系為:

表4 主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 4 The eigenvalue,contribution rate and thecumulative contribution rate of principal components

F1=-0.343×ZTS+0.341×ZHR+0.338×ZRP+0.338×ZTPC+0.337×ZABTS+0.333×ZSUA+0.329×ZAC-0.314×ZpH+0.251×ZACA-0.014×ZMAA-0.103×ZVC+0.179×ZTAA

F2=0.019×ZTS+0.007×ZHR-0.094×ZRP-0.043×ZTPC+0.064×ZABTS-0.150×ZSUA+0.091×ZAC-0.166×ZpH-0.097×ZACA+0.607×ZMAA+0.560×ZVC+0.485×ZTAA

2.7.2 主成分分析法構(gòu)建抗氧化能力綜合評價指標(biāo) 通過主成分分析法構(gòu)建不同發(fā)酵時間樣品的綜合評價指標(biāo)(Comprehensive evaluation index,CEI),即以每個主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分的特征值之和的比例,再進(jìn)行線性加權(quán)求和得到綜合評價指標(biāo)。

式(3)

不同發(fā)酵時間沙棘酵素的綜合評價指標(biāo)如圖9所示。發(fā)酵前40 d的CEI值明顯升高,發(fā)酵40 d之后上升趨勢明顯減緩并趨于平穩(wěn)。參考CEI值的變化,結(jié)果表明,發(fā)酵至40 d,各種代謝指標(biāo)已基本穩(wěn)定。

圖9 沙棘酵素綜合評價指標(biāo)圖Fig.9 Comprehensive evaluation index of seabuckthorn jiaosu

2.8 沙棘酵素發(fā)酵過程中微生物菌群的變化

對沙棘酵素發(fā)酵過程中菌落總數(shù)、酵母菌、醋酸菌等菌落數(shù)量變化進(jìn)行研究,如圖10所示。從酵母菌和醋酸菌菌落數(shù)的變化趨勢可以明顯看到遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期[40]。在發(fā)酵初期,由于菌種對生長環(huán)境需要適應(yīng),使得10～20 d的酵母菌和醋酸菌菌種數(shù)量增加緩慢,即二者需要經(jīng)歷遲緩期來適應(yīng)環(huán)境,所以菌落數(shù)增加較少;隨后20～30 d的酵母菌和20～40 d的醋酸菌分別進(jìn)入對數(shù)生長期,二者適應(yīng)環(huán)境之后數(shù)量快速增加;隨后菌種的繁殖達(dá)到動態(tài)平衡,酵母菌和醋酸菌分別在30～60 d和40～80 d進(jìn)入穩(wěn)定期;最后當(dāng)外部的環(huán)境不再適合菌種生長時,即菌種的分解代謝超過了合成代謝,導(dǎo)致酵母菌在最后的60～100 d開始進(jìn)入衰退期。

圖10 發(fā)酵過程中微生物菌群的變化Fig.10 Changes in the microbialcommunity during fermentation注:A:菌落總數(shù);B:酵母菌;C:醋酸菌。

菌落數(shù)與總酚和總酸的變化趨勢基本一致,醋酸菌數(shù)量的增加驗證了發(fā)酵過程中醋酸含量不斷增加的原因,酵母菌含量的增加可能是導(dǎo)致發(fā)酵過程中琥珀酸含量增加的原因。葉陵等[41]研究表明剁辣椒在短期自然發(fā)酵過程中菌落總數(shù)和酵母菌菌落數(shù)呈現(xiàn)先增加再趨于平衡的趨勢,發(fā)酵初期的養(yǎng)分充足,微生物快速生長,但隨著發(fā)酵時間的延長,微生物代謝產(chǎn)生的醋酸等物質(zhì)具有抗菌活性,從而使菌株生長放緩,這與本研究結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

總酚與總酸含量、抗氧化能力(羥基自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、還原力)呈先快速上升再動態(tài)平衡的趨勢;pH、總糖含量呈先快速降低再動態(tài)平衡的趨勢;沙棘酵素中的有機(jī)酸主要以酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸為主,發(fā)酵過程中新檢測到的有機(jī)酸有馬來酸、琥珀酸和沒食子酸,醋酸和琥珀酸呈現(xiàn)不斷增加的趨勢。綜合評價指標(biāo)分析結(jié)果表明:發(fā)酵前40 d的CEI呈逐漸上升趨勢,40 d之后上升趨勢明顯減緩并趨于平穩(wěn),說明發(fā)酵至40 d,各種代謝指標(biāo)已基本穩(wěn)定。對沙棘酵素發(fā)酵過程中的菌落總數(shù)、酵母菌和醋酸菌數(shù)量進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)沙棘酵素發(fā)酵過程中醋酸菌呈先快速上升再動態(tài)平衡的趨勢,酵母菌呈先快速上升再動態(tài)平衡最后緩慢下降的趨勢,從微生物的角度反映了沙棘酵素的代謝過程。