還原型谷胱甘肽納米脂質(zhì)體的修飾及穩(wěn)定性評價

魏竹君,于少軒,楊 武,王善鈺,宋元達

(山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院,山東淄博 255000)

還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的含活性巰基的三肽,在生物體內(nèi)廣泛存在且具有多種重要的生理功能,如抗氧化、解毒、消除疲勞、延緩衰老、預防糖尿病和癌癥以及參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)和糖代謝等[1]。近年來,GSH也被廣泛地應用于食品工業(yè)。例如,它可以作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑被添加到肉制品中,增強肉類的風味;也可以作為抗氧化劑被添加到酸奶、嬰兒食品以及蔬菜類食品中,防止食品發(fā)生氧化、褐變等不良反應,保持其原有的營養(yǎng)價值[2]。但是GSH穩(wěn)定性較差,容易被氧化,而且不易透過細胞膜,生物利用率較低,因此,其在食品中的應用受到了限制。

脂質(zhì)體是由磷脂雙分子層組成的一種有效傳遞系統(tǒng),可用于包埋親水性和疏水性成分,具有靶向、緩釋、降低毒性和提高藥物的穩(wěn)定性等作用[3]。由于其獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì),脂質(zhì)體被廣泛應用于化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而,脂質(zhì)體在貯藏過程中其結(jié)構(gòu)容易受到光照、酸、堿等的破壞,出現(xiàn)顆粒絮凝、粒徑變大、藥物釋放等問題[4];另外,作為口服制劑的脂質(zhì)體在體內(nèi)消化吸收過程中,容易受到酸和酶的影響,使脂質(zhì)體磷脂壁發(fā)生水解,磷脂雙分子層受到破壞,從而使被包埋的物質(zhì)泄漏出來,這些問題大大限制了脂質(zhì)體的實際應用[5-6]。研究表明,對脂質(zhì)體表面進行修飾可以提高其穩(wěn)定性,且目前已有大量關(guān)于殼聚糖[7]、聚乙二醇[8]、蛋白質(zhì)[9]等單一聚合物修飾脂質(zhì)體的研究報道。但由于修飾過程中脂質(zhì)體與修飾層間的結(jié)合力較弱,結(jié)構(gòu)松散,所形成的單層修飾的脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性并不理想[10-11]。因此需要雙層或多層修飾來提高其穩(wěn)定性。

殼聚糖和海藻酸鈉作為天然的聚陽離子型多糖和聚陰離子型多糖,具有良好的生物相容性、生物可降解性和黏附性,被廣泛應用于活性成分包埋[12-14]。殼聚糖在酸性溶液中呈現(xiàn)陽離子性質(zhì),可以通過靜電作用與帶負電的脂質(zhì)體結(jié)合,在脂質(zhì)體表面形成一層保護膜[15]。Shalaby等[16]研究發(fā)現(xiàn)用殼聚糖修飾的脂質(zhì)體比未修飾的脂質(zhì)體具有更高的穩(wěn)定性和更強的緩釋功能。普遍認為殼聚糖修飾的脂質(zhì)體是一種很有潛力的載體,能夠用于包埋其他具有生物活性的功能成分,進而用于功能性食品的加工生產(chǎn)。Haidar等[17]用海藻酸鈉和殼聚糖對牛血清蛋白脂質(zhì)體進行修飾測定其貯藏穩(wěn)定性,研究結(jié)果表明海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾脂質(zhì)體能夠大大增強其穩(wěn)定性。Sliva等[18]通過海藻酸鈉-殼聚糖對姜黃素脂質(zhì)體進行了雙層修飾,并且發(fā)現(xiàn),在模擬體外消化過程中,被修飾的姜黃素脂質(zhì)體具有更高的抗氧化能力,并且能夠減少脂質(zhì)體的消化程度,增加其穩(wěn)定性,延長其體內(nèi)外循環(huán)時間。但是消化過程中的脂質(zhì)體的緩釋機制尚未被研究。

在藥物運載體系中,藥物釋放通常是一個很復雜的過程,受到眾多因素的影響,如藥物擴散、溶蝕作用、不同機制之間相互作用[19]等。而脂質(zhì)體的釋藥過程往往是由幾種機制相互作用、共同控制的。而且在不同釋藥階段,每種釋藥機制的貢獻大小也會存在差異。因此,通過引入合適的動力學模型,對脂質(zhì)體的藥物緩釋機理進行深入研究對脂質(zhì)體的應用具有重要指導意義。

本研究利用殼聚糖和海藻酸鈉正、負電荷的靜電作用層層交替對制備的GSH脂質(zhì)體進行了雙層修飾,構(gòu)建出了殼聚糖-海藻酸鈉雙層修飾的GSH納米脂質(zhì)體。通過考察脂質(zhì)體粒徑、分散系數(shù)、電位的變化,以及脂質(zhì)體修飾前后的貯藏穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性,表征了殼聚糖和海藻酸鈉修飾對脂質(zhì)體的影響,利用各種數(shù)學模型分析了脂質(zhì)體在體外模擬胃腸道消化環(huán)境中釋放GSH的可能機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

還原型谷胱甘肽 山東金城生物藥業(yè)有限公司;大豆卵磷脂、胃蛋白酶(酶比活力:1∶15000)、胰蛋白酶(酶比活力:1∶2500) 上海麥克林生化科技有限公司;膽固醇、還原型谷胱甘肽含量檢測試劑盒 索萊寶生物科技有限公司;吐溫80、殼聚糖、海藻酸鈉 國藥集團化學試劑有限公司;其余常規(guī)試劑 均購自國藥集團化學試劑有限公司。

Zetasizer Nano-ZS90納米粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司;UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司;Multiskan FC型酶標儀 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FE20pH儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KYC-100B恒溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;FG-18磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;KQ-700E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;JY99-ⅡD超聲破碎儀 北京佳源興業(yè)科技有限公司;傅里葉變換中紅外光譜儀 美國熱電尼高力儀器公司;場發(fā)射掃描電子顯微鏡Apreos 美國Thermo公司;真空冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GSH納米脂質(zhì)體(Lip)的制備 Lip的制備參考Lasic[20]的制備方法,并在其基礎(chǔ)上進行改進。將大豆卵磷脂、膽固醇和吐溫80按照質(zhì)量比為4∶1∶1.6的比例加到15 mL無水乙醇中使得膽固醇的濃度為4.17 mg/mL,將混合溶液倒入圓底燒瓶,并在50 ℃、0.1 MPa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min,以除去有機相并在瓶壁形成均勻透明的薄膜。然后向圓底燒瓶加入20 mL溶解有80 mg GSH的PBS溶液(0.05 mol/L,pH6.0),在50 ℃、常壓條件下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)水合30 min,將薄膜洗脫下來,然后將洗脫下來的溶液在冰浴中超聲10 min,靜置2 h,得到GSH納米脂質(zhì)體溶液,所得的樣品于4 ℃保存。

1.2.2 Lip的雙層修飾 將1 mL Lip溶液加到1 mL注射器中,然后按照體積比為1∶1的比例逐滴緩慢地滴加到pH6.0的殼聚糖溶液(0.1 g/100 mL)中,邊攪拌邊加入,待Lip溶液滴加完全后,將得到的混合溶液靜置2 h,使殼聚糖充分包裹到納米脂質(zhì)體表面,即得到殼聚糖修飾的GSH納米脂質(zhì)體(CH-Lip)[21]。

將上述制得的CH-Lip置于注射器中,按照體積比為1∶1的比例逐滴滴加到pH6.0的海藻酸鈉溶液(0.1 g/100 mL)中,邊攪拌邊加入,待CH-Lip溶液滴加完全,靜置2 h,即得雙層修飾GSH納米脂質(zhì)體(AL-CH-Lip),所得的樣品于4 ℃下保存。

1.2.3 粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位測定 取1 mL AL-CH-Lip樣品、CH-Lip樣品和Lip樣品,分別用超純水稀釋3、5和10倍,然后用電位-粒度分析儀測定三種樣品的粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位,測定條件為20 ℃,磷脂和分散介質(zhì)的折射率比值為1.330[22]。每個樣品平行測定三次以上。

1.2.4 微觀形貌觀察 將AL-CH-Lip樣品、CH-Lip樣品和Lip樣品分別用超純水稀釋3、5和10倍,然后滴加到硅片上,自然風干過夜,真空噴金鍍膜,最后在掃描電子顯微鏡下進行觀察。

1.2.5 紅外光譜表征 將一定體積的Lip樣品、CH-Lip樣品和AL-CH-Lip樣品在真空冷凍干燥機中凍干后,稱取1 mg樣品與150 mg KBr在瑪瑙研缽中研磨混合,并置于模具中壓成透明薄膜[23],然后將薄膜放到進行紅外光譜分析儀中測定,掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.6 Lip包埋率的測定 精密量取脂質(zhì)體100 μL,加入500 μL蒸餾水3000 r/min離心10 min,再加入200 μL蒸餾水離心10 min,精密量取超濾離心管外液體100 μL稀釋10倍[24],利用GSH含量檢測試劑盒測得游離GSH含量,按式(1)計算包埋率。

式(1)

式中:Wtotal為制備時加入的GSH總量,mg;Wfree為測得的游離GSH的量,mg。

1.2.7 貯藏穩(wěn)定性試驗 將Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip貯藏于室溫條件下,并于第1、3、5、7、9、11、25、39、60 d取樣,測定釋放到溶液中的GSH的量,并根據(jù)式(2)計算GSH釋放率。

式(2)

式中:Et為時間t測定的游離GSH濃度,mg/mL;E0為0 d時測定的游離的GSH濃度,mg/mL;Etotal為制備時GSH的濃度,mg/mL。

1.2.8 體外消化穩(wěn)定性研究

1.2.8.1 模擬消化液的制備 參考Dupont等[25]的方法配制模擬胃液和模擬腸液。

模擬胃液:稱取2 g氯化鈉溶解于10 mL蒸餾水中,量取7 mL市售濃鹽酸溶液,混合均勻后,用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1.2后定容至1 L容量瓶中。其中,胃蛋白酶在消化實驗開始時加入,其質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL。制備完成的溶液貯藏于4 ℃。

模擬腸液:稱取6.8 g磷酸氫二鉀溶于蒸餾水中,然后準確量取190 mL濃度為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液,混合均勻,然后用0.01 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.4后定容到1 L。胰酶和膽汁在消化實驗開始時加入,其中,胰蛋白酶的質(zhì)量濃度為3.2 mg/mL,膽汁濃度為0.2 mg/mL。制備完成的溶液貯藏于4 ℃。

1.2.8.2 體外模擬胃、腸單獨消化 分別將Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip與模擬胃液或模擬腸液分別按照1∶3、2∶3、4∶3體積混合,在37 ℃、95 r/min搖床中孵育以模擬消化反應,以酶加入的瞬間作為反應的開始時間,每隔一定消化時間取樣分析,取樣時間為0、5、15、30、60、120、240 min[26-27]。測定樣品中GSH的含量,并根據(jù)式(3)計算。每個樣品平行測試三次。

式(3)

式中:Em為時間m分鐘時測定的游離GSH含量,mg;En為反應開始時間時測定的游離的GSH含量,mg;Etotal為制備時加入的GSH總量,mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0、Origin 8.0、DDsolver等[28]數(shù)據(jù)處理和繪圖軟件進行分析作圖,以P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著的判斷標準。結(jié)果均以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位變化

納米顆粒的大小直接影響包埋物的載量、釋放、生物利用率以及體內(nèi)分布和靶向性。控制粒子的大小和獲得較窄均勻的粒度分布是制備納米顆粒的關(guān)鍵[7]。

由圖1可知,Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的平均粒徑分別為(77.72±0.87)、(93.81±1.56)nm和(94.44±1.71)nm,即Lip經(jīng)殼聚糖單獨修飾或殼聚糖和海藻酸鈉雙層修飾后粒徑分別增大了16.09 nm和16.72 nm,初步證明了殼聚糖和海藻酸鈉包裹在了脂質(zhì)體表面。另外,與Lip的分散系數(shù)相比,CH-Lip和AL-CH-Lip的分散系數(shù)有一定程度增加,但其值仍小于0.4。這可能是因為殼聚糖與海藻酸鈉修飾在脂質(zhì)體的外層使脂質(zhì)體的表面毛糙,部分未成功修飾的殼聚糖和海藻酸鈉使整個體系的分布更為分散。Alshraim等[29]研究發(fā)現(xiàn)對脂質(zhì)體表面進行殼聚糖修飾,其粒徑跟分散系數(shù)也會有一定程度增大,與本研究結(jié)果相似。

圖1 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的粒徑及分散系數(shù)Fig.1 Particle size and polydispersity index(PDI)of Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

Zeta電位能夠衡量電荷的多少,修飾劑的存在會改變脂質(zhì)體表面的帶電情況,分析修飾前后脂質(zhì)體的電位值可以判斷修飾劑是否成功修飾在脂質(zhì)體的表面。

由圖2可知,Lip的Zeta電位為(-27.2±0.03) mV,經(jīng)殼聚糖修飾后變?yōu)?20.47±0.65) mV,再經(jīng)海藻酸鈉修飾后變?yōu)?-42.57±0.91) mV。磷酸基團的存在使脂質(zhì)體Zeta電位為負值,而殼聚糖攜帶大量的正電荷,當殼聚糖包裹于脂質(zhì)體表面時,脂質(zhì)體的Zeta電位變化為正值。類似地,Zhou等[30]也發(fā)現(xiàn)用殼聚糖對脂質(zhì)體表面進行修飾時,隨著殼聚糖用量增加,脂質(zhì)體Zeta電位也不斷增加。同理,海藻酸鈉分子帶有大量負電荷,也能通過靜電作用緊緊包裹于殼聚糖的表面,使經(jīng)殼聚糖修飾的脂質(zhì)體的Zeta電位由正值變?yōu)樨撝礫31]。Zeta電位的變化進一步證實了殼聚糖和海藻酸鈉通過靜電吸附的方式成功包裹在了脂質(zhì)體表面。

圖2 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的Zeta電位Fig.2 Zeta potential of Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

2.2 微觀形貌表征

為了了解Lip修飾前后的形貌變化,采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)對Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip 3個樣品進行了觀察,結(jié)果如圖3所示。由圖3a可知,Lip為球形,在SEM下呈亮白色。殼聚糖修飾后,如圖3b所示,CH-Lip仍然是球形顆粒,但其外圍有一層透明狀的物質(zhì),這應該是包裹于Lip外層的殼聚糖。AL-CH-Lip也呈球形,并且外層也有一圈淡淡的物質(zhì),這應該是CH-Lip上包裹的海藻酸鈉(圖3c)。因此,SEM結(jié)果進一步證明了殼聚糖與海藻酸鈉包裹在了Lip表面。Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的粒徑大小分布在70～100 nm范圍內(nèi),與粒度儀測量的結(jié)果接近。

圖3 Lip(a)、CH-Lip(b)和AL-CH-Lip(c)的掃描電子顯微鏡圖像(300000×)Fig.3 SEM images of Lip(a),CH-Lip(b)and AL-CH-Lip(c)(300000×)

2.3 傅里葉變換中紅外光譜表征

利用傅里葉變換中紅外光譜儀可以測定Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的化學結(jié)構(gòu),進而推測修飾引起的化學鍵的變化情況,證明Lip的外層成功包裹上了殼聚糖與海藻酸鈉,結(jié)果如圖4所示。脂質(zhì)體磷脂雙分子層界面可以用C=O和P=O這兩種極性基團表征。Lip的光譜中1739 cm-1為C=O的伸縮振動[32],1241 cm-1為P=O的對稱振動[33],2926和2855 cm-1處的吸收峰為脂質(zhì)體雙分子層內(nèi)部的丙烯鏈的對稱和不對稱CH2伸縮振動[34]。對比Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的光譜可以發(fā)現(xiàn),丙烯的對稱和不對稱CH2伸縮振動在CH-Lip(2925和2854 cm-1)和AL-CH-Lip(2924和2853 cm-1)中基本保持不變。但是,代表C=O的吸收峰則在CH-Lip和AL-CH-Lip中分別移動至1700和1706 cm-1,說明在修飾脂質(zhì)體的過程中有新的氫鍵的形成或者是氫鍵有所加強[22];另外,代表P=O基團表征的吸收峰在CH-Lip和AL-CH-Lip中出現(xiàn)于1235和1231 cm-1,說明殼聚糖與納米脂質(zhì)體之間有新的氫鍵的形成,證明殼聚糖成功的包裹在脂質(zhì)體的表面。殼聚糖中的氨基的特征峰出現(xiàn)在1655 cm-1[35],海藻酸鈉中的羧基的不對稱伸縮振動的特征峰出現(xiàn)在1614 cm-1[36],在CH-Lip和AL-CH-Lip中這些特征峰消失,這說明殼聚糖與海藻酸鈉發(fā)生相互作用,海藻酸鈉成功包裹在了CH-Lip的表面。

圖4 Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip、殼聚糖和海藻酸鈉的傅里葉紅外圖譜Fig.4 FTIR spectra of Lip,CH-Lip,AL-CH-Lip chitosan and alginate

2.4 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的GSH包埋率

藥物的包埋率是評價納米顆粒質(zhì)量和應用價值的重要指標,能夠反映整個脂質(zhì)體體系在制備過程中GSH的保留率。

由圖5可知,Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip對GSH的包埋率分別為67.5%±0.82%、85.5%±0.65%、93.5%±0.16%,即經(jīng)殼聚糖修飾、殼聚糖和海藻酸鈉雙層修飾后,脂質(zhì)體對GSH的包埋率分別增加了18.0%和26.0%。包埋率的增加可能是有兩方面原因,一是殼聚糖與海藻酸鈉在結(jié)合到脂質(zhì)體表面的過程中,游離的GSH也被包埋到了顆粒表面;二是殼聚糖與海藻酸鈉在脂質(zhì)體表面形成致密的修飾層,避免了GSH的釋放[37]。白春清等[38]利用殼聚糖和果膠多層修飾脂質(zhì)體的結(jié)果也表明雙層修飾后其包埋率會大大增加,與本研究結(jié)果相似。

圖5 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的包埋率Fig.5 Loading efficiency of glutathione in Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

2.5 貯藏穩(wěn)定性

由于脂質(zhì)體在貯藏過程中會出現(xiàn)顆粒絮凝、粒徑變大、藥物釋放等問題,因此,修飾脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性是評價載體系統(tǒng)的重要指標之一。由圖6可知,在室溫貯藏過程中,隨著時間不斷延長,Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip中GSH的釋放率不斷增加。其中,Lip的釋放率最高,在常溫貯藏60 d后,其GSH釋放率高達16.23%±1.13%。而兩種經(jīng)過修飾的脂質(zhì)體的釋放率明顯低于未修飾的脂質(zhì)體的釋放率,并且AL-CH-Lip的釋放率最低,60 d后釋放率僅為9.96%±0.99%。因此,將脂質(zhì)體表面進行修飾能夠明顯提高其在室溫下的貯藏穩(wěn)定性,且雙層修飾的脂質(zhì)體具有更高的穩(wěn)定性。

圖6 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip中GSH在貯藏過程中的釋放Fig.6 GSH release from Lip,CH-Lipand AL-CH-Lip during storage

2.6 體外消化穩(wěn)定性

脂質(zhì)體進入胃腸道之后很容易被強酸強堿性的消化液破壞,導致脂質(zhì)體中包埋的物質(zhì)泄漏,降低其生物利用度。為了表征修飾前后的脂質(zhì)體對谷胱甘肽運載及吸收效果的影響,將運載谷胱甘肽的修飾前后的脂質(zhì)體進行體外模擬消化實驗。

由圖7可知,Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip在體外模擬胃消化過程中,GSH的釋放都呈現(xiàn)先快后慢的趨勢,但Lip的釋放率明顯高于兩種經(jīng)修飾的脂質(zhì)體的釋放率。在胃消化開始后60 min內(nèi),Lip的釋放率達到了45.99%±2.50%,而CH-Lip與AL-CH-Lip的釋放率分別為12.42%±1.04%和5.72%±1.56%。當消化時間為120 min時,三種脂質(zhì)體基本達到了最大的GSH釋放率,Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip的釋放率分別為48.02%±3.02%、21.90%±1.18%、7.63%±1.64%。之后,三種脂質(zhì)體的GSH釋放率都沒有明顯改變。在胃消化過程中,Lip中GSH的釋放率遠遠高于CH-Lip和AL-CH-Lip。這可能是因為海藻酸鈉能夠降低胃蛋白酶的活,并且根據(jù)Cuomo等[39]研究表明,殼聚糖在胃酸中能夠降低藥物的釋放。因此,AL-CH-Lip在胃液中具有更高的穩(wěn)定性,這有利于將更多被包埋的GSH運輸?shù)叫∧c中。

圖7 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip中GSH在模擬胃消化過程中的釋放Fig.7 GSH release from Lip,CH-Lipand AL-CH-Lip in simulated gastric digestion

由圖8可知,在體外模擬腸道消化過程中,Lip呈現(xiàn)一種隨著時間不斷增加其包裹的GSH的釋放率也不斷的增加的趨勢,當消化時間為240 min時,其釋放率到了88.81%±1.73%;而CH-Lip與AL-CH-Lip呈現(xiàn)的是先快速釋放后進入緩慢釋放的趨勢,當消化時間為30 min時,CH-Lip和AL-CH-Lip基本達到了最大的GSH釋放率,分別為26.14%±1.14%和8.92%±0.63%。之后,這兩種脂質(zhì)體的GSH的釋放率都沒有明顯變化。因此,在模擬腸消化的整個過程中,未修飾的脂質(zhì)體比修飾的脂質(zhì)體釋放出更多的GSH。

圖8 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip中GSH在模擬腸消化過程中的釋放Fig.8 GSH release from Lip,CH-Lipand AL-CH-Lip in simulated intestinal digestion

脂質(zhì)體在腸液中對GSH的釋放率明顯高于其在胃液中對GSH的釋放率。這可能是因為腸液中胰酶對脂質(zhì)體外層磷脂的水解作用以及膽鹽的增溶作用導致脂質(zhì)體水解破裂[40],而釋放出大量GSH。而包裹于脂質(zhì)體表面的殼聚糖與海藻酸鈉能夠阻隔腸液中的胰酶和膽鹽與脂質(zhì)體外層的磷脂接觸,從而保護脂質(zhì)體的完整性,使被包裹的GSH不易滲出。納米脂質(zhì)體可以通過腸表面的粘膜層被吸收,據(jù)Sahay等[41]研究發(fā)現(xiàn),納米粒子可以被上皮細胞通過主動或被動運輸機制直接吸收。所以,被雙層修飾的脂質(zhì)體能夠大大提高GSH的生物利用率。

2.7 脂質(zhì)體體外釋放曲線擬合與釋放機理

在藥物釋放機制的分析中經(jīng)常采用的模型方程有零級釋放方程、一級釋放方程、Higuchi釋放方程、Makoid-Banakar方程和Peppas-Sahlin方程。為了更好地理解Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip在模擬消化過程中釋放GSH的機制,通過DDsolver軟件分別用上述五種釋放模型對不同脂質(zhì)體在模擬胃腸消化過程中GSH的釋放進行了擬合。結(jié)果見表1和表2。

表1 不同脂質(zhì)體在模擬胃消化道釋放動力學和控釋機制Table 1 The dynamics and controlled release mechanism of different liposomes in simulated gastric tract release

由表1可知,Makoid-Banakar模型和Peppas-Sahlin模型對于三種脂質(zhì)體在體外模擬胃消化道釋放曲線的最小信息標準(AIC)較小且模型選擇標準值(MSC)較大,擬合效果較好。其中Makoid-Banakar模型擬合結(jié)果中的指數(shù)n值可以用來描述藥物的釋放機理:當n<0.45時,釋放模型的藥物是擴散型;當0.45≤n≤0.89時,釋放模型的藥物為擴散和溶蝕型兼有;當n>0.89時,藥物釋放模型為溶蝕型[42-43]。如表1中所示,Lip、CH-Lip、AL-CH-Lip經(jīng)Makoid-Banakar模型擬合得到的n值分別為0.701、0.791和0.730,說明三種脂質(zhì)體的釋放模型均為擴散和溶蝕型兼有[44]。Peppas-Sahlin動力學方程對釋藥機制進行進一步研究。右邊第一項表示Fick擴散作用對藥物釋放過程的貢獻,而第二項表示基質(zhì)溶蝕作用對藥物釋放過程的貢獻即k1和k2分別表示擴散作用和溶蝕作用速率常數(shù)。如表2所示,三種脂質(zhì)體的k1>k2,即GSH主要是從脂質(zhì)體中擴散釋放,另有一小部分GSH通過溶蝕釋放。

表2 不同脂質(zhì)體在模擬腸消化道釋放動力學和控釋機制Table 2 The dynamics and controlled release mechanism of different liposomes in simulated intestinal tract release

通過引入Fick擴散貢獻比(R),可以進一步評價Fick擴散作用在模擬胃消化道中GSH釋放過程中貢獻大小的變化。根據(jù)式(4)計算R值。

式(4)

式中:k1表示擴散作用速率常數(shù),m2min-1;k2表示溶蝕作用速率常數(shù),m2min-1;m表示Fick擴散指數(shù);t表示某一時刻,min。

圖9進一步考察三種脂質(zhì)體在模擬胃消化道過程中各個時間點累積釋放量中擴散和溶蝕所占的比例,可以發(fā)現(xiàn)三組脂質(zhì)體釋放時擴散機制所占比例均隨釋放時間延長而逐漸減小,但仍占據(jù)主導地位。當釋放時間從0 min增加到240 min時,擴散機制所占比例從1分別減小到0.605、0.689、0.717;相反地,溶蝕機制所占的比例則相應增大,由初始0分別增大到0.395、0.311、0.283。因此,脂質(zhì)體的修飾層數(shù)越多,在整個釋放周期中溶蝕比例增加速度越慢,與前面海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾的脂質(zhì)體在4 h內(nèi)累積釋放量明顯低于未修飾的脂質(zhì)體的釋放量的結(jié)果一致,說明海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾的脂質(zhì)體可以通過影響釋放的溶蝕行為,起到延緩GSH的釋放率。

圖9 Lip、CH-Lip和AL-CH-Lip的Fick擴散貢獻比RFig.9 Fick diffusion contribution ratio R of Lip,CH-Lip and AL-CH-Lip

由表2的結(jié)果可知,Makoid-Banakar模型和Peppas-Sahlin模型對于三種脂質(zhì)體在體外模擬腸道釋放曲線擬合較好,最小信息標準(AIC)較小,且模型選擇標準值(MSC)較大。根據(jù)Makoid-Banakar模型擬合結(jié)果中的n值可以看出,三種脂質(zhì)體在腸道的釋放模型均是擴散型。

上述結(jié)果表明,未修飾的脂質(zhì)體與被修飾的脂質(zhì)體在釋放GSH時存在一定差異,可能是因為修飾物在脂質(zhì)體表面的殼聚糖和海藻酸鈉作為擴散溶質(zhì)的物理屏障,在GSH釋放過程中起到了位阻作用[45]。Hasan等[46]在研究殼聚糖修飾前后的脂質(zhì)體在水溶液中釋放姜黃素的過程中也發(fā)現(xiàn)被修飾的脂質(zhì)體的釋放率明顯低于被修飾的脂質(zhì)體的釋放率,與本研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

本實驗先通過薄膜-超聲法制備了GSH納米脂質(zhì)體Lip,然后用殼聚糖和海藻酸鈉對其表面進行了修飾。結(jié)果表明,經(jīng)海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾后,Lip的粒徑從(77.72±0.87) nm增加到了(94.44±1.71) nm,Zeta電位由(-27.20±0.03) mV變?yōu)?-42.57±0.91) mV,GSH包埋率從67.5%±0.82%增加到93.5%±0.16%。通過SEM結(jié)果可以看出,修飾前后Lip的形貌沒有變化,均為球形,而且海藻酸鈉與殼聚糖修飾在納米脂質(zhì)體的表面。通過傅里葉變換中紅外光譜上各官能團吸收峰位置和強度變化進一步證明,海藻酸鈉與殼聚糖成功修飾在了脂質(zhì)體表面。貯藏穩(wěn)定性與胃腸道穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明,海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾顯著增強了GSH納米脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,使其在胃腸道中釋放GSH的速率顯著降低。因此,在復雜的食品加工體系中,使用殼聚糖-海藻酸鈉雙層修飾的脂質(zhì)體可以避免GSH的過快釋放,增加GSH的穩(wěn)定性,從而促進胃腸道細胞對GSH的吸收,增加食品的營養(yǎng)價值。該研究結(jié)果為海藻酸鈉-殼聚糖雙層修飾的GSH納米脂質(zhì)體在食品領(lǐng)域中的應用提供了參考依據(jù)和一定的數(shù)據(jù)支持。