原發(fā)性干燥綜合征患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞表達(dá)水平及意義

孫超，王健，王信，郭文靜，李志軍

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，安徽 蚌埠 233000）

干燥綜合征是一種主要侵犯機(jī)體唾液腺、淚腺、外分泌腺，且隨病情進(jìn)展可累及其他器官、系統(tǒng)損害的自身免疫性疾病，患者主要臨床表現(xiàn)為口咽干燥等［1］。目前，對(duì)于干燥綜合征的發(fā)病機(jī)制尚處于研究探索階段。研究指出，體液因子、細(xì)胞因子、環(huán)境、遺傳等因素在干燥綜合征發(fā)病中起到了重要作用，是多種因素共同作用的結(jié)果［2-3］。在干燥綜合征發(fā)病過程中，部分細(xì)胞因子具有輔助機(jī)體免疫系統(tǒng)中細(xì)胞之間信號(hào)傳遞，趨化免疫細(xì)胞到達(dá)淚腺、唾液腺等分泌腺體，以及調(diào)節(jié)免疫功能的作用［4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞 （Bregs）能夠通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1） 及白介素-10（IL-10） 等細(xì)胞發(fā)揮負(fù)向調(diào)控免疫的作用［5］。研究顯示，在多種自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，Bregs表達(dá)水平均出現(xiàn)異常［6］。本研究通過檢測(cè)原發(fā)性干燥綜合征患者外周血Bregs細(xì)胞水平變化情況，分析了Bregs在原發(fā)性干燥綜合征發(fā)病機(jī)制中的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2017年1月至2019年4月收治的36例干燥綜合征患者作為病例組，入選標(biāo)準(zhǔn)： （1）均符合干燥綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］； （2） 均為初治者； （3） 入組前均未接受免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等治療；（4）均為原發(fā)性干燥綜合征；（5）研究對(duì)象及家屬均對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)： （1）存在精神障礙、智力障礙以及認(rèn)知功能障礙者； （2）伴有惡性腫瘤或者腎功能衰竭者； （3）合并其他免疫性疾病者；（4）入組時(shí)存在急慢性感染者；（5）長期服用甲氨蝶呤、青霉胺、激素等抗風(fēng)濕藥物者；（6）年齡在18歲以下者。36例患者中，男4例，女32例；年齡19～76歲，平均年齡 （50.29±7.84）歲；歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟制定的干燥綜合征病情評(píng)估指數(shù) （ESSDAI）：0～2分11例，3～5分22例，6～8分3例；有系統(tǒng)損傷24例，無系統(tǒng)損傷12例；抗 SSA抗體陽性20例，陰性16例；抗SSB抗體陽性10例，陰性26例。另選取同期門診健康體檢者30例作為對(duì)照組，均無急慢性感染、自身免疫性疾病或者自身免疫性疾病家族史，其中男5例，女25例；年齡20～75歲，平均年齡（50.76±7.29）歲。2組研究對(duì)象性別、年齡等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Bregs細(xì)胞水平 抽取研究對(duì)象清晨靜脈血2 ml，經(jīng)抗凝處理后取100μl加入至流式細(xì)管中，順序編號(hào)之后送檢；于流式細(xì)管中各加入20μl的APC-CD19單抗、FITCCD24單抗、PE-CD38單抗 （均為美國 BD Biosciences公司產(chǎn)品），并設(shè)置同型抗體的對(duì)照組，加入20μl的APC-IgG1單抗、FITC-IgG2b單抗、PE-IgG1單抗 （均為美國BD Biosciences公司產(chǎn)品）；混勻之后室溫下避光保存30 min，以確保試劑與樣本能夠充分反應(yīng)；然后加入紅細(xì)胞裂解液150μl，震蕩混勻，放置于冰箱中避光保存 20 min，溫度為4℃；以2 000 r／min離心10 min，棄去上清液，取白細(xì)胞沉淀用PBS液洗滌3次，然后分別于2 000 r／min離心10 min，循環(huán)離心2次，于沉淀中加入500 ml的PBS液制成單細(xì)胞懸液，濾網(wǎng)過濾，使用美國BD公司生產(chǎn)FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。Bregs細(xì)胞水平以Bregs細(xì)胞占CD19＋B比例進(jìn)行表示。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)血清IL-10和TGF-β1水平

抽取所有研究對(duì)象清晨靜脈血5 ml，離心后取血清置于-70℃冰箱中保存待檢；采取ELISA法檢測(cè)血清IL-10和TGF-β1水平，于檢測(cè)TGF-β1之前對(duì)血清進(jìn)行酸化處理，以激活血清中的TGF-β1，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.3 治療方法 病例組所有患者均給予醋酸潑尼松聯(lián)合硫酸羥氯喹治療，醋酸潑尼松片 （許昌奧森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H41021232）口服，每天1次，每次5～10 mg；硫酸羥氯喹片 （上海中西制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H19990264）口服，每天1次，每次0.2 g；治療4周后再次檢測(cè)外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10和TGF-β1水平。

1.3 觀察指標(biāo) 比較2組研究對(duì)象外周血Bregs細(xì)胞水平及血清IL-10和TGF-β1水平，比較病例組不同臨床特征患者外周血Bregs細(xì)胞水平，比較治療前后外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10和TGF-β1水平，分析治療前外周血Bregs細(xì)胞水平與血清IL-10、TGF-β1水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用方差分析、q檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組研究對(duì)象外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 病例組外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平均顯著高于對(duì)照組 （P＜0.01）， 見表1。

表1 2組研究對(duì)象外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

表1 2組研究對(duì)象外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

組別 n Bregs （%） IL-10 （pg／ml） TGF-β1 （pg／ml）對(duì)照組 30 1.34±0.67 27.45±7.62 12.05±4.37病例組 36 4.69±1.83 53.89±14.43 17.86±7.49 t值 10.206 9.033 3.924 P值 0.000 0.000 0.000

2.2 不同臨床特征干燥綜合征患者外周血Bregs細(xì)胞水平比較 抗SSA抗體、抗SSB抗體陽性患者外周血Bregs細(xì)胞水平均顯著高于抗SSA抗體、抗SSB抗體陰性患者 （P＜0.05）；不同年齡、性別、ESSDAI評(píng)分以及有無系統(tǒng)損傷患者之間外周血Bregs細(xì)胞水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）， 見表 2。

表2 不同臨床特征患者外周血Bregs細(xì)胞水平比較 （±s）

表2 不同臨床特征患者外周血Bregs細(xì)胞水平比較 （±s）

指標(biāo) n Bregs（%） 統(tǒng)計(jì)值 P值年齡 （歲）≥60 14 4.86±1.94 0.501 0.620＜60 22 4.53±1.92性別男4 4.89±1.89 0.349 0.729女32 4.63±1.95 ESSDAI評(píng)分 （分）0～2 11 4.12±1.79 1.134 0.273 3～5 22 4.65±1.84 6～8 3 5.26±2.06系統(tǒng)損傷有24 5.21±1.97 1.129 0.267無12 4.48±1.49抗SSA抗體陽性 20 5.34±1.68 2.207 0.034陰性 16 4.07±1.76抗SSB抗體陽性 10 5.48±1.79 2.256 0.030陰性 26 4.03±1.57

2.3 干燥綜合征患者治療前后外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 治療4周后，干燥綜合征患者外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平均顯著低于治療前 （P＜0.01）， 見表 3。

2.4 干燥綜合征患者治療前外周血Bregs細(xì)胞水平與血清 IL-10、TGF-β1水平的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血Bregs細(xì)胞水平與血清IL-10、TGF-β1水平均呈正相關(guān) （r分別為 0.589、 0.004，P＜0.05）。

表3 干燥綜合征患者治療前后外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

表3 干燥綜合征患者治療前后外周血Bregs細(xì)胞水平和血清IL-10、TGF-β1水平比較 （±s）

組別 n Bregs （%） IL-10 （pg／ml） TGF-β1 （pg／ml）治療前 36 4.69±1.83 53.89±14.43 17.86±7.49治療后 36 2.79±1.26 31.09±12.38 13.46±4.58 t值 5.131 8.924 3.007 P值 0.000 0.000 0.004

3 討論

干燥綜合征是一種累及機(jī)體外分泌腺體，主要是以侵犯淚腺以及唾液腺為主的自身免疫性疾病，多見于中老年女性，對(duì)患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。干燥綜合征病理特征為唾液腺以及淚腺等外分泌腺體中IgG型漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞大量浸潤為特點(diǎn)，進(jìn)而引起外分泌腺功能障礙，患者臨床表現(xiàn)為眼干、口干等，部分患者還會(huì)出現(xiàn)臟器與系統(tǒng)損傷。干燥綜合征病因及發(fā)病機(jī)制目前并未完全明確，研究認(rèn)為該病的發(fā)生與多種細(xì)胞因子異常釋放相關(guān)［8］。干燥綜合征起病緩慢，在診斷時(shí)容易出現(xiàn)漏診誤診，臨床中該病主要以對(duì)癥治療為主，延緩病情發(fā)展，改善口干、眼干等臨床癥狀。

部分學(xué)者認(rèn)為，機(jī)體中B淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)的體液免疫，可以產(chǎn)生多種免疫復(fù)合物、多克隆免疫球蛋白以及自身抗體，造成外分泌腺破壞以及多系統(tǒng)損害［9］。Bregs可以通過分泌多種細(xì)胞因子，間接或者直接作用于其他免疫細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。本研究中，病例組外周血Bregs水平顯著高于健康對(duì)照組，這與相關(guān)研究結(jié)果［10］一致，說明Bregs可能參與了干燥綜合征的發(fā)病過程。進(jìn)一步對(duì)不同臨床特征患者外周血Bregs細(xì)胞水平分析發(fā)現(xiàn)，不同年齡、性別患者之間，外周血Bregs細(xì)胞水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而且在不同ESSDAI評(píng)分以及有無系統(tǒng)損傷患者之間，外周血Bregs細(xì)胞水平比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Bregs可能與干燥綜合征疾病活動(dòng)并無密切關(guān)系?？筍SA抗體、抗SSB抗體陽性患者外周血Bregs細(xì)胞水平均顯著高于抗SSA抗體、抗SSB抗體陰性患者，說明干燥綜合征患者Bregs細(xì)胞水平異?？赡芘c免疫功能紊亂有密切關(guān)系［11］。

研究指出，Bregs水平在干燥綜合征患者及健康人當(dāng)中，具有減輕CD4＋T細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用［12］。本研究中，治療4周之后，干燥綜合征患者外周血Bregs表達(dá)水平較治療前顯著降低。經(jīng)過治療之后，Bregs相應(yīng)減少，機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)減輕，患者免疫調(diào)節(jié)功能改善，病情得到緩解。Bregs可以分泌抑制性細(xì)胞因子TGF-β1以及IL-10，在介導(dǎo)免疫耐受以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答當(dāng)中具有重要作用。Bregs通過分泌TGF-β1可以促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，減少與炎癥相關(guān)的CD8＋T細(xì)胞的數(shù)量，減少效應(yīng)性T細(xì)胞上T細(xì)胞抗原受體的表達(dá)數(shù)量，削弱輔助T細(xì)胞的活化，抑制自身免疫性疾病的進(jìn)展。IL-10能夠有效地抑制炎癥因子釋放及T細(xì)胞增殖，對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化或者維持起到重要作用［13］。本研究中，外周血 Bregs表達(dá)水平與血清IL-10、TGF-β1水平均呈顯著正相關(guān)性，說明Bregs可能通過分泌TGF-β1及IL-10影響機(jī)體其他免疫細(xì)胞，即發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，從而維持自身免疫耐受。

綜上所述，干燥綜合征患者外周血Bregs表達(dá)水平顯著升高，可能與干燥綜合征的發(fā)病有一定關(guān)系，且患者Bregs表達(dá)水平異?？赡芘c自身免疫功能紊亂有關(guān)，但Bregs表達(dá)水平與干燥綜合征的疾病活動(dòng)無直接相關(guān)性。