大蔥油對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響

趙璐，馮金歌，付佳，汪亞倫，鄒鵬

（沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，遼寧 沈陽 110034）

目前結(jié)腸癌是臨床上最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)生于直腸與乙狀結(jié)腸交界處。在全球惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率分別位于第四、二位［1］，是一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤。臨床上對結(jié)腸癌的治療方法主要采用放療、手術(shù)及中藥輔助化療綜合治療方法。但是化療不僅抑制腫瘤細胞的增殖并殺死腫瘤細胞，對正常細胞也會產(chǎn)生一定的損害。根治性手術(shù)后5年生存率僅有50%左右［2］。因此對高效低毒的天然抗腫瘤藥物的需求極為迫切。大蔥 （Allium fistulosum（L.）var.giganteum）屬百合科，是多年生草本植物， 黃雪松［3］采用氣相色譜／質(zhì)譜 （GC／MS） 法鑒定揮發(fā)油中化學成分，主要含有含硫化合物、不飽和脂肪酸、萜烯類化合物等，所鑒定出來的化合物成分約占其總含量的90%。研究發(fā)現(xiàn)大蔥油具有潛在的抗腫瘤作用［4］，大蔥油能夠誘導人肺癌A549細胞G2／M期阻滯，誘導細胞凋亡，同時還能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)活性氧和線粒體膜電位［5］。Belman等［6］研究發(fā)現(xiàn)，與大蔥油同屬的洋蔥和大蒜素能夠抑制小鼠皮膚腫瘤細胞的增殖。但大蔥油對人結(jié)腸癌細胞作用的研究較少。本實驗以人結(jié)腸癌SW480細胞為研究對象，觀察大蔥油作用后對人結(jié)腸癌細胞增殖及侵襲的影響，并初步探討大蔥油抑制結(jié)腸癌細胞增殖及侵襲的作用機制，為進一步探討中藥復方多靶點、多方位治療腫瘤提供理論依據(jù)，為臨床治療結(jié)腸癌尋找新藥物。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 正常人結(jié)腸細胞CCD-18Co和結(jié)腸癌細胞系SW480購自美國ATCC公司。噻唑藍 （MTT）購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 （FBS）購自美國Gibco公司；青鏈霉素雙抗、二甲基亞砜 （DMSO）、胰蛋白酶購自美國Sigma公司；細胞全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；抗體Cyclin D1、CDK4、CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑、ECL發(fā)光試劑購自上海碧云天生物科技有限公司；SuperScriptⅢ試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱 （Thermo Forma SeriesⅡ）；倒置顯微鏡XSZ-DZ（重慶光學儀器廠）；電熱恒溫水箱 （中國恒科公司）；超凈工作臺 （北京半導體設備廠）；紫外吸收光度儀、Western blot及轉(zhuǎn)膜設備 （美國 BioRad公司）；流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）；液氮運輸儲存罐（東亞機電工貿(mào)有限公司）；顯影機 （日本柯達公司）；StepOne型號熒光定量PCR儀 （美國AB Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 大蔥油制備 取當?shù)責o農(nóng)藥污染的新鮮大蔥去皮和葉，取蔥白，用常壓蒸餾法和水醇法提取大蔥油。100℃、流通蒸汽滅菌30 min，避光保存，采用DMSO稀釋成各種所需濃度備用。

1.3.2 細胞培養(yǎng)及分組 將CCD-18Co和SW480細胞培養(yǎng)于含10%FBS DMEM培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期進行實驗。將細胞分為DMSO的陰性對照組和大蔥油（25、 50、 100 μg／ml） 組。

1.3.3 MMT實驗 將消化后的細胞制成2×104個／ml細胞懸液， 按 100μl／孔接種于 96孔板中，每孔加入20μl MTT后，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，水平震蕩10 min后，酶標儀測定波長為490 nm的吸光度值。以吸光度值代表細胞數(shù)目。

1.3.4 流式細胞儀檢測細胞周期分布 將SW480細胞以5×106個／ml接種于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，換實驗用培養(yǎng)基 （分組同上），48 h后，用冰PBS洗滌2次、離心收集細胞。用預冷70%乙醇固定4℃過夜，PBS洗滌3次后加入1 mg／ml PI染液，室溫避光孵育30 min后，以5×106個／ml上樣流式細胞儀，檢測細胞周期分布。

1.3.5 Annexin V-FITC／PI雙標檢測細胞凋亡采用DMSO和50、100μg／ml大蔥油處理 SW480細胞24 h，消化離心，收集各組細胞，用0.01 mol／L PBS （pH 7.3） 輕洗2 次； 1 000 r／min 離心5 min，棄上清，用500μl膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5μl Annexin V-FITC避光染色10 min，再加入10μl PI于室溫下避光孵育5 min；上流式細胞儀檢測熒光強度，分析細胞凋亡百分率。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測細胞Cyclin D1、CDK4、 CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、MMP9、LIMK1和Cofilin基因表達 收集各組處理 24 h后的細胞，4℃ 500 r／min離心3 min收集細胞，按 TRizol試劑說明書抽提總RNA，按SuperScriptⅢ試劑盒說明書合成第一條鏈cDNA，以合成的cDNA為模版，進行實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR中的引物序列見表1。反應參數(shù)：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，60℃ 15 s循環(huán)40次，60℃延伸1 min。

表1 實時熒光定量PCR中的引物序列

1.3.7 Western blot法檢測細胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、 Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3蛋白的表達 將SW480細胞以5×106個／ml接種于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，換實驗用培養(yǎng)基 （分組同上），48 h后，4℃ 500 r／min離心3 min收集細胞，用PBS洗滌2次。然后按照細胞全蛋白提取試劑盒說明書進行全蛋白提取，并以Bradford法測定蛋白濃度后-70℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?5%SDS-PAGE分離40μg全蛋白，電轉(zhuǎn)至NC膜，用TBST配置5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶2 000稀釋的抗體 Cyclin D1、 CDK4、 CDK6、Bcl-2、 Bax、 Caspase-9、 Caspase-3、 MMP2、MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、 Cofilinp-Ser3，4℃孵育過夜，然后取出NC膜，TBST室溫洗3次，每次5 min。加入二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。在暗室里，按照1∶1的比例混合發(fā)光底物A、B液。取出膜放入Bio-Rad顯像儀。保存圖片并使用Quantity One分析軟件對圖像灰度進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大蔥油對結(jié)腸癌SW480細胞增殖的抑制作用

MTT法檢測大蔥油對CCD-18Co和SW480細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與正常人結(jié)腸細胞CCD-18Co組結(jié)果相比，大蔥油對SW480細胞的生長具有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性 （P＜0.01）（圖1A、B）。大蔥油作用SW480細胞24 h的最佳藥物濃度為 100 μg／ml。 100 μg／ml大蔥油作用于CCD-18Co和SW480細胞24 h，結(jié)果顯示大蔥油對SW480細胞組的細胞抑制率顯著高于CCD-18Co組 （P＜0.01） （圖 1C）。

2.2 大蔥油作用后SW480細胞周期受阻 流式細胞儀檢測結(jié)果所示，與對照組相比，不同濃度的大蔥油作用24 h后，SW480細胞停滯在G2／M期（P＜0.01），見圖2A。并且，大蔥油的作用濃度越高，阻滯在G2／M期的細胞比例越高。結(jié)果顯示，大蔥油誘導SW480細胞的阻滯在G2／M期。同時，實時熒光定量PCR和Western blot法結(jié)果見圖2B、C，分別采用DMSO和25、50、100μg／ml大蔥油作用SW480細胞24 h后，分別檢測周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6的基因及蛋白表達，大蔥油能夠抑制Cyclin D1、CDK4和CDK6的基因及蛋白表達，且隨著大蔥油濃度的升高抑制作用逐漸顯著。

2.3 Annexin V-FITC／PI雙染檢測大蔥油對SW480細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC／PI雙染檢測結(jié)果顯示，隨著大蔥油作用濃度的增加，SW480細胞凋亡率顯著升高，濃度越高，誘導細胞凋亡的作用越明顯，見圖3A。同時，實時熒光定量PCR和Western blot法檢測結(jié)果見圖3B、C所示，分別采用DMSO和25、50、100μg／ml大蔥油作用SW480細胞24 h后，分別檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因及蛋白表達，大蔥油能夠抑制Bcl-2的基因及蛋白表達，促進Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因及蛋白表達，且隨著大蔥油濃度的提高抑制和促進作用逐漸顯著，且呈濃度依賴性。

圖1 大蔥油作用對結(jié)腸癌SW480細胞增殖能力的影響

2.4 大蔥油對SW480細胞侵襲的影響 分別采用DMSO和25、50、100μg／mL大蔥油作用 SW480細胞24 h后，分別檢測與細胞侵襲相關(guān)蛋白MMP2、 MMP9、 LIMK1、 LIMK1p-Thr508、 Cofilin、Cofilinp-Ser3的基因及蛋白表達。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與DMSO組比較，隨著給藥濃度的逐漸增加，MMP2、MMP9的基因表達量明顯受到抑制 （P＜0.01）， 而LIMK1、Cofilin的基因的表達量差異無統(tǒng)計學意義。Western blot結(jié)果顯示，與DMSO組比較，隨著大蔥油濃度的逐漸增加，MMP2、 MMP9、 LIMK1p-Thr508、 Cofilinp-Ser3蛋白表達量明顯受到抑制 （P＜0.01）；LIMK1和 Cofilin的磷酸化水平顯著降低，而LIMK1和Cofilin蛋白表達量沒有顯著下降，大蔥油抑制LIMK1、Cofilin磷酸化。見圖4。

3 討論

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活習慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變，增加了結(jié)腸癌的患病風險，目前其發(fā)病率和致死率在國內(nèi)外均有上升的趨勢，早期結(jié)腸癌5年的生存率大約為90%，但是一旦發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移其生存率僅為15%，盡管近些年來研發(fā)出許多早期診斷和治療的方法，但是這種現(xiàn)象沒有得到改善，而且出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥是治療失敗的主要原因，嚴重威脅人類健康［7］。因此，尋找能預防和治療結(jié)腸癌的新藥非常必要。

圖2 大蔥油對SW480細胞周期的影響

圖3 大蔥油作用對結(jié)腸癌SW480細胞凋亡的影響

圖4 大蔥油對SW480細胞侵襲的影響

近年來，人們致力于尋求抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移侵襲的天然藥物，因為其可降低化療藥物的毒副作用，增強化療藥物的抗癌作用。實驗研究發(fā)現(xiàn)，鮮大蔥可能通過降低胃液中亞硝酸鹽含量，從而降低患胃癌風險［8］，但大蔥油對結(jié)腸癌的作用尚未引起人們的高度重視。

本研究結(jié)果表明大蔥油可抑制結(jié)腸癌細胞SW480的增殖，而這種抑制作用是通過停滯細胞周期和誘導細胞凋亡來實現(xiàn)的。大蔥油處理的SW480細胞中，與細胞周期進程相關(guān)蛋白 （Cyclin D1、CDK4和 CDK6）和與細胞凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、 Bax、 Caspase-9和Caspase-3） 表達呈現(xiàn)顯著變化，結(jié)果提示，大蔥油的抗癌效果是通過對一些腫瘤生物學途徑如細胞周期進程和細胞凋亡途徑等發(fā)揮多重作用來實現(xiàn)的。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個主動過程，癌細胞通過運動穿破宿主結(jié)締組織、血管、淋巴管壁，從而進入體液循環(huán)，再穿破結(jié)締組織、血管、淋巴管壁在靶器官定位形成轉(zhuǎn)移灶。MMPs是一類能降解細胞外基質(zhì)和血管基底膜的蛋白水解酶，還能夠調(diào)節(jié)血管生長因子的作用，所以在腫瘤生長轉(zhuǎn)移和血管生成的過程中發(fā)揮重要作用。MMP2和MMP9能夠特異性地降解細胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分Ⅳ型膠原，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移［9-10］。此外，LIM激酶 （LIMK）能夠參與細胞周期進展、腫瘤新生血管生成及腫瘤細胞侵襲、遷移、增殖等多種行為［11-12］。 絲切蛋白 （Cofilin） 在多種人類腫瘤中高表達，尤其在高侵襲性腫瘤中高表達，參與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，提示其可作為預測惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在標記物［13］。本文檢測了大蔥油對結(jié)腸癌細胞SW480侵襲、遷移能力的影響，當SW480細胞采用不同濃度的大蔥油處理后，與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白表達都會顯著下調(diào)，提示大蔥油能夠抑制SW480細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，大蔥油對人結(jié)腸癌SW480細胞有顯著的抗腫瘤活性，主要通過阻滯G2／M期，抑制結(jié)腸癌細胞周期進程，抑制細胞增殖，同時抑制SW480細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。因此，大蔥油可以作為治療人結(jié)腸癌的有效藥物，同時為開發(fā)一種抗腫瘤藥物或藥物前體提供一定參考。本研究也將繼續(xù)深入研究大蔥油抗結(jié)腸癌的作用機制，為靶向防治結(jié)腸癌的藥物和高效低毒的創(chuàng)新藥物研發(fā)提供科學依據(jù)。