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    文冠果組織培養(yǎng)無菌體系的建立

    2020-06-17 04:42:16王斯彤
    遼寧林業(yè)科技 2020年2期
    關鍵詞:污染生長

    王斯彤

    (1.遼寧省沙地治理與利用研究所,遼寧 阜新 123000;2.遼寧章古臺科爾沁沙地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站,遼寧 阜新 123000)

    文冠果Xanthocerassorbifolia為無患子科文冠果屬多年生木本植物,素有“千花一果”之稱。文冠果是中國特有的溫帶木本油料植物[1],由于其種子和種仁都具有較高的含油量,因此也被譽為“北方油茶”[2]。作為落葉喬木或灌木的文冠果具有根系發(fā)達、萌蘗力強的特點,可廣泛用于固沙造林、綠化荒山[3],是良好的水土保持樹種。由于對文冠果需求和利用量不斷增加,如何提高其產(chǎn)量迫在眉睫。目前,文冠果的主要繁殖方式為種子繁殖,但其種子發(fā)芽率僅為6%[4],且種子繁殖的弊端在于個體性狀差異顯著,子代很難保持親本的優(yōu)良性狀,而嫁接繁殖成功率較低,人工費用較高。因此,通過研究文冠果組織培養(yǎng)及器官再生,可以從根本上解決種源不足的問題,快速繁殖文冠果苗,提高產(chǎn)量并保持個體優(yōu)良性狀[5-6]。

    目前,已有利用文冠果無性器官進行離體培養(yǎng)研究的報道,柳金鳳等[6]采用文冠果莖段及種子萌發(fā)獲得的嫩莖作為外植體進行組織培養(yǎng),成功獲得無菌苗;宋群雁[7]等用文冠果葉片作外植體進行離體培養(yǎng),成功獲得生根苗。雖然目前通過離體培養(yǎng)方式能夠獲得無菌苗,但為實現(xiàn)工廠化育苗及降低工廠化育苗成本,需要對整個無菌體系進行優(yōu)化。

    本研究以章古臺地區(qū)篩選獲得的文冠果優(yōu)系4號莖段為外植體,通過器官直接發(fā)生途徑對不定芽進行誘導,對不定芽誘導的無菌體系建立進行系統(tǒng)研究,為文冠果快速繁殖建立系統(tǒng)的無菌體系,為文冠果組培苗增殖和生根研究提供豐富材料。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    以文冠果優(yōu)系4號嫁接苗1年生莖段為外植體。一般5月中旬,在章古臺地區(qū)采集生長良好、無病蟲害的新萌發(fā)枝條,每隔15 d采集1次外植體,直至1年生枝條完全木質(zhì)化。采回的枝條去除葉片,放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 方 法

    1.2.1 外植體預處理

    將枝條剪成長約2.5 cm帶腋芽或頂芽的小段,去除葉片,加少量洗衣粉并用軟刷清洗表面雜質(zhì),將莖段置于廣口瓶中用流水沖洗1~2 h,用蒸餾水沖洗6次,放在超凈工作臺上備用。

    1.2.2 消毒時間優(yōu)化

    先用75%乙醇20 s消毒2次,然后用無菌水沖洗2次,用0.1%HgCl2分別消毒3、6、9、12 min,用2%NaClO消毒5、10、15、20 min,再用無菌水震蕩清洗3次。將處理后的莖段切除底端和頂端,每個小莖段上留1個腋芽,最后將莖段在無菌操作下接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個處理重復3次,共接種30個莖段。接種后4周記錄污染率和萌發(fā)率。

    1.2.3 外植體最佳取材時間

    選擇生長健壯、無明顯病蟲害的文冠果優(yōu)系4號,以當年萌發(fā)的莖段作為外植體,分別于5、6、7、8、9、10月采集,每隔15 d采集1次。采后的莖段去葉沖洗后置于超凈工作臺上備用。先用75%乙醇20 s消毒2次,再用0.1%HgCl2消毒9 min,無菌水沖洗6次。消毒后的莖段用無菌濾紙吸干表面水漬,切去頂端和底端,保留1個腋芽,將莖段接種到DKW培養(yǎng)基中,每瓶2個莖段,每次接種40瓶,接種后4周記錄污染率和萌發(fā)率。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    采用Excel 2007處理數(shù)據(jù)并作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同消毒試劑對外植體的消毒效果

    從表1可以看出,消毒效果最好的處理是0.1% HgCl2消毒12 min,污染率49.3%;雖然0.1% HgCl2消毒9 min的污染率54.4%,但萌發(fā)率最高35.6%。可以得出,雖然增加消毒時間可以降低污染率,但處理時間過長,會對萌發(fā)造成影響。2%NaClO對文冠果莖段有一定的消毒作用,但消毒效果和萌發(fā)率都不如0.1%HgCl2,因此0.1%HgCl2更適合用于文冠果莖段消毒處理。

    表1 不同消毒試劑的消毒效果

    2.2 取材時期對外植體污染率和萌發(fā)率的影響

    不同取材時期對外植體消毒和誘導影響很大,如圖1所示,污染率在5月偏高,6、7月較低,8、9、10月逐漸上升,且外植體表面會有絨毛狀菌絲,難以通過表面消毒而抑制細菌的滋生。而萌發(fā)率在5月較低,6、7月逐漸升高,且萌發(fā)的組培苗生長健壯;8、9、10月萌發(fā)率逐漸下降。因此,文冠果最好在6-7月采集莖段。

    圖1 不同取材時期對污染率及萌發(fā)率的影響

    3 結(jié) 論

    章古臺地區(qū)春季風沙較大,導致長期暴露在野外的文冠果枝條表面有較多雜質(zhì)和細菌,且莖段皮孔多,頂芽及腋芽周圍滋生大量細菌,極易造成污染,且難以徹底消除,有的細菌甚至滲透到組織內(nèi)部,因此文冠果莖段的滅菌處理成功與否會直接影響后續(xù)試驗的成敗。在文冠果組織培養(yǎng)時不僅選擇消毒效果好的消毒試劑,還得掌握消毒時間,消毒時間短易造成滅菌不徹底,污染率高,而消毒時間過長,則會給外植體的生長造成損傷,影響誘導率。

    本試驗使用75%乙醇、0.1%HgCl2、2%NaClO對外植體進行消毒,設置不同滅菌時間,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過75%酒精20 s消毒2次,0.1%HgCl2消毒9 min,能有效降低污染率,獲得較高萌發(fā)率,且獲得的組培苗生長健壯。

    除了消毒試劑和消毒時間對外植體污染的影響外,選擇合適的采條時間也很重要。通常情況下,春季和夏季,天氣晴朗,植株生長旺盛,外植體生長活性強,所攜帶的微生物相對較少,滅菌相對容易。而秋季莖段已木質(zhì)化,植株的代謝活動也相對減弱,活力降低,自身攜帶的微生物也較多,污染率較高。試驗發(fā)現(xiàn),在6-7月份取材效果最好,不僅污染率低且組培苗生長狀態(tài)好。

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