文冠果組織培養(yǎng)無菌體系的建立

王斯彤

(1.遼寧省沙地治理與利用研究所，遼寧 阜新 123000;2.遼寧章古臺科爾沁沙地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，遼寧 阜新 123000)

文冠果Xanthocerassorbifolia為無患子科文冠果屬多年生木本植物，素有“千花一果”之稱。文冠果是中國特有的溫帶木本油料植物[1]，由于其種子和種仁都具有較高的含油量，因此也被譽為“北方油茶”[2]。作為落葉喬木或灌木的文冠果具有根系發(fā)達、萌蘗力強的特點，可廣泛用于固沙造林、綠化荒山[3]，是良好的水土保持樹種。由于對文冠果需求和利用量不斷增加，如何提高其產(chǎn)量迫在眉睫。目前，文冠果的主要繁殖方式為種子繁殖，但其種子發(fā)芽率僅為6%[4]，且種子繁殖的弊端在于個體性狀差異顯著，子代很難保持親本的優(yōu)良性狀，而嫁接繁殖成功率較低，人工費用較高。因此，通過研究文冠果組織培養(yǎng)及器官再生，可以從根本上解決種源不足的問題，快速繁殖文冠果苗，提高產(chǎn)量并保持個體優(yōu)良性狀[5-6]。

目前，已有利用文冠果無性器官進行離體培養(yǎng)研究的報道，柳金鳳等[6]采用文冠果莖段及種子萌發(fā)獲得的嫩莖作為外植體進行組織培養(yǎng)，成功獲得無菌苗；宋群雁[7]等用文冠果葉片作外植體進行離體培養(yǎng)，成功獲得生根苗。雖然目前通過離體培養(yǎng)方式能夠獲得無菌苗，但為實現(xiàn)工廠化育苗及降低工廠化育苗成本，需要對整個無菌體系進行優(yōu)化。

本研究以章古臺地區(qū)篩選獲得的文冠果優(yōu)系4號莖段為外植體，通過器官直接發(fā)生途徑對不定芽進行誘導，對不定芽誘導的無菌體系建立進行系統(tǒng)研究，為文冠果快速繁殖建立系統(tǒng)的無菌體系，為文冠果組培苗增殖和生根研究提供豐富材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以文冠果優(yōu)系4號嫁接苗1年生莖段為外植體。一般5月中旬，在章古臺地區(qū)采集生長良好、無病蟲害的新萌發(fā)枝條，每隔15 d采集1次外植體，直至1年生枝條完全木質(zhì)化。采回的枝條去除葉片，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 外植體預處理

將枝條剪成長約2.5 cm帶腋芽或頂芽的小段，去除葉片，加少量洗衣粉并用軟刷清洗表面雜質(zhì)，將莖段置于廣口瓶中用流水沖洗1～2 h，用蒸餾水沖洗6次，放在超凈工作臺上備用。

1.2.2 消毒時間優(yōu)化

先用75%乙醇20 s消毒2次，然后用無菌水沖洗2次，用0.1%HgCl2分別消毒3、6、9、12 min，用2%NaClO消毒5、10、15、20 min，再用無菌水震蕩清洗3次。將處理后的莖段切除底端和頂端，每個小莖段上留1個腋芽，最后將莖段在無菌操作下接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每個處理重復3次，共接種30個莖段。接種后4周記錄污染率和萌發(fā)率。

1.2.3 外植體最佳取材時間

選擇生長健壯、無明顯病蟲害的文冠果優(yōu)系4號，以當年萌發(fā)的莖段作為外植體，分別于5、6、7、8、9、10月采集，每隔15 d采集1次。采后的莖段去葉沖洗后置于超凈工作臺上備用。先用75%乙醇20 s消毒2次，再用0.1%HgCl2消毒9 min，無菌水沖洗6次。消毒后的莖段用無菌濾紙吸干表面水漬，切去頂端和底端，保留1個腋芽，將莖段接種到DKW培養(yǎng)基中，每瓶2個莖段，每次接種40瓶，接種后4周記錄污染率和萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒試劑對外植體的消毒效果

從表1可以看出，消毒效果最好的處理是0.1% HgCl2消毒12 min，污染率49.3%；雖然0.1% HgCl2消毒9 min的污染率54.4%，但萌發(fā)率最高35.6%。可以得出，雖然增加消毒時間可以降低污染率，但處理時間過長，會對萌發(fā)造成影響。2%NaClO對文冠果莖段有一定的消毒作用，但消毒效果和萌發(fā)率都不如0.1%HgCl2，因此0.1%HgCl2更適合用于文冠果莖段消毒處理。

表1 不同消毒試劑的消毒效果

2.2 取材時期對外植體污染率和萌發(fā)率的影響

不同取材時期對外植體消毒和誘導影響很大，如圖1所示，污染率在5月偏高，6、7月較低，8、9、10月逐漸上升，且外植體表面會有絨毛狀菌絲，難以通過表面消毒而抑制細菌的滋生。而萌發(fā)率在5月較低，6、7月逐漸升高，且萌發(fā)的組培苗生長健壯；8、9、10月萌發(fā)率逐漸下降。因此，文冠果最好在6-7月采集莖段。

圖1 不同取材時期對污染率及萌發(fā)率的影響

3 結(jié) 論

章古臺地區(qū)春季風沙較大，導致長期暴露在野外的文冠果枝條表面有較多雜質(zhì)和細菌，且莖段皮孔多，頂芽及腋芽周圍滋生大量細菌，極易造成污染，且難以徹底消除，有的細菌甚至滲透到組織內(nèi)部，因此文冠果莖段的滅菌處理成功與否會直接影響后續(xù)試驗的成敗。在文冠果組織培養(yǎng)時不僅選擇消毒效果好的消毒試劑，還得掌握消毒時間，消毒時間短易造成滅菌不徹底，污染率高，而消毒時間過長，則會給外植體的生長造成損傷，影響誘導率。

本試驗使用75%乙醇、0.1%HgCl2、2%NaClO對外植體進行消毒，設置不同滅菌時間，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過75%酒精20 s消毒2次，0.1%HgCl2消毒9 min，能有效降低污染率，獲得較高萌發(fā)率，且獲得的組培苗生長健壯。

除了消毒試劑和消毒時間對外植體污染的影響外，選擇合適的采條時間也很重要。通常情況下，春季和夏季，天氣晴朗，植株生長旺盛，外植體生長活性強，所攜帶的微生物相對較少，滅菌相對容易。而秋季莖段已木質(zhì)化，植株的代謝活動也相對減弱，活力降低，自身攜帶的微生物也較多，污染率較高。試驗發(fā)現(xiàn)，在6-7月份取材效果最好，不僅污染率低且組培苗生長狀態(tài)好。