蝸牛黏液多糖的提取、表征及抗氧化性和免疫活性

王慧陽，秦 靖，莊 丹，劉春堯，張 藝，張立慧，呂廣萍，3

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800； 2.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

蝸牛(Achatinafulica)，屬軟體動物腹足綱，爬行時足腺可以分泌大量黏液[1]。蝸牛黏液是一種獨特而復(fù)雜的保護(hù)性分泌物，呈黏稠狀態(tài)[2]。藥理學(xué)研究表明：其具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗癌[3]和許多其他生物活性[4]，已被用于護(hù)膚、愈合切割及劃痕，還有治療牙齦炎的作用[5]。蝸牛黏液包含多種生物活性物質(zhì)如肽[4]、天然尿囊素、維生素[6]、鈣[5]、多糖[7]及其配合物[8]。其中，多糖及其配合物包括凝集素(糖蛋白)[9]和硫酸肝素(糖胺聚糖)，已被證明有鎮(zhèn)痛、抗癌、促進(jìn)傷口愈合和抗菌的生物活性[1,3-4,10]。實際上，多糖已被認(rèn)為是其生物活性的新型功能組分，而多糖的生物活性與其理化性質(zhì)密切相關(guān)[11]。迄今為止，蝸牛黏液的化學(xué)研究主要集中在肽和糖蛋白上，特別是對抗菌肽的純化和表征方面[3,10,12-13]。目前，蝸牛軟體多糖已有被分離、純化和表征的報道[14-15]，但據(jù)了解，蝸牛黏液多糖尚未被分離，其結(jié)構(gòu)和活性也尚未被研究。

本研究中，筆者從蝸牛黏液中提取水溶性多糖。通過高效凝膠色譜串聯(lián)紫外、示差和多角度激光散射檢測器(HPSEC-UV-RI-MALLS)、紅外光譜(FT-IR)和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)表征蝸牛多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽自由基(ABTS·+)清除實驗和羥基自由基(·OH)清除實驗來評價蝸牛多糖抗氧化活性，并研究了蝸牛黏液多糖對小鼠巨噬細(xì)胞的作用，以評估其免疫調(diào)節(jié)活性。本研究旨在進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用蝸牛黏液的多糖，為更深入研究蝸牛黏液多糖的生理活性及其構(gòu)效關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持，以期對蝸牛黏液多糖在藥品及食品領(lǐng)域中的開發(fā)利用提供實驗及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

蝸牛黏液，浙江嘉興潛福食品有限公司。小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 實驗儀器

純水儀，美國Aquapro公司；臺式離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Micro21型高速冷凍離心機(jī)、1510型酶標(biāo)儀、傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO公司；KH-500DE型超聲清洗儀，江蘇昆山超聲儀器有限公司；氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)，美國GE公司；DAWN HELEOS多角度激光散射儀，美國懷亞特公司；RefractoMax 520型示差檢測器，美國ERC公司；7890氣相色譜儀連用5975C型質(zhì)譜檢測器，美國Aglient公司；NovoCyte 2060R型流式細(xì)胞儀，美國ACEA公司。

1.1.3 實驗藥品

D-核糖(D-Rib)、L-鼠李糖(L-Rha)、D-阿拉伯糖(D-Ara)、D-木糖(D-Xyl)、D-巖藻糖(D-Fuc)、D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)、D-甘露醇(D-Ma-ol)，異硫氰酸熒光素綴合的葡聚糖(FITC-葡聚糖40000)，Sigma公司；普通高糖培養(yǎng)基DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗，美國Gibco公司；格里斯試劑，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒，南京迪兆生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝸牛黏液多糖的提取

量取蝸牛黏液10 mL，3 000 r/min離心10 min以除去雜質(zhì)，然后加入4倍體積的95%乙醇，在4 ℃下靜置12 h。再次3 000 r/min離心10 min，收集沉淀，并用正丁醇和丙酮洗滌沉淀物以脫脂，然后用N2吹干。將干燥的樣品加入10 mL水中充分溶解并用Sevag試劑(正丁醇和氯仿體積比為1∶ 4，)處理以除去蛋白質(zhì)[16]。收集上清液冷凍干燥，最后得到蝸牛黏液多糖的干燥粉末。

1.2.2 蝸牛黏液多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

1)蝸牛黏液多糖的紅外光譜分析。稱取1 mg干燥樣品，直接在傅里葉紅外光譜儀400～4 000 cm-1的范圍內(nèi)檢測。

2)蝸牛黏液多糖中糖醛酸含量的測定。稱取蝸牛黏液多糖樣品5 mg，置于密封小玻璃樣品瓶中，用2 mol/L三氟乙酸(1 mL)在90 ℃下水解6 h，然后用N2吹至干燥以除去殘余的三氟乙酸。采用硫酸咔唑法測定糖醛酸的含量[12,17]。將250 μL多糖樣品(1.77 mg/mL)和1.5 mL四硼酸鈉溶液混合，在100 ℃下加熱10 min，然后快速冷卻。再向反應(yīng)物中加入50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%咔唑溶液，混合后在100 ℃下加熱15 min，然后立即在冰水中冷卻，1 h后于535 nm下測量其吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(0.1～0.5 mg/mL)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定糖醛酸含量。以上所有測量重復(fù)3次。

3)蝸牛黏液多糖中單糖組成的分析。參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行組成單糖分析。將多糖樣品(5 mg)置于密封小玻璃樣品瓶中，用2 mol/L三氟乙酸(1 mL)在95 ℃下水解6 h。加甲醇去除多余的三氟乙酸溶液，重復(fù)3次，N2吹干。隨后，加入0.5 mL吡啶和10 mg鹽酸羥胺，90 ℃孵育30 min，然后加入0.5 mL乙酸酐，90 ℃孵育30 min。將衍生物用N2吹干，加甲醇，再吹干，重復(fù)3次后用甲醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜，用GC-MS進(jìn)行分析。

GC-MS工作條件：色譜柱為Agilent HP-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；載氣(He)流速為1 mL/min；升溫程序為初始柱溫170 ℃，保持5 min，以5 ℃/min的升溫速度將柱溫升至185 ℃并保持5 min，然后以4 ℃/min升至200 ℃，最后20 ℃/min升至280 ℃保持2 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃；進(jìn)樣量為2 μL；分流比為10∶ 1。

4)蝸牛黏液多糖的甲基化分析。在文獻(xiàn)[19]的基礎(chǔ)上做了少量修改后，對蝸牛黏液多糖進(jìn)行甲基化分析。取5 mg蝸牛黏液多糖，加2 mL二甲亞砜溶液充分溶解，再加10 mg NaOH干燥粉末，超聲20 min；然后加入0.1 mL CH3I，超聲60 min；取出樣品，冷卻至室溫，并加入0.1 mL CH3I，然后再超聲60 min；最后加1 mL去離子水終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物用去離子水透析過夜至無色透明，用N2吹干。隨后，將干燥后的反應(yīng)物重新溶解在1 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA)中，并在95 ℃下水解3 h。最后，將部分甲基化的單糖在室溫下用20 mg/mL NaBH4還原2 h，并用4 mol/L乙酸中和。N2吹干后，將樣品用1 mL吡啶/乙酸酐體積比為(1∶ 1)在95 ℃下乙?；?0 min。乙?；a(chǎn)物吹干，加甲醇，再吹干，重復(fù)3次后用甲醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)樣用GC-MS分析。

GC-MS分析條件：色譜柱為Agilent HP-5MS (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序為初始柱溫140 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升溫速度升至250 ℃，最后以20 ℃/min的升溫速度升至280 ℃，保持4 min；載氣 (He) 流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；進(jìn)樣量為1 μL；分流比為10∶ 1。

5)蝸牛黏液多糖的分子量分布測定。采用HPSEC-UV-RI-MALLS系統(tǒng)對蝸牛黏液多糖進(jìn)行分子量分布的測定[20]。采用SHODEXO HpaK-SB-G-000保護(hù)柱串聯(lián)SHODEXO HpaK-SB-803HQ凝膠滲透色譜柱，流動相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl 溶液，流速為0.5 mL/min。多糖樣品溶液(3 mg，溶于1 mL去離子水)經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)樣100 μL測定。示差折光指數(shù)增量(dn/dc)設(shè)定為0.138 mL/g。紫外吸收波長設(shè)置為260 nm。ASTRA 6.0軟件收集及處理數(shù)據(jù)。

1.2.3 蝸牛黏液多糖的抗氧化活性分析

1)蝸牛黏液多糖的ABTS·+清除能力測定。ABTS·+清除試驗參照文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行測定。以去離子水將ABTS和過硫酸鉀分別溶解為7、4.95 mmol/L，等體積混合，在室溫避光條件下靜置。測定時，將ABTS·+儲備液用0.2 mol/L PBS溶液(pH 7.4) 稀釋，使其在734 nm處吸光度達(dá)(0.7±0.02)，形成ABTS·+測定液。測定時將200 μL ABTS·+測定液和20 μL不同質(zhì)量濃度樣品待測液(10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.313和0.156 mg/mL)加入到96孔板中，振蕩30 s，反應(yīng)6 min后于734 nm處測吸光值A(chǔ)1，以去離子水為空白對照吸光值為A0，樣品吸光值為A2(PBS代替ABTS·+)，不同質(zhì)量濃度Vc(5.00、2.50、1.25、0.625、0.313、0.156和0.078 mg/mL)為陽性對照，每個樣本重復(fù)測定3次，取平均值。ABTS·+清除率按式(1)計算。

ABTS·+清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

(2)

1.2.4 蝸牛黏液多糖的免疫活性測定

1)細(xì)胞培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和100 IU雙抗(青、鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度、37 ℃環(huán)境下生長，取處于生長對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2)蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞NO釋放的影響。參照文獻(xiàn)[19]的方法，選取對數(shù)生長期巨噬細(xì)胞,以每孔200 μL、5×104種植于96孔培養(yǎng)板中,將培養(yǎng)板置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。實驗分為正常對照組、蝸牛黏液多糖組和陽性對照組。正常對照組每孔加入200 μL DMEM培養(yǎng)基，蝸牛黏液多糖組加不同質(zhì)量濃度(1、10、50、100、200和500 μg/mL)的多糖溶液，陽性對照組加1.0 μg/mL脂多糖(LPS)，作用巨噬細(xì)胞24 h后用格里斯試劑與上清液1∶ 1(體積比)反應(yīng)10 min后于540 nm波長下檢測吸光值。NO釋放量用實驗組和空白組之間的比率來表示。

3)蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響。參照文獻(xiàn)[19]的方法，選取對數(shù)生長期巨噬細(xì)胞,以每孔300 μL、2×105種植于24孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。實驗分為正常對照組、蝸牛黏液多糖組、陽性對照組。正常對照組每孔加入300 μL DMEM培養(yǎng)基，蝸牛黏液多糖組加不同質(zhì)量濃度 (0.1、1、10、 50、100和200 μg/mL)的多糖溶液，陽性對照組加1.0 μg/mL LPS，作用巨噬細(xì)胞24 h后，用0.1 mg/mL的FITC-葡聚糖孵育細(xì)胞60 min，隨后用含體積分?jǐn)?shù)為0.2%胎牛血清(FBS)的PBS清洗3次，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移出來后用流式細(xì)胞儀分析。吞噬活性用實驗組和空白組之間的比率來表示。

4)蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響。參照文獻(xiàn)[19]的方法，選取對數(shù)生長期巨噬細(xì)胞，以每孔200 μL、5×104種植于96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。實驗分為正常對照組、蝸牛黏液多糖組和陽性對照組。正常對照組每孔加入200 μL DMEM培養(yǎng)液，蝸牛黏液多糖組加不同質(zhì)量濃度(50和100 μg/mL)多糖溶液，陽性對照組加1.0 μg/mL LPS，作用巨噬細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞上清，于4 ℃下1 000 r/min離心10 min。取上清，采用ExCell Elisa試劑盒，按照生產(chǎn)說明書檢測培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的水平(pg/mL)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2016 software統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用t-test檢驗差異的顯著性，對比顯著以*表示(P<0.05)，極顯著以**表示(P<0.01)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝸牛黏液多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.1.1 蝸牛黏液多糖的紅外光譜分析結(jié)果

圖1 蝸牛黏液多糖的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of A. fulica mucus polysaccharides

2.1.2 蝸牛黏液多糖的單糖組成分析結(jié)果

用咔唑硫酸法對蝸牛黏液多糖的糖醛酸含量進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由圖2可知，回歸方程為Y=6.449 83X+0.050 75,R2=0.999 4。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算,得蝸牛黏液多糖含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.1%的糖醛酸。

圖2 半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of galacturonic acid

蝸牛黏液多糖單糖組成的結(jié)果見圖3。由圖3可知:蝸牛黏液中含有Fuc、Man、Glc和Gal，其摩爾比(MR)分別為1.69∶ 2.46∶ 0.12∶ 1。Liao等[15]已經(jīng)從蝸牛軟體中分離出來葡聚糖，但是本實驗結(jié)果表明了蝸牛黏液多糖中還含有Fuc、Man和Gal，這說明蝸牛黏液中含有其他種類的多糖。事實上，多糖的活性與它們的單糖組成密切相關(guān)[11,24]。多糖中半乳糖的含量與亞鐵離子的還原能力呈正相關(guān)性[24]。 Fuc和Man是蝸牛黏液多糖中主要的單糖，已經(jīng)被證明與多種藥理活性相關(guān)，包括抗腫瘤、抗氧化和抗炎等[11]。這些研究結(jié)果都表明蝸牛黏液多糖具有潛在的藥理活性。

圖3 蝸牛黏液多糖的單糖組成分析Fig.3 Analysis of compositional monosaccharide ofA. fulica mucus polysaccharides

2.1.3 蝸牛黏液多糖的糖苷鍵分析結(jié)果

采用GC-MS方法對蝸牛黏液多糖進(jìn)行甲基化分析，以確定多糖中的糖苷鍵。表1總結(jié)了蝸牛黏液多糖的甲基化分析結(jié)果。由表1可知,多糖包括以下單元，F(xiàn)ucp(2，3，4-Me3-Fuc；MR 1.17)、Galp(2，3，4，6-Me4-Gal；MR 1.91)、Fucp(2，4-Me2-Fuc；MR 3.50)、Manp(3，4，6-Me3-Man；MR 9.20)、Manp(2，4，6-Me3-Man；MR 2.26)、Manp(4，6-Me2-Man；MR 1.00)和Glcp(2，4-Me2-Glc；MR 0.77)。從每部分的比例來看，蝸牛黏液多糖骨架可能由→2) Manp-(1→組成,此外也會有較大比例的→3) Fucp-(1→。

表1 蝸牛黏液多糖的GC-MS甲基化分析結(jié)果

2.1.4 蝸牛黏液多糖的分子量分布測定結(jié)果

使用HPSEC-UV-RI-MALLS系統(tǒng)測定蝸牛黏液多糖的分子量分布。圖4顯示蝸牛黏液中有5種具有不同分子量的組分。由圖4可知，峰1分子量為4.549×106，沒有紫外吸收，表明該部分是多糖。雖然其他4個峰都具有紫外吸收，而且隨著示差(RI)吸收的減少，紫外吸收增加，這表明這4個峰可能是糖蛋白，分子量分別為1.392×105、6.291×104、5.262×104和4.153×104，并且隨著分子量的減少，糖蛋白中蛋白的相對含量增加。Kubota等[25]發(fā)現(xiàn)蝸牛黏液中有一種抗菌作用的糖蛋白，其分子量約為1.6×105。Mitra等[2]發(fā)現(xiàn)了蝸牛黏液里的凝集素，是一種分子量為7×104的糖蛋白，同時還有研究發(fā)現(xiàn)蝸牛黏液含有分子量3.5×105的凝集素[9]。這些研究都表明：蝸牛黏液中糖蛋白的分子量與本研究結(jié)果相似。此外，最后強(qiáng)烈的紫外吸收可能來自蝸牛黏液中分子量較小的糖蛋白，因為太小而不能被MALLS檢測器很好地檢測到,并且計算出分子量。

紅色線為MALLS吸收，藍(lán)色線為RI吸收，綠色線為UV吸收圖4 蝸牛黏液多糖的HPSEC-UV-RI-MALLS 色譜圖及其分子量分布Fig.4 HPSEC-UV-RI-MALLS chromatographic profiles and the molecular weight distribution of A. fulica mucus polysaccharides

2.2 蝸牛黏液多糖的抗氧化活性結(jié)果

2.2.1 蝸牛黏液多糖對ABTS·+的清除能力測定結(jié)果

ABTS·+脫色實驗已被廣泛用于評估親水性和親脂性抗氧化劑的抗氧化活性，如：多糖、血漿、類胡蘿卜素、羥基肉桂酸酯和黃酮類抗氧化劑[21]。因此，ABTS·+也可用于本研究中以評價蝸牛黏液多糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖5(a)所示。由圖5(a)可知，蝸牛黏液多糖的ABTS·+清除能力與濃度呈正相關(guān)性，在10 mg/mL質(zhì)量濃度下其清除能力為73%，并且清除ABTS·+的半抑制濃度(IC50值)為2.35 mg/mL。有研究發(fā)現(xiàn)，具有β構(gòu)型的吡喃糖結(jié)構(gòu)的牛肝菌多糖，有較強(qiáng)的自由基清除活性和亞鐵離子還原能力，推測蝸牛黏液多糖中的該結(jié)構(gòu)也有助于其抗氧化活性的發(fā)揮[24]。

圖5 蝸牛黏液多糖對ABTS·+和·OH的清除活力Fig.5 Scavenging effects on ABTS radicals and hydroxyl radicals of A. fulica mucus polysaccharides

2.2.2 蝸牛黏液多糖對·OH的清除能力測定結(jié)果

筆者還比較了原始黏液(original liquid)，醇沉淀去除蛋白質(zhì)前(before PR)和去除蛋白質(zhì)后(after PR)的抗氧化活性(圖5)。由圖5可知，原始黏液具有最高的抗氧化活性，這表明在蝸牛黏液中一定存在其他小分子抗氧化成分。對于ABTS·+和·OH，醇沉物去除蛋白質(zhì)前后顯示出類似的清除作用，特別是對·OH的清除。該結(jié)果表明，蝸牛黏液中大分子的抗氧化活性可能歸因于多糖及其配合物。同時，一些草藥來源的多糖在去除蛋白質(zhì)前后的抗氧化活性明顯不同，去除蛋白質(zhì)前的多糖表現(xiàn)出更好的抗氧化活性[27]。

2.3 蝸牛黏液多糖體外免疫活性的測定結(jié)果

2.3.1 蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)量的影響結(jié)果

NO可以作為細(xì)胞內(nèi)氣體信號分子介導(dǎo)多種生物學(xué)功能，例如：血管舒張、神經(jīng)傳遞、免疫反應(yīng)和血小板聚集，NO也參與巨噬細(xì)胞的溶細(xì)胞功能[28]。蝸牛黏液多糖孵育巨噬細(xì)胞24 h后，NO產(chǎn)量見圖6(a)。由圖6(a)可知，蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO具有顯著的刺激能力(P<0.05)。LPS(1.0 μg/mL)與對照組相比，誘導(dǎo)的NO產(chǎn)量為(392.8±9.0)%，在多糖質(zhì)量濃度為500.0 μg/mL時，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的活力與LPS相似。在多糖質(zhì)量濃度為10.0～500.0 μg/mL時，NO產(chǎn)生水平呈增加趨勢。該結(jié)果表明：蝸牛黏液多糖可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞體外產(chǎn)生NO，呈濃度依賴性。

2.3.2 蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞的影響結(jié)果

隨后研究了蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞的吞噬活性(FITC-葡聚糖攝取)的影響，見圖6(b)。由圖6(b)可知，不同質(zhì)量濃度(0.1、1、10、50、100和200 μg/mL)的蝸牛黏液多糖和LPS(1.0 μg/mL)可以顯著增加巨噬細(xì)胞的吞噬活性(P<0.05)。質(zhì)量濃度為100 和200 μg/mL的蝸牛黏液多糖的吞噬活性均顯著高于LPS(P<0.05)。該結(jié)果表明蝸牛黏液多糖能明顯增加巨噬細(xì)胞的吞噬活性。

2.3.3 蝸牛黏液多糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的測定結(jié)果

蝸牛黏液多糖可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子(TNF-α和IL-6)見圖6(c)。由圖6(c)可知，蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞具有明顯的免疫調(diào)節(jié)活性。TNF-α細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度從(1 538.3±63.6) pg/mL增加到(1 979.9±34.8)pg/mL。同時，IL-6細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度從(1 355.6±112.7) pg/mL增加到(2 608.7±210.6) pg/mL。與正常對照組相比，TNF-α和IL-6細(xì)胞因子均有顯著的增加(P<0.05)。蝸牛黏液多糖(100.0 μg/mL)處理的巨噬細(xì)胞比陽性對照LPS(1.0 μg/ml，P<0.05)顯著分泌更多的TNF-α和IL-6。

*表示P<0.05;**表示P<0.01;蝸牛黏液多糖組、LPS組均與空白對照組對比圖6 蝸牛黏液多糖對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性Fig.6 Immunomodulatory activity of A. fulica mucus polysaccharides

3 結(jié)論

本研究中，筆者提取并表征了蝸牛黏液的水溶性多糖。蝸牛黏液多糖的單糖組成為Fuc、Man、Glc和Gal，摩爾比為1.69∶ 2.46∶ 0.12∶ 1。多糖中糖醛酸的含量為9.1%。蝸牛黏液多糖骨架中存在多種類型的連接，最多的為→2)Manp-(1→，→3)Fucp-(1→和→3)Manp-(1→。蝸牛黏液多糖含有5個不同組分，分子量分別為4.549×106，1.392×105，6.291×104，5.262×104和4.153×104。體外抗氧化實驗表明，蝸牛黏液多糖具有很好地清除ABTS·+和·OH的能力，IC50值分別為2.35和4.70 mg/mL。此外，蝸牛黏液多糖可明顯刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用。因此,蝸牛黏液多糖可作為天然抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于食品甚至藥物中。