基于高通量測(cè)序技術(shù)分析東北豆醬的微生物多樣性

馬巖石,姜 明,李 慧,裴芳藝

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院科研處,齊齊哈爾 161000)

我國(guó)制醬工藝歷史悠久,歷經(jīng)多個(gè)朝代的發(fā)展,如今已經(jīng)普及到了韓國(guó)、日本、印度尼西亞等東南亞國(guó)家和地區(qū)。豆醬是以大豆為主材料,通過(guò)發(fā)酵制備而成的一種具有獨(dú)特風(fēng)味的食品以及調(diào)味品。東北作為我國(guó)大豆的主要產(chǎn)區(qū),其大豆年產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的50%左右,豆醬的制作也是非常普遍的[1]。

目前東北豆醬主要采用大豆發(fā)酵的方式進(jìn)行制作,制作過(guò)程中各種微生物作用賦予了豆醬獨(dú)特的風(fēng)味,因此明確東北豆醬成品中的微生物組成是十分必要的[2]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)食品中微生物的研究在發(fā)酵過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)和重要微生物的鑒定方面已經(jīng)比較普遍[3-6],Yu等[7]對(duì)傳統(tǒng)農(nóng)家醬中細(xì)菌的生物胺含量進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)組胺和酪胺與發(fā)酵時(shí)間呈顯著正相關(guān)。齊欣[8]通過(guò)測(cè)定朝鮮族大醬中異黃酮提取物(IEOKSP)對(duì)幾種癌細(xì)胞增殖的影響等試驗(yàn)得出，朝鮮族大醬中主要抗癌成分隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),含量逐漸增多。

高通量測(cè)序如今越來(lái)越多的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品、醫(yī)學(xué)等微生物多樣性的檢測(cè)中[9-12],谷靜思等[13]通過(guò)高通量測(cè)序的方法以及傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法對(duì)臭豆腐中的細(xì)菌的微生物群進(jìn)行分析,最終得到了臭豆腐中微生物群落的分布信息。Ercolini[14]介紹了高通量測(cè)序技術(shù)用于研究食品微生物群的當(dāng)前情景和未來(lái)前景,并描述了選擇最佳工作條件以滿(mǎn)足食品研究特定需求的決策過(guò)程。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)[15],以東北市場(chǎng)常見(jiàn)的5種豆醬成品為研究材料,選取比較適宜序列檢測(cè)的細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)及真菌ITS1～2區(qū)[16-18]基因序列檢測(cè)其微生物群落結(jié)構(gòu),能夠更加全面、準(zhǔn)確的了解其菌群結(jié)構(gòu),為進(jìn)一步的豆醬的生產(chǎn)、保藏以及優(yōu)勢(shì)菌種的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5種豆醬FJ01、FJ02、CD01、CD02、CD03 均為發(fā)酵時(shí)間45 d的市售產(chǎn)品,分別來(lái)自東北地區(qū)5個(gè)不同的生產(chǎn)地點(diǎn),FJ01產(chǎn)于遼寧營(yíng)口,工業(yè)生產(chǎn),FJ02產(chǎn)于黑龍江綏化,工業(yè)生產(chǎn),CD01產(chǎn)于吉林通化,手工制作,CD02產(chǎn)于吉林白城,工業(yè)生產(chǎn),CD03產(chǎn)于哈爾濱,手工制作;DNA Marker5000、DNA Marker2000 上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖 西班牙 Biowest Agarose;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒DP209 天根生化科技(北京)有限公司;gold view II型核酸染色劑 Solarbiao;提取液等配制試劑 上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司。

ZS-F6-20恒溫水浴鍋 山東桑澤儀器儀表有限公司;MixPlus渦旋振蕩器 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司;5415D高速離心機(jī) 德國(guó)eppendorf;超微量分光光度計(jì) Thermo Nano Drop2000;DYCP-32A瓊脂糖水平電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng);T100 PCR儀、1708195 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-rad。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆醬總DNA提取 根據(jù)Zhu等[19]提取DNA的方法,略有修改。取待測(cè)的5個(gè)豆醬樣品各0.5 g裝于2 mL EP管中,離心去上清液,在沉淀內(nèi)加入0.75 mL提取緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,pH9.0,40 mmol/L EDTA),0.15 mL 10% SDS和0.45 mL芐基氯,50 ℃水浴35 min,每5 min取出上下?lián)u動(dòng)若干次,以保證提取物與試劑充分接觸。水浴結(jié)束后,加入0.45 mL 3 mol/L NaOAc在冰上處理15 min。最后,10000 r/min離心10 min后,使用異丙醇沉淀DNA,梯度酒精洗滌晾干后用ddH2O溶解。分別用1%的瓊脂糖電泳和超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA片段大小及濃度,并將其稀釋至適宜的濃度[20],-20 ℃保存待用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以提取的豆醬總DNA為模板,細(xì)菌16S rDNA基因的V3～V4區(qū)通用擴(kuò)增引物341F和806R[21],真菌ITS區(qū)通用擴(kuò)增引物ITS3F和ITS4R[22-23](表1)為引物,結(jié)合高秀芝等[24]和Siddiqui等[25]的PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。

表1 PCR擴(kuò)增引物信息表Table 1 Information of PCR amplification primer

PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×PCR Buffer 5 μL,2 mmol/L dNTP mix 4 μL,45 pmol前后引物各5 unit/μL,Taq DNA聚合酶0.2 μL,DNA模板10 ng/μL 1 μL,ddH2O加至50 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸7 min。

1.2.3 電泳檢測(cè)及測(cè)序 通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,并對(duì)目的片段進(jìn)行膠回收,將樣品交由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic(v 0.32)軟件對(duì)各樣品序列做質(zhì)控處理,利用軟件Usearch(V 7.0)去除非靶區(qū)域序列、嵌合體及短片段序列;利用FLASH軟件將測(cè)序得到的reads進(jìn)行組裝。在97%相似度條件下,按照序列間的距離對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi),得到用于物種分類(lèi)的 OTU(Operational Taxonomic Unit)序列。利用MOUTHUR軟件進(jìn)行OTU分布統(tǒng)計(jì)分析以及聚類(lèi)比對(duì)的分類(lèi)學(xué)分析。計(jì)算ACE/Chao/Shannon/Simpson/Coverage。利用RDP classifer(v 2.2)軟件將OTU序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲得物種注釋,Excel 2007用以數(shù)據(jù)處理及分析統(tǒng)計(jì)作圖。

2 結(jié)果

2.1 豆醬總DNA提取結(jié)果

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可知,5個(gè)樣品在大于5000 bp處均獲得目的條帶,且條帶清晰,說(shuō)明豆醬總DNA提取成功,經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)可知基因組DNA的濃度及純度OD260/OD280均在1.75～2.10的范圍內(nèi),證明DNA純度較好,沒(méi)有污染,可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。

2.2 測(cè)序序列長(zhǎng)度與分布

通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)果可知,本研究五份豆醬樣本中細(xì)菌(表2)共測(cè)得序列134115條,其中樣本細(xì)菌長(zhǎng)度分布在460～469 bp之間,通過(guò)過(guò)濾篩除低質(zhì)量序列[26],得到有效序列共131462條,長(zhǎng)度分布在427～430 bp之間;五份豆醬樣本真菌(表3)共得到序列124301條,長(zhǎng)度在332～350 bp范圍內(nèi),得到有效序列120336條,長(zhǎng)度309～312 bp范圍內(nèi)。

表2 細(xì)菌序列信息Table 2 Bacterial sequence information

表3 真菌序列信息Table 3 Fungus sequence information

2.3 樣品的OTU統(tǒng)計(jì)及分析

通過(guò)對(duì)序列結(jié)果隨機(jī)抽樣,統(tǒng)計(jì)序列數(shù)變化與OTU變化,從一個(gè)樣本測(cè)序得到的所有序列中隨機(jī)抽取序列(reads),統(tǒng)計(jì)每次抽取出來(lái)的序列有多少OUT(代表了有多少物種),最后以抽取的序列數(shù)目為橫坐標(biāo),相應(yīng)的OUT數(shù)目為縱坐標(biāo),繪制曲線(xiàn)圖1,隨著序列數(shù)增大，幾個(gè)樣品的曲線(xiàn)逐漸接近平行,即更大的序列不會(huì)導(dǎo)致OUT數(shù)目的顯著性增長(zhǎng),證明以目前的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析是比較可靠的。

圖1 樣品稀釋性曲線(xiàn)Fig.1 Dilution curve of sample注:A:樣品中細(xì)菌OTU;B:樣品中真菌OUT。

采用OUT統(tǒng)計(jì)工具bioinformatics.psb.ugent.be-Venn,將幾個(gè)樣本的測(cè)序結(jié)果按照操作提示錄入工具中,然后分別對(duì)測(cè)序結(jié)果篩選出來(lái)的細(xì)菌真菌有效序列進(jìn)行聚類(lèi),如圖2,樣品細(xì)菌在OTU聚類(lèi)后共得到1732個(gè)OTU,其中有38個(gè)OTU是個(gè)樣品共有的,樣品FJ01特有333個(gè)OUT,FJ02特有193個(gè)OTU,CD01有117個(gè),CD02有132個(gè),CD03有190個(gè)。樣品真菌得到1040個(gè)OTU,共有OTU為18個(gè)。樣品FIJ01特有342個(gè)OTU,FJ02特有54個(gè)OTU,CD01有13個(gè),CD02有41個(gè),CD03有62個(gè)。

圖2 樣品OTU分布韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the sample OTUs distribution注:A:樣品中細(xì)菌OTU;B:樣品中真菌OUT。

2.4 群落多樣性分析

由表4可知,本研究5個(gè)樣品共得到細(xì)菌OUT 1732個(gè),其中FJ01細(xì)菌樣品最多,達(dá)到535個(gè)。CD02細(xì)菌最少,有267個(gè)。真菌OUT 1040個(gè),其中FJ01樣品最多,有515個(gè)。CD03真菌最少,僅111個(gè)。細(xì)菌總體數(shù)量和種類(lèi)高于真菌,說(shuō)明在豆醬成品當(dāng)中,細(xì)菌占據(jù)微生物群落的主導(dǎo)地位。所有試驗(yàn)樣品的OUT覆蓋率(Coverage)均大于99%,即表明本次試驗(yàn)建立的文庫(kù)能夠較準(zhǔn)確地反映出待測(cè)樣品的微生物多樣性情況。Chao、ACE指數(shù)用于計(jì)算菌群豐度(community richness),二者指數(shù)越大,說(shuō)明群落豐富度越高的理論[27-28]。本試驗(yàn)細(xì)菌的Chao和ACE指數(shù)均大于真菌,說(shuō)明試驗(yàn)樣品中的細(xì)菌群落豐富度大于真菌群落;Shannon、Simpson用于計(jì)算菌群多樣性(community diversity)指數(shù),Shannon的值越大,說(shuō)明群落多樣性越高,Simpson指數(shù)值越大,則說(shuō)明其群落多樣性越低[29],因此結(jié)合表4中Simpson和Shannon指數(shù),五種豆醬細(xì)菌多樣性水平應(yīng)該是CD01最高,CD02次之,CD03高于FJ01,最低的是FJ02;真菌多樣性水平上,CD01遠(yuǎn)高于其他幾個(gè)品種,這應(yīng)該源于其生產(chǎn)方式,CD01屬于手工自制醬,對(duì)滅菌做得不如工業(yè)生產(chǎn)。

表4 豆醬微生物群落多樣性Table 4 Microbial community diversity in soy sause

2.5 群落組成

2.5.1 樣品微生物在門(mén)上的分布 通過(guò)對(duì)五個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果分析可知,樣品中共有17個(gè)細(xì)菌門(mén)被檢出,其種類(lèi)豐富度較高,所占總序列數(shù)差異大,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)是主要的菌門(mén)。由圖3A可得,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)在樣品FJ01、CD02、CD03中屬于優(yōu)勢(shì)菌門(mén),分別占總數(shù)的85%、79%、92%。變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)是樣品FJ02和CD01中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén),各占總數(shù)的79%和78%。除優(yōu)勢(shì)菌門(mén)以外還發(fā)現(xiàn)有以放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)為主的其他菌門(mén),但各自在樣品中的總占比均較低。

樣品在真菌中檢測(cè)出豐富的菌門(mén)有子囊菌門(mén)(Ascomycota),比較豐富的有擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、接合菌門(mén)(Zygomycota),以及其他菌門(mén)。從圖3B中可以看出,子囊菌門(mén)(Ascomycota)幾乎是所有樣品的優(yōu)勢(shì)菌門(mén),分別占總數(shù)的99%、98%、70%、98%、90%。樣品CD01中擔(dān)子菌門(mén)所占比例也達(dá)到了近20%。

圖3 樣品在門(mén)上的分布情況Fig.3 Distribution of samples at the phylum level注:A:樣品中細(xì)菌群落分布;B:樣品中真菌群落分布。

2.5.2 樣品微生物在屬上的分布 在屬的水平上,樣品共檢出39個(gè)細(xì)菌屬。如圖4A所示,樣品FJ01和樣品CD03中的優(yōu)勢(shì)菌屬是葡萄球菌屬(Staphylococcus),占各自總數(shù)的69%和64%。腸桿菌屬(Enterobacter)在FJ01和CD03中也分別占到總數(shù)的19%和11%;在樣品CD01中,腸桿菌屬(Enterobacter)占到了總數(shù)的53%,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)占總數(shù)的20%,明串珠菌也達(dá)到了16%;FJ02中的優(yōu)勢(shì)菌群為芽孢桿菌屬(Bacillus),其豐度達(dá)到了45%,色鹽桿菌屬(Chromohalobacter)32%,葡萄球菌屬為7%;CD02中乳酸桿菌與腸桿菌屬分別占到了總數(shù)的22%和20%,腸球菌占到了30%;魏斯氏菌屬(Weissella)在除CD03以外中均有占到3%以上。腸桿菌、乳酸桿菌、色鹽桿菌為5個(gè)樣品共有細(xì)菌,各個(gè)樣品間微生物群落豐度差距很大,這可能與幾種材料產(chǎn)自不同地區(qū)有關(guān)。此外各樣品中相對(duì)豐度大于1%的還有雙歧桿菌(Bifidobacterium)、雷爾氏菌屬(Ralstonia)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)。

樣品中共檢測(cè)出43個(gè)真菌屬,如圖4B所示各樣品間的優(yōu)勢(shì)菌的種類(lèi)和數(shù)量同樣差異顯著,曲霉屬、接合霉屬、赤霉屬、毛霉屬為5個(gè)樣品共有的真菌屬,但豐度上差異明顯。FJ01中的優(yōu)勢(shì)真菌是接合酵母屬,序列豐度為70%,FJ02、CD01、CD02、CD03 中該菌屬的序列豐度分別為10%、18%、30%、11%,可見(jiàn)接合酵母屬在幾個(gè)材料的真菌中數(shù)量都相對(duì)比較豐富。在 FJ02中相對(duì)豐度最高的真菌屬為曲霉屬。FJ02、CD02、CD03中均含有德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)。CD02中菌屬種類(lèi)多,分布比較均勻都在10%～30%左右,因此其優(yōu)勢(shì)并不能判定其優(yōu)勢(shì)均屬。CD03中優(yōu)勢(shì)菌屬十分明顯,屬于赤霉菌屬,占到了60%。

圖4 樣品在屬上的分布情況Fig.4 Distribution of samples on genus level注:E:樣品中細(xì)菌群落分布;F:樣品中真菌群落分布。

3 討論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)東北不同產(chǎn)地的5份豆醬進(jìn)行高通量測(cè)序,檢測(cè)到豆醬食品中含有數(shù)量龐大的真菌和細(xì)菌微生物群體,包括葡萄球菌、乳酸桿菌、德巴利氏酵母屬、芽孢桿菌等大量的發(fā)酵食品優(yōu)勢(shì)菌屬。焦玉[30]通過(guò)對(duì)火腿腸的風(fēng)味物質(zhì)以及微生物檢測(cè)中就發(fā)現(xiàn),葡萄球菌是一類(lèi)可以通過(guò)水解脂肪從而提高發(fā)酵香腸中游離脂肪酸的含量,促進(jìn)脂肪分解的優(yōu)勢(shì)菌屬;樣品FJ01和CD03的葡萄球菌占比均超過(guò)60%。袁鈺等[31]通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Ρ本┒怪瓋旱奈⑸锒鄻有院凸δ苎芯浚舶l(fā)現(xiàn)了乳酸桿菌在對(duì)豆汁兒中的氨基酸代謝具有重要作用,益于腸道菌群健康發(fā)酵;在糟魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中,芽孢桿菌、乳酸桿菌具有產(chǎn)蛋白酶和脂肪酶的特性,酵母菌具有產(chǎn)脂肪酶的特性,能夠更好的促進(jìn)發(fā)酵品質(zhì)以及風(fēng)味被李改燕[32]證實(shí)。

研究中對(duì)豆醬微生物群落結(jié)構(gòu)分析后，發(fā)現(xiàn)幾種樣品的細(xì)菌真菌多樣性在門(mén)和屬的水平上均呈現(xiàn)出較大的差異,說(shuō)明在豆醬生產(chǎn)中其微生物多樣性可能受到地域的影響,同時(shí)也很好的解釋了造成不同地區(qū)生產(chǎn)的豆醬風(fēng)味差異的一部分原因是豆醬內(nèi)部微生物的差異;不同加工方式對(duì)于豆醬中微生物多樣性的影響也存在較大影響,例如實(shí)驗(yàn)中手工制作的豆醬CD01，或許因?yàn)樵跍缇^(guò)程中處理得并不徹底而導(dǎo)致真菌多樣性相對(duì)幾種工業(yè)醬有顯著的差距,其中不乏有對(duì)人體有害的菌類(lèi);此外實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)了解豆醬中微生物群落組成和微生物多樣性能夠提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。在今后地方特色的豆醬生產(chǎn)、保藏以及優(yōu)勢(shì)菌種選育中,可以參考本研究中的各個(gè)樣品的試驗(yàn)結(jié)果,來(lái)針對(duì)不同產(chǎn)地以及發(fā)酵天數(shù)的豆醬中優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行生產(chǎn)處理,以達(dá)到最佳的效果。