黃花敗醬化學(xué)成分研究

張 旋，侴桂新

上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所 上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，上海 201203

黃花敗醬為敗醬科敗醬屬植物黃花敗醬PatriniascabiosaefoliaFisch.的干燥全草，亦稱“黃花龍芽”，是我國傳統(tǒng)常用中藥“敗醬草”的來源之一，具有清熱解毒、消腫排膿、活血祛瘀的功效，治療慢性闌尾炎療效顯著[1]。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道的黃花敗醬植物主要化合物種類有：三萜及其皂苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、香豆素類、木脂素類、甾醇類、有機(jī)酸、揮發(fā)油等[2,3]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明黃花敗醬具有鎮(zhèn)靜、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗白血病等藥理活性[2,3]。為進(jìn)一步豐富黃花敗醬的化學(xué)信息和開發(fā)黃花敗醬的資源，本文利用多種色譜分離技術(shù)和波譜技術(shù)，對(duì)黃花敗醬P.scabiosaefolia全草的95%乙醇提取物進(jìn)行化學(xué)成分研究。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE-III(400、600 MHz)型核磁共振波譜儀；Agilent UHD Accurate Mass Q-TOF LC-MS(HR-ESI-MS)；島津LC-20A型高效液相色譜儀(島津，日本)；制備型高效液相色譜儀Agilent 1100 & 1260(Pre-HPLC，安捷倫，美國)；中壓液相色譜儀(MPLC，Grace，美國)；Olympus CKX41型顯微鏡；Thermo BB 150型二氧化碳培養(yǎng)箱；GeneSpeed 416型低速離心機(jī)；Bio-Tek Synergy H4全功能酶標(biāo)儀；制備色譜柱(Shiseido Capcellpak C18，250×20 mm，資生堂，日本)；MCI gel CHP20P(75～150 μm，三菱化學(xué)有限公司，日本)；凝膠Sephadex LH-20(25～100 μm，通用電器醫(yī)療集團(tuán)，美國)；YMC gel ODS-AQ(50 μm,YMC 有限公司，日本)；柱層析硅膠(100～200目，200～300目，青島海洋化工廠)，無特殊說明，以下文章中所提及的柱層析硅膠均為200～300目；薄層層析及制備型薄層層析HSGF254硅膠板(煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司，中國)；DMSO-d6、CD3OD、CDCl3(Cambridge Isotope Laboratories，美國)；乙腈、甲醇(Dikma，色譜級(jí)，美國)；薄層層析用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、丙酮、甲醇(分析純，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，中國)；柱層析用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇(工業(yè)純，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司，中國)；McCoy′s 5A Medium培養(yǎng)液、胎牛血清FBS、Penicillin-Streptomycin(PS，青霉素-鏈霉素雙抗溶液)、Pshosphate Buffered Saline(PBS，pH=7.2，HyClone，美國)、Cell Counting Kit(CKK-8試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司)。HCT-116細(xì)胞購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

實(shí)驗(yàn)用黃花敗醬全草由濟(jì)人醫(yī)藥集團(tuán)(安徽亳州)提供，并由安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為黃花敗醬Patriniascabiosaefolia，憑證標(biāo)本(NO.HHBJ20170327)保存于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取與分離

黃花敗醬全草47.5 kg，切成3～5 cm的小段，以95%工業(yè)乙醇70 ℃回流提取三次，每次十倍量，回流時(shí)間依次為1.5、1、1 h，合并提取液，減壓回收乙醇，獲得總浸膏4.43 kg。將黃花敗醬總浸膏制成的混懸液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑得到黃花敗醬各極性萃取部位。

二氯甲烷部位(344 g)經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(1∶0→0∶1)不同比例梯度洗脫，經(jīng)TLC檢識(shí)，合并相同的流份，得到7個(gè)流份Fr1～Fr7。Fr2(8.6 g)以石油醚-乙酸乙酯為溶劑系統(tǒng)，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜得化合物4(13.9 mg)和18(30.2 mg)。Fr4(11 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)不同比例梯度洗脫，通過TLC檢識(shí)，合并相同的流份，共得到7個(gè)流份Fr4-1～Fr4-7。Fr4-2(479 mg)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(15∶1)等度洗脫獲得3個(gè)流份Fr4-2-1～Fr4-2-3。Fr4-2-2經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)等度洗脫，再經(jīng)制備薄層色譜得化合物17(84 mg)。Fr4-3(611 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)洗脫，然后經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇系統(tǒng))洗脫，再經(jīng)制備高效液相色譜(MeCN∶H2O=11∶89；16 mL/min)得化合物24(25.5 mg)。Fr4-5(697.5 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)洗脫獲得2個(gè)流份Fr4-5-1～Fr4-5-2。Fr4-5-1經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)等度洗脫，再經(jīng)過Sephadex LH-20(甲醇系統(tǒng))和制備高效液相色譜(MeCN∶H2O=17∶83)得化合物5(21.9 mg)。Fr4-6(848 mg)經(jīng)Sephadex LH-20(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)洗脫獲得3個(gè)流份Fr4-6-1～Fr4-6-3。Fr4-6-2經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)等度洗脫獲得2個(gè)流份Fr4-6-2-1～Fr4-6-2-2。Fr4-6-2-1經(jīng)制備高效液相色譜(MeCN∶H2O=13∶87)得化合物21(6.9 mg)。Fr4-6-3先經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)等度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20得化合物8(83.4 mg)。Fr5(13 g)經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)不同比例梯度洗脫，經(jīng)TLC檢識(shí)，合并相同的流份，得到5個(gè)流份Fr5-1～Fr5-5。Fr5-1經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)洗脫獲得2個(gè)流份Fr5-1-1和Fr5-1-2。Fr5-1-1經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜得化合物19(39.8 mg)。Fr5-2經(jīng)Sephadex LH-20洗脫共獲得2個(gè)流份Fr5-2-1～Fr5-2-2。Fr5-2-1經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)洗脫獲得3個(gè)流份Fr5-2-1-1～Fr5-2-1-3。Fr5-2-1-2經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇系統(tǒng))洗脫獲得3個(gè)流份Fr5-2-1-2-1～Fr5-2-1-2-3。Fr5-2-1-2-1和Fr5-2-1-2-2分別經(jīng)制備高效液相色譜等度洗脫(MeCN∶H2O=16∶84；MeCN∶H2O=12∶88)得化合物22(22.5 mg)和化合物1(70.8 mg)。

乙酸乙酯部位312 g經(jīng)MCI柱色譜，甲醇-水(0、30%、60%、90%、100%)系統(tǒng)不同比例梯度洗脫，經(jīng)TLC檢識(shí)，合并相同的流份，得到7個(gè)流份Fr1～Fr7。Fr2(58 g)經(jīng)中壓柱色譜(MPLC，MeOH∶H2O=0∶1→1∶0)得到2個(gè)流份Fr2-1和Fr2-2。Fr2-1(48 g)經(jīng)凝膠Sephadex LH-20梯度洗脫，共得到7個(gè)流份Fr2-1-1～Fr2-1-7。Fr2-1-2(32 g)吸附于60 g硅膠(100～200目)，經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，獲得7個(gè)流份Fr2-1-2-1～Fr2-1-2-7。Fr2-1-2-3經(jīng)制備高效液相色譜(MeCN∶H2O=10∶90)得化合物20(1.8 mg)。Fr2-1-2-4、Fr2-1-2-6分別先經(jīng)Sephadex LH-20(40%、60%甲醇-水系統(tǒng))，再分別經(jīng)制備高效液相色譜(MeCN-H2O梯度洗脫；MeCN∶H2O=12∶88)得化合物13(9.5 mg)、23(2 mg)、9(2 mg)、15(16.6 mg)和14(17.5 mg)、16(20.9 mg)。Fr2-1-3(1.5 g)經(jīng)硅膠柱色譜，再經(jīng)制備高效液相色譜(MeCN∶H2O=5∶95；MeCN∶H2O=3∶97)得化合物10(5.9 mg)和6(7.2 mg)、7(2 mg)。Fr2-1-4(3.43 g))經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇系統(tǒng))，再經(jīng)Sephadex LH-20和制備高效液相色譜(MeCN∶H2O=15∶85)得化合物12(16.6 mg)、11(17.5 mg)。Fr2-1-5經(jīng)重結(jié)晶得化合物3(6.6 mg)。Fr2-1-6經(jīng)硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)(9∶1)等度洗脫得到化合物2(27.3 mg)。

2.2 細(xì)胞毒活性篩選

采用CCK-8法，以人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞為研究對(duì)象，10 μM鹽酸伊立替康(CPT-11)為陽性藥物組，對(duì)分離得到的化合物在濃度為100 μM的條件下，進(jìn)行初步的細(xì)胞毒活性篩選。

HCT-116細(xì)胞用含10% FBS、1% P/S的McCoy′s 5A Medium培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。將處于對(duì)數(shù)生長周期的HCT-116細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化、顯微鏡下計(jì)數(shù)后，濃度調(diào)整為1.5×105個(gè)/mL，接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。待細(xì)胞完全貼壁后,加入空白組(培養(yǎng)液)、陽性藥物組CPT-11(10 μM)和100 μM的化合物溶液給藥組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后，吸去上清液，加入100 μL含有10% CCK-8的McCoy′s 5A Medium 培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30～40 min，在450 nm處測(cè)定吸光度(OD)值。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色固體，可溶于甲醇；[α]-70.4(c0.125，MeOH)；IRνmax3 383，1 660，1 048 cm-1；UV(MeOH)λmax250 nm。通過高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS：m/z181.086 3 [M+H]+(calcd for C10H13O3，181.085 6)和氫碳譜數(shù)據(jù)確定其分子式為C10H12O3，不飽和度為5。在1H NMR譜(Table1)中顯示有兩個(gè)醛基氫信號(hào)δH9.53(1H，s，H-7)和9.99(1H，s，H-10)，結(jié)合碳譜中醛基碳信號(hào)δC190.2和195.6，推斷可能有兩個(gè)醛基存在；一個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δH2.66(3H，s，H-9)，結(jié)合碳譜中碳信號(hào)δC11.5，說明該化合物有一個(gè)甲基；一個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)δH5.99(2H，d，J=2.5 Hz，H-8)。碳譜中共有10個(gè)碳信號(hào)，其中包括兩組烯碳信號(hào)δC138.7、166.7和δC133.8、152.8。在HMBC譜(Fig.1)中，δH2.66(3H，s，H-9)處的甲基氫信號(hào)與δC166.7，δC138.7和80.0相關(guān)，說明甲基連于C-2；烯烴氫信號(hào)δH5.99(2H，d，J=2.5 Hz，H-8)與δC152.8，40.3和195.6相關(guān)，表明雙鍵與C-6相連；醛基氫信號(hào)δH9.99(1H，s，H-10)與δC138.7(C-1)相關(guān)，說明10號(hào)位上的醛基直接連于C-1位置上。綜上，結(jié)合其它波譜數(shù)據(jù)，確定化合物1的平面結(jié)構(gòu)如Fig.1所示。NOESY譜中無H-3和H-5的相關(guān)信號(hào)，說明H-3和H-5在不同平面，其相對(duì)構(gòu)型如Fig.1所示。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[4]，確認(rèn)該化合物為8,9-didehydro-7-hydroxydolichodial，為一新的天然產(chǎn)物，其核磁共振波譜數(shù)據(jù)見Table 1?；衔?的核磁及其它相關(guān)詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(WWW.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的碳、氫譜數(shù)據(jù)Table 1 1H (600 MHz) and 13C NMR (150 MHz) spectral data of compound 1 in CD3OD

化合物2無色粘稠固體(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：2.01(1H，dd，J=13.5，6.9 Hz，H-6′a)，2.10～2.25(3H，overlap，H-4′，6′b)，3.69(3H，s，H-8′)，3.74(1H，dd，J=7.5，3.1 Hz，H-2′)，4.14(1H，dt，J=6.8，3.4 Hz，H-5′)，5.28(1H，td，J=7.5，4.6 Hz，H-1′)，6.22(1H，d，J=15.9 Hz，H-8)，6.78(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.95(1H，dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)，7.04(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)， 7.52(1H，d，J=15.9 Hz，H-7)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：37.7(C-4′)，37.9(C-6′)，52.9(C-8′)，70.2(C-5′)，72.0(C-1′)，72.5(C-2′)，75.7(C-3′)，115.0(C-8)，115.0(C-2)，116.5(C-5)，122.9(C-6)，127.6(C-1)，146.8(C-4)，147.1 (C-7)，149.6(C-3)，168.2(C-9)，175.4(C-7′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為convoldorine。

化合物3白色針晶(甲醇)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：2.02～2.11(2H，m，H-2)，2.16～2.25(2H，m，H-6)，3.73(1H，dd，J=8.4，3.1 Hz，H-4)，4.17(1H，m，H-5)，5.33(1H，td，J=9.0，4.4 Hz，H-3)，6.33(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′)，6.81(2H，d，J=8.6 Hz，H-3′，5′)，7.47(2H，d，J=8.6 Hz，H-2′，6′)，7.63(1H，d，J=15.9 Hz，H-7′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：38.2(C-6)，38.7(C-2)，71.2(C-5)，72.0(C-3)，73.4(C-4)，76.1(C-1)，115.8(C-8′)，116.8(C-3′，5′)，127.2(C-1′)，131.1(C-2′，6′)，146.6(C-7′)，161.2(C-4′)，168.6(C-9′)，177.0(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為3-O-p-香豆酰奎尼酸。

化合物4淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇)；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：3.95(3H，s，3-OCH3)，6.02(1H，s，4-OH)，6.59(1H，dd，J=15.8，7.7 Hz，H-8)，6.96(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，7.07(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，7.12(1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-6)，7.40(1H，d，J=15.8 Hz，H-7)，9.65(1H，d，J=7.7 Hz，H-9)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：56.1(3-OCH3)，109.5(C-2)，115.0(C-5)，124.2(C-6)，126.5(C-8)，126.8(C-1)，147.0(C-3)，149.0(C-4)，153.2(C-7)，193.7(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為松柏醛。

化合物5黃色粉末(甲醇)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：3.89(6H，s，3，5-OCH3)，6.68(1H，dd，J=15.7，7.8 Hz，H-8)，6.99(2H，s，H-2，6)，7.57(1H，d，J=15.7 Hz，H-7)，9.58(1H，d，J=7.8 Hz，H-9)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：56.8(3，5-OCH3)，107.2(C-2，6)，126.4(C-1)，127.0(C-8)，140.7(C-4)，149.5(C-3，5)，156.4(C-7)，196.0(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為芥子醛。

化合物6無色粘稠固體(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.74(1H， dd，J=11.7，5.2 Hz，H-9a)，3.88(1H，dd，J=8.9，2.7 Hz，H-9b)，3.91(3H，s，3-OCH3)，5.11(1H，dd，J=5.0，3.9 Hz，H-8)，6.88(1H，d，J=8.1 Hz，H-5)，7.58(1H，m，H-6)，7.60(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：56.4(3-OCH3)，66.2(C-9)，75.4(C-8)，112.4(C-2)，115.9(C-5)，125.0(C-6)，128.0(C-1)，149.2(C-3)，153.7(C-4)，199.5(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為C-藜蘆酰乙二醇。

化合物7無色結(jié)晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.75(1H，dd，J=11.6，5.2 Hz，H-3a)，3.88(1H，d，J=3.8 Hz，H-3b)，3.91(6H，s，-OCH3×2)，5.14(1H，dd，J=4.8，4.0 Hz，H-2)，7.35(2H，s，H-2′，6′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：56.9(-OCH3×2)，66.2(C-3),75.5(C-2)，107.7(C-2′，6′)，126.6(C-1′)，143.0(C-4′)，149.1(C-3′，5′)，199.6(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為2,3-dihydroxy-1-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-1-propanone。

化合物8白色針晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.91(3H，s，-OCH3)，6.20(1H，d，J=9.4 Hz，H-3)，6.76(1H，s，H-8)，7.10(1H，s，H-5)，7.85(1H，d，J=9.4 Hz，H-4)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：56.7(-OCH3)，103.9(C-8)，109.8(C-5)，112.5(C-10)，112.6(C-3)，146.1(C-4)，147.0(C-6)，151.4(C-9)，152.9(C-7)，164.0(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為莨菪亭(6-甲氧基-7-羥基香豆素)。

化合物9白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.40(1H，dd，J=12.2，6.0 Hz，H-4′)，3.47～3.60(3H，overlap，H-2′，3′，5′)，3.70(1H，dd，J=12.1，5.7 Hz，H-6′)，3.91(1H，dd，J=12.1，2.2 Hz，H-6′)，3.91(3H，s，-OCH3)，5.07(1H，d，J=7.3 Hz，H-1′)，6.31(1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，7.18(1H，s，H-8)，7.21(1H，s，H-5)，7.90(1H，d，J=9.5 Hz，H-4)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：57.0(-OCH3)，62.3(C-6′)，71.1(C-4′)，74.6(C-2′)，77.8(C-3′)，78.3(C-5′)，102.0(C-1′)，105.1(C-8)，110.7(C-5)，114.5(C-3，10)，114.6(C-10)，145.6(C-4)，148.2(C-7)，150.6(C-9)，151.7(C-6)，163.5(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為異莨菪苷。

化合物10白色固體(甲醇)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：3.37～3.55(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，3.72(1H，dd，J=12.0，5.9 Hz，H-6′a)，3.94(1H，dd，J=12.0，2.1 Hz，H-6′b)，4.84(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′)，6.21(1H，d，J=9.4 Hz，H-3)，6.80(1H，s，H-8)，7.43(1H，s，H-5)，7.84(1H，d，J=9.5 Hz，H-4)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：62.5(C-6′)，71.3(C-4′)，74.8(C-2′)，77.5(C-5′)，78.5(C-3′)，104.2(C-1′)，104.5(C-8)，112.6(C-10)，112.9(C-3)，116.5(C-5)，144.5(C-6)，146.0(C-4)，152.6(C-9)，153.6(C-7)，163.7(C-2)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為七葉苷。

化合物11黃色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：1.06(3H，d，J=6.2 Hz，Rha-CH3)，1.12(3H，d，J=5.1 Hz，Rha-CH3)，4.41(1H，s，H-1′′′)，5.36(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′′)，5.55(1H，s，H-1′′′′)，6.44(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.83(1H，d，J=8.5 Hz，H-5′)，7.57(1H，d，J=2.2 Hz，H-2′)，7.69(1H，dd，J=8.5，2.2 Hz，H-6′)，12.59(1H，s，C5-OH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：18.3(C-6′′′，6′′′′)，65.4(C-6′′)，68.4(C-5′′′)，68.7(C-4′′)，70.2(C-5′′′′)，70.5(C-2′′′′)，70.7(C-2′′′)，70.8(C-3′′′)，71.0(C-3′′′′)，71.5(C-2′′)，72.0(C-4′′′′)，72.3(C-4′′′)，73.4(C-3′′)，74.0(C-5′′)，94.8(C-8)，98.8(C-1′′′′)，99.8(C-6)，100.3(C-1′′′)，102.2(C-1′′)，105.9(C-10)，115.6(C-2′)，116.5(C-5′)，121.3(C-1′)，122.5(C-6′)，134.2(C-3)，145.3(C-3′)，149.1(C-4′)，156.3(C-9)，157.3(C-2)，161.3(C-5)，162.0(C-7)，178.0(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為clovin。

化合物12黃色粉末(甲醇)；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：1.05(3H，d，J=6.2Hz，5′′′-CH3)，1.12(3H，d，J=6.2 Hz，5′′′′-CH3)，4.40(1H，s，H-1′′′)，5.36(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′′)，5.55(1H，d，J=1.3 Hz，H-1′′′′)，6.45(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，6.81(1H，d，J=2.1 Hz，H-8),6.87(2H，d，J=8.9 Hz，H-3′，5′)，8.10(2H，d，J=8.9 Hz，H-2′，6′)，12.57(1H，s，C5-OH)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：17.8(C-6′′′)，17.8(C-6′′′′)，65.2(C-6′′)，67.9(C-5′′′)，68.2(C-4′′)，69.7(C-5′′′′)，70.0(C-2′′′′)，70.2(C-3′′′′)，70.3(C-2′′′)，70.5(C-3′′′)，71.0(C-2′′)，71.5(C-4′′′′)，71.8(C-4′′′)，72.9(C-3′′)，73.5(C-5′′)，94.5(C-8)，98.4(C-1′′′′)，99.3(C-6)，99.9(C-1′′′)，101.8(C-1′′)，105.5(C-10)，115.0(C-3′，5′)，120.6(C-1′)，131.0(C-2′，6′)，133.5(C-3)，155.9(C-2)，157.0(C-9)，160.0(C-4′)，160.8(C-5)，161.5(C-7)，177.6(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物12為robinin。

化合物13無色粘稠固體(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.21～3.38(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，3.69(1H，dd，J=11.9，5.5 Hz，H-6′a)，3.90(1H，dd，J=11.9，1.9 Hz，H-6′b)，4.35(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′)，4.67(1H，d，J=11.8 Hz，H-7a)，4.94(1H，overlap，H-7b)，7.27(1H，m，H-4)，7.33(2H，t，J=7.3 Hz，H-3，5)，7.42(2H，d，J=7.1 Hz，H-2，6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：62.8(C-6′)，71.6(C-4′)，71.7(C-7)，75.1(C-2′)，78.0(C-3′)，78.0(C-5′)，103.2(C-1′)，128.6(C-4)，129.2(C-2，6)，129.2(C-3，5)，139.0(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物13為芐基葡萄糖苷。

化合物14無色粘稠固體(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.21～3.43(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，3.59(2H，s，H-5′′)，3.63(1H，dd，J=11.2，6.2 Hz，H-6′a)，3.78(1H，d，J=9.6 Hz，H-4′′)，3.94(1H，d，J=2.5 Hz，H-2′′)，3.97～4.04(2H，overlap，H-4′′，6′)，4.33(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′)，4.66(1H，d，J=11.8 Hz，H-7a)，4.90(1H，overlap，H-7b)，5.05(1H，d，J=2.5 Hz，H-1′′)，7.27(1H，m，H-4)，7.34(2H，m，H-3，5)，7.43(2H，d，J=7.0 Hz，H-2，6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：65.5(C-5′′)，68.6(C-6′)，71.7(C-7)，71.8(C-4′)，74.9(C-2′)，75.1(C-4′′)，77.0(C-5′)，78.0(C-3′，2′′)，80.5(C-3′′)，103.1(C-1′)，111.0(C-1′′)，128.7(C-4),129.2(C-3，5)，129.3(C-2，6)，138.9(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物14為淫羊藿次苷F2。

化合物15無色粘稠固(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：2.94(2H，m，H-7)，3.18(1H，dd，J=9.0，7.9 Hz，H-5′)，3.24～3.29(2H，m，H-2′，4′)，3.33～3.37(1H，m，H-3′)，3.66(1H，dd，J=11.8，5.3 Hz，H-6′a)，3.75(1H，m，H-8a)，3.86(1H，dd，J=11.9，1.7 Hz，H-6′b)，4.09(1H，m，H-8b)，4.30(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，7.17(1H，m，H-4)，7.25(4H，overlap，H-2，3，5，6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：37.2(C-7)，62.7(C-6′)，71.6(C-4′)，71.7(C-8)，75.1(C-2′)，77.9(C-3′)，78.1(C-5′)，104.3(C-1′)，127.2(C-4)，129.3(C-2，6)，130.0(C-3，5)，140.0(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物15為2-苯乙基-1-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物16無色粘稠固體(甲醇)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：2.94(2H，m，H-7)，3.17(1H，dd，J=9.1，7.9 Hz，H-2′)，3.27(1H，m，H-4′)，3.34(1H，m，H-3′)，3.40(1H，ddd，J=9.5，6.1，1.9 Hz，H-5′)，3.56(2H，s，H-5′′)，3.60(1H，dd，J=11.2，6.2 Hz，H-6′)，3.74～3.79(2H，m，H-8，4′′)，3.90(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′′)，3.96(1H，d，J=9.7 Hz，H-4′′)，3.98(1H，dd，J=11.2，1.9 Hz，H-6′)，4.05(1H，ddd，J=9.7，7.9， 6.9 Hz，H-8)，4.29(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，5.00(1H，d，J=2.5 Hz，H-1′′)，7.17(1H，m，H-4)，7.26(4H，d，J=4.4 Hz，H-2，3，5，6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：37.2(C-7)，65.5(C-5′′)，68.6(C-6′)，71.7(C-8)，71.8(C-4′)，74.9(C-2′)，75.0(C-4′′)，76.9(C-5′)，77.9(C-3′)，78.0(C-2′′)，80.5(C-3′′)，104.4(C-1′)，110.9(C-1′′)，127.1(C-4)，129.3(C-3，5)，130.0(C-2，6)，140.0(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物16為淫羊藿次苷D1 。

化合物17橙紅色針晶(丙酮)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：2.41(3H，d，J=1.9 Hz，6-CH3)，6.57(1H，dd，J=3.8，2.4 Hz，H-2)，7.10(1H，dd，J=4.9，2.3 Hz，H-4)，7.16(1H，d，J=4.5 Hz，H-7)，7.48(1H，d，J=5.6Hz，H-5)，12.06(2H，overlap，1-OH，8-OH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：21.5(6-CH3)，107.9(C-2)，108.8(C-4)，108.9(C-9a)，113.4(C-8a)，120.4(C-5)，124.1(C-7)，132.8(C-10a)，135.0(C-4a)，148.1(C-6)，161.4(C-8)，164.4(C-1)，165.8(C-3)，181.4(C-10)，189.5(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物17為大黃素。

化合物18白色粉末(CH2Cl2)；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.68(3H，s，H-18)，0.80～0.86(9H，ovelap，H-26，27，29)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，1.01(3H，s，H-19)，3.52(1H，m，H-3)，5.35(1H，m，H-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：12.0(C-18)，12.1(C-29)，18.9(C-21)，19.1(C-27)，19.5(C-19)，19.9(C-26)，21.2(C-11)，23.2(C-28)，24.4(C-15)，26.2(C-23)，28.3(C-16)，29.2(C-25)，31.8(C-2)，32.0(C-8)，32.0(C-7)，34.0(C-22)，36.2(C-20)，36.6(C-10)，37.4(C-1)，39.9(C-12)，42.4(C-13)，42.4(C-4)，45.9(C-24)，50.2(C-9)，56.2(C-17)，56.9(C-14)，71.9(C-3)，121.8(C-6)，140.9(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物18為β-谷甾醇。

化合物19白色粉末(CH2Cl2)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：0.67(3H，s，25-CH3)，0.74(3H，s，24-CH3)，0.81(3H，d，J=6.4 Hz，30-CH3)，0.86(3H，s，26-CH3)，0.89(3H，s，27-CH3)，0.91(3H，s，29-CH3)，1.04(3H，s，23-CH3)，2.10(1H，d，J=10.8 Hz，H-18)，2.99(1H，m，H-3)，4.30(1H，d，J=4.7 Hz，3-OH)，5.12(1H，s，H-12)，11.95(1H，s，-COOH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：15.2(C-24)，16.1(C-25)，16.9(C-29)，17.0(C-26)，18.0(C-6)，21.0(C-30)，22.8(C-11)，23.2(C-27).23.8(C-16)，27.0(C-2)，27.5(C-15)，28.2(C-23)，30.1(C-21)，32.7(C-7)，36.3(C-10)，36.5(C-22)，38.2(C-1)，38.3(C-20)，38.4(C-19)，38.5(C-4)，41.6(C-8，14)，46.8(C-9)，47.0(C-17)，52.3(C-18)，54.7(C-5)，76.8(C-3)，124.5(C-12)，138.2(C-13)，178.3(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物19為熊果酸。

化合物20無色粘稠固體(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：1.29(3H，s，H-6)，1.34(6H，d，J=2.3 Hz，3′-CH3×2)，2.08(1H，dd，J=13.0，8.8 Hz，H-1)，2.35(1H，dd，J=12.9，5.1 Hz，H-1)，4.63(1H，dd，J=8.6，5.0 Hz，H-2)，5.99(1H，s，H-4)，6.43(1H，d，J=16.1 Hz，H-1′)，6.67(1H，d，J=16.1 Hz，H-2′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：24.6(Me-6)，29.5(Me-3′)，29.6(Me-3′)，46.5(C-1)，66.9(C-2)，71.5(C-3′)，74.1(C-6)，123.0(C-4)，124.5(C-1′)，148.0(C-2′)，161.2(C-5)，203.0(C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物20為2α,6α-dihydroxy-5-[(E)-3′-hydroxy-3′-methyl-1′-butenyl]-6-methyl-4-cyclohexen-3-one。

化合物21無色晶體(甲醇)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：1.28(3H，s，H-12)，1.47(3H，s，H-11)，1.53(1H，dd，J=14.4，3.7 Hz，H-6a)，1.74(1H，overlap，H-8a)，1.76(3H，s，H-10)，1.99(1H，m，H-6b)，2.42(1H，m，H-8b)，4.21(1H，m，H-7)，5.75(1H，s，H-3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：26.9(C-11)，27.4(C-10)，31.0(C-12)，37.1(C-5)，46.4(C-8)，47.9(C-6)，67.2(C-7)，88.9(C-9)，113.3(C-3)，174.4(C-2)，185.6(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物21為loliolide。

化合物22無色粘稠固體(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：1.29(1H,overlap，H-6a)，1.29(3H，s，H-11)，1.32(3H，s，H-12)，1.42(1H，t，J=11.6 Hz，H-8a)，1.59(3H，s，H-10)，2.01(1H，ddd，J=13.1，4.3，2.2 Hz，H-6b)，2.47(1H，ddd，J=11.7，4.0，2.2 Hz，H-8b)，4.11(1H，m，H-7)，5.78(1H，s，H-3)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：25.3(C-11)，25.7(C-10),30.3(C-12)，36.1(C-5)，48.8(C-8)，50.7(C-6)，65.2(C-7)，88.5(C-9)，113.7(C-3)，173.9(C-2)，183.8(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物22為isololiolide。

化合物23白色粉末(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.33～3.47(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，3.66(1H，m，H-6′)，3.70(3H，s，4-OCH3)，3.81(6H，s，3，5-OCH3)，3.90(1H，m，H-6′)，4.81(1H，d，J=7.4 Hz，H-1′)，6.49(2H，s，H-2，6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：56.5(3，5-OCH3)，61.2(4-OCH3)，62.7(C-6′)，71.6(C-4′)，74.9(C-2′)，78.0(C-3′)，78.4(C-5′)，96.0(C-2，6)，103.1(C-1′)，134.3(C-4)，154.7(C-3，5)，156.0(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物23為3，4，5-三甲氧基苯酚-l-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物24黃白色結(jié)晶(甲醇)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.91(2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5)，7.77(2H，d，J=8.7 Hz，H-2，6)，9.76(1H，s，-CHO)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：116.8(C-3，5)，130.2(C-1)，133.4(C-2，6)，165.2(C-4)，192.8(-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物24為對(duì)羥基苯甲醛。

3.2 細(xì)胞毒活性篩選

對(duì)黃花敗醬中分離得到的24個(gè)化合物在100 μM濃度下對(duì)HCT-116細(xì)胞毒活性進(jìn)行篩選，考察了化合物1～24對(duì)HCT-116細(xì)胞活力的影響。與空白對(duì)照組對(duì)比，化合物1～24對(duì)HCT-116細(xì)胞活力均未顯示出明顯的抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見圖2。

4 結(jié)論

本文對(duì)黃花敗醬二氯甲烷和乙酸乙酯部位進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離鑒定了24個(gè)化合物，包括6個(gè)簡單苯丙素類化合物(2～7)、3個(gè)香豆素類化合物(8～10)、2個(gè)黃酮苷類化合物(11和12)、2個(gè)苯甲醇苷類化合物(13和14)、2個(gè)苯乙醇苷類化合物(15、16)、1個(gè)醌類化合物(17)、1個(gè)甾體類化合物(18)、1個(gè)三萜類化合物(19)、6個(gè)其它類化合物(1和20～24)。其中化合物1為新天然產(chǎn)物，化合物2、3、5～7、9～17、20、22～24為首次從敗醬屬中分離得到。迄今為止，黃花敗醬化學(xué)成分的研究成果多集中在三萜皂苷類成分[2,3]，本文對(duì)于黃花敗醬化學(xué)成分的研究，提供了黃花敗醬和敗醬屬植物更為豐富的化學(xué)信息。據(jù)文獻(xiàn)[24,25]報(bào)道，黃花敗醬提取物對(duì)結(jié)直腸癌具有一定的治療作用，但有關(guān)黃花敗醬抗結(jié)腸癌活性的研究對(duì)象多為黃花敗醬的醇或水提取物，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究甚少。本文對(duì)分離得到的24個(gè)化合物的細(xì)胞毒活性進(jìn)行了研究，與空白對(duì)照組對(duì)比，化合物1～24對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞活力均未顯示出明顯的抑制活性。對(duì)于黃花敗醬抗結(jié)直腸癌藥理作用的活性物質(zhì)還有待進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以期為黃花敗醬的藥用植物資源的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定一定的理論基礎(chǔ)。

圖2 化合物1～24對(duì)HCT-116細(xì)胞活力的影響Fig.2 Cell viability of HCT-116 cells owing to the compounds 1-24 注：抑制作用*，與空白對(duì)照組比較，*P≤0.05，***P≤0.001；促進(jìn)作用#，與空白對(duì)照組比較，#P≤0.05，##P≤0.01，###P≤0.001。Note:*Inhibition,compared with control,*P≤0.05,***P≤0.001;#Promotion,compared with control,#P≤0.05,##P≤0.01,###P≤0.001.