橄欖油摻偽檢測(cè)研究進(jìn)展

周盛敏　姜元榮

[摘要]本文概述了物理、化學(xué)和生物三個(gè)方面的橄欖油摻偽檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展，并對(duì)各方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了梳理，以期為開(kāi)展深入研究提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]橄欖油;摻偽;物理法;化學(xué)法;生物法

中圖分類(lèi)號(hào)：TS227 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.202004

與多數(shù)植物油不同，橄欖油是通過(guò)機(jī)械壓榨的方式將油橄欖果肉細(xì)胞中的油滴釋放出來(lái)，屬于天然“果汁”的食用油，因其悠久的歷史、豐富的營(yíng)養(yǎng)而被貴稱(chēng)為“植物油皇后”“液體黃金”。作為橄欖油中最高級(jí)別的特級(jí)初榨橄欖油，其在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的價(jià)格是其他普通植物油的幾倍甚至數(shù)十倍，即使是精煉橄欖油，其價(jià)格也比一般食用油高出不少。受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，往橄欖油中摻兌橄欖果渣油、種子油甚至化學(xué)添加劑成為不少不法商人的牟利手段，這不僅是對(duì)消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)欺詐，還有可能對(duì)消費(fèi)者的身體健康造成危害。橄欖油的摻偽主要可分為四種，一是使用普通的精煉植物油勾兌，二是將精煉橄欖油混入初榨橄欖油中，三是將橄欖果渣油加入初榨橄欖油中，這三種都是將混有其他低成本油的油種以初榨橄欖油的名義販賣(mài)，而第四種則是將一般初榨橄欖油貼上PDO（原產(chǎn)地保護(hù)）/PGI （產(chǎn)品地理標(biāo)志）的標(biāo)簽以賣(mài)出更高的價(jià)格。

為了保護(hù)消費(fèi)者的相關(guān)利益，除了制定與施行各種標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)以外，有效的橄欖油摻偽檢測(cè)手段也尤為重要，一直以來(lái)都是國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn)。本文將從物理、化學(xué)以及生物三個(gè)方面對(duì)橄欖油鑒別、摻偽分析的研究開(kāi)發(fā)進(jìn)展進(jìn)行概述，為開(kāi)發(fā)更準(zhǔn)確、有效、快速的橄欖油質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)手段提供借鑒。

1 物理檢測(cè)方法

在橄欖油摻偽檢測(cè)方面，物理方法應(yīng)用主流包括感官評(píng)價(jià)、波譜技術(shù)、電子鼻技術(shù)和同位素技術(shù)。

1.1 感官評(píng)價(jià)

橄欖油是唯一一種將感官評(píng)價(jià)列入法規(guī)以檢測(cè)質(zhì)量的食物。歐盟修訂橄欖油和橄欖果渣油特性及分析方法法規(guī)（EEC 2568/91）和國(guó)際橄欖理事會(huì)發(fā)布的橄欖油和橄欖果渣油貿(mào)易準(zhǔn)則（IOOC/1990）都引入了初榨橄欖油感官評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)方法。Procida G等[1]召集了由9人組成的評(píng)審小組來(lái)進(jìn)行橄欖油的感官測(cè)試，這9人均是經(jīng)過(guò)EEC 2568/91培訓(xùn)并具有9年檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)的人員。評(píng)審小組采用國(guó)際橄欖理事會(huì)確定的標(biāo)準(zhǔn)缺陷油脂進(jìn)行培訓(xùn)，根據(jù)EEC 2568/91對(duì)油品的兩種主要典型性缺陷進(jìn)行評(píng)分，缺陷分?jǐn)?shù)越低，橄欖油質(zhì)量越好，從而建立分析模型。

1.2 波譜技術(shù)

橄欖油摻偽檢測(cè)方面的波譜技術(shù)種類(lèi)繁多，主要有紅外光譜、拉曼光譜、同步熒光光譜、核磁共振等，其特點(diǎn)為數(shù)據(jù)量龐大，直讀技術(shù)幾乎無(wú)法滿足摻偽判別或者摻偽定量，所以采集光譜之后，利用其指紋圖譜進(jìn)行大量化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。例如，利用主成分分析、最小二乘法等區(qū)分摻偽橄欖油與純橄欖油之間的微弱差別。

紅外光譜具有樣品處理簡(jiǎn)單、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，其中紅外光為波長(zhǎng)2.5～25μm（或4 800～400cm-1）的輻射光，照射到樣品后，分子吸收中紅外光后產(chǎn)生振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)的改變，形成紅外吸收光譜圖。Gurdeniz G等[2]應(yīng)用中紅外設(shè)備結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)開(kāi)展了初榨橄欖油的定量摻假分析，其利用主成分分析和最小二乘法定量手段，檢測(cè)初榨橄欖油中摻入的玉米油、葵花籽油混合物、棉籽油以及菜籽油，其檢出限為5%，而對(duì)于其他油種的摻入，檢出限為10%。Rohman A等[3]結(jié)合傅里葉紅外和化學(xué)計(jì)量學(xué)的手段，采用判別分析（DA）判別純特級(jí)初榨橄欖油和摻入芥花油（Canolaoil）的特級(jí)初榨橄欖油，使用偏最小二乘（PLS）和主成分回歸（PCR）對(duì)其摻入量進(jìn)行定量分析，研究認(rèn)為波長(zhǎng)范圍3 028～2 985cm-1和1 200～987cm-1用于區(qū)分和定量?jī)煞N油脂，其檢出限為0.108%。

拉曼光譜是研究分子振動(dòng)的一種光譜方法，它的原理和機(jī)制都與紅外光譜不同，分子偶極矩變化是紅外光譜產(chǎn)生的原因，而拉曼光譜是分子極化率變化誘導(dǎo)的。相比紅外光譜測(cè)定官能團(tuán)的不同，拉曼光譜的譜峰更窄，主要針對(duì)分子骨架的測(cè)定，指紋信息豐富，對(duì)C=C雙鍵檢測(cè)的靈敏度高，對(duì)于油品鑒定具有一定的作用。Zhang X F等[4]用拉曼光譜結(jié)合外標(biāo)法，以1 441cm-1峰為標(biāo)準(zhǔn)峰，摻入不同比例的初榨橄欖油，做1 265cm-1峰的強(qiáng)度曲線，檢測(cè)出含有大豆油、葵花籽油、玉米油等的初榨橄欖油，其檢出限為2%。Kim M等[5]在進(jìn)行5%低含量摻雜時(shí)，利用溫控拉曼，使用線性判別分析方法結(jié)合主成分分析方法，根據(jù)溫度的調(diào)整，識(shí)別出5%摻雜的初榨橄欖油和純初榨橄欖油。張朝暉等[6]基于拉曼光譜與橄欖油中不飽和脂肪酸的含量具有相關(guān)性，使用拉曼光譜研究了特級(jí)初榨橄欖油摻偽橄欖果渣油的情況，以摻入果渣油后1 265cm-1和1 650cm-1的拉曼相對(duì)強(qiáng)度增強(qiáng)，1 525cm-1處的精細(xì)結(jié)構(gòu)變小直至消失作為是否摻偽果渣油的定性判定依據(jù)，在1 265cm-1處的拉曼光譜相對(duì)強(qiáng)度值高于540的橄欖油可能存在等級(jí)造假。

同步熒光法技術(shù)與常用的熒光測(cè)定方法最大的區(qū)別是同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器波長(zhǎng)，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)與對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)（或發(fā)射波長(zhǎng)）構(gòu)成光譜圖，稱(chēng)為同步熒光光譜。光譜選擇性高、靈敏度高，適用于復(fù)雜樣品體系的鑒定。Poulli K等[7]用同步掃描熒光法鑒別初榨橄欖油與橄欖果渣油、玉米油、葵籽油、大豆油、菜籽油和核桃油，發(fā)現(xiàn)初榨橄欖油在275～297nm處顯示了一個(gè)雙鍵，在660nm處有一個(gè)響應(yīng)，而其他的油脂在300nm處有強(qiáng)響應(yīng)，可以檢出2.6%的摻假情況。

核磁共振技術(shù)利用固定磁矩的原子核激發(fā)，產(chǎn)生一串強(qiáng)度衰減的可檢測(cè)感應(yīng)信號(hào)，具有前處理過(guò)程簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn)，但也具有運(yùn)行成本高的缺點(diǎn)。Parker T等[8]使用60MHz1H核磁共振法結(jié)合最小二乘法試圖區(qū)別純初榨橄欖油，初榨橄欖油和榛子油混合物。在建立的初榨橄欖油和榛子油摻雜的混合體系中，考察了混合了榛子油0%～13%（w/w）的初榨橄欖油，其檢出限在11.2%（w/w）處。?mejkalová D等[9]利用高能梯度漫射核磁共振譜通過(guò)測(cè)量擴(kuò)散系數(shù)D區(qū)分特級(jí)初榨橄欖油、種子油和堅(jiān)果油。使用判別分析作為定性定量分析手段，其在初榨橄欖油摻偽的最小檢出限為10%葵花籽油、10%大豆油、30%榛子油、30%花生油，但只有在樣品分類(lèi)的基礎(chǔ)上進(jìn)行判別分析才能得到最高的判定準(zhǔn)確度（98%～100%）。

1.3 電子鼻技術(shù)

電子鼻主要由氣敏傳感器陣列、信號(hào)預(yù)處理和模式識(shí)別三部分組成。電子鼻正是利用各個(gè)氣敏器件對(duì)復(fù)雜成分氣體都有響應(yīng)卻又互不相同這一特點(diǎn)，借助數(shù)據(jù)處理方法對(duì)多種氣味進(jìn)行識(shí)別，從而對(duì)氣味質(zhì)量進(jìn)行分析與評(píng)定。其主要機(jī)理是在陣列中的每個(gè)傳感器對(duì)被測(cè)氣體都有不同的靈敏度，正是這種區(qū)別，才使系統(tǒng)能夠根據(jù)傳感器的響應(yīng)圖案來(lái)識(shí)別氣體。電子鼻的工作可簡(jiǎn)單歸納為傳感器陣列→信號(hào)預(yù)處理→神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和各種算法→計(jì)算機(jī)識(shí)別（氣體定性定量分析），常應(yīng)用于風(fēng)味油脂的鑒定。Mildner-Szkudlarz S等[10]使用電子鼻技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)橄欖油中摻偽榛子油進(jìn)行分析鑒定，從18種傳感器中優(yōu)化出9種傳感器，通過(guò)主成分分析的化學(xué)計(jì)量學(xué)手段區(qū)分初榨橄欖油和摻入榛子油的初榨橄欖油，通過(guò)最小二乘法對(duì)摻入量進(jìn)行估計(jì)和評(píng)價(jià)。

1.4 同位素技術(shù)

穩(wěn)定同位素比例分析作為一種指紋圖譜技術(shù)，結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析，通過(guò)測(cè)量13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H和34S/32S，用于以植物產(chǎn)地歸屬為主的植物油摻假鑒定，是一種快速的、不需要樣品前處理的實(shí)驗(yàn)方法。Camin F等[11]收集了大量（N=539）2000年到2005年生產(chǎn)的具有PDO和PGI認(rèn)證的意大利特級(jí)初榨橄欖油，采用IRMS（同位素比值質(zhì)譜儀）和ICP-MS（電感耦合等離子體質(zhì)譜）技術(shù)發(fā)現(xiàn)13C/12C和18O/16O的數(shù)值從意大利北部（Trentino）到南部（Sicily）有上升的趨勢(shì)，且每年都能將不同地域的橄欖油很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。

物理法具有處理過(guò)程實(shí)時(shí)、快速、高效、無(wú)污染、無(wú)損、簡(jiǎn)便、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，但其得到的是整體信號(hào)，無(wú)法得到特異指標(biāo)的信息，需要進(jìn)行大量的化學(xué)計(jì)量學(xué)工作，才能使其顯示特異性指征，所以無(wú)法將油脂的穩(wěn)定性、口感以及典型性與所獲得的信號(hào)一一對(duì)應(yīng)。在大通量橄欖油摻偽篩查過(guò)程中，運(yùn)用物理手段結(jié)合穩(wěn)健的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型，能夠快速區(qū)分可疑油品和真實(shí)油品。

2 化學(xué)檢測(cè)方法

在使用化學(xué)法分析橄欖油摻偽方面，國(guó)際橄欖油理事會(huì)和國(guó)際組織發(fā)布了多種方法、多類(lèi)指標(biāo)來(lái)鑒別初榨橄欖油的真?zhèn)?。COI/T.20/Doc.No.20/Rev.3—2010[12]規(guī)定了高效液相色譜法分析甘油三酯分布的方法，通過(guò)測(cè)試實(shí)際有效碳數(shù)ECN42含量和使用脂肪酸組成推測(cè)的理論有效碳數(shù)ECN42含量的差值來(lái)判定是否為初榨橄欖油。其他各類(lèi)油脂，如橄欖果渣油、葵籽油、玉米油等，其差值均超過(guò)初榨橄欖油。COI/T.15/NC No 3/Rev.11—2016[13]中規(guī)定可食用初榨橄欖油的差值為小于0.2，初榨橄欖燈油的差值為小于0.3。IUPAC 2.431規(guī)定了高根二醇和熊果醇的氣相色譜測(cè)試方法，高根二醇和熊果醇主要是存在于果皮，初榨橄欖油中高根二醇和熊果醇的總量應(yīng)低于4.5%，用于檢測(cè)初榨橄欖油中是否添加了果渣油[14]。甾醇的脫水產(chǎn)物豆甾二烯也被作為判定初榨橄欖油中是否摻有精煉橄欖油的依據(jù)。在高溫的脫色和脫臭精煉過(guò)程中，β-谷甾醇容易脫水形成豆甾二烯，特級(jí)初榨橄欖油一般是在冷榨下獲得的，所以基本不含有豆甾二烯。COI/T.15/NC No 3/Rev.11要求其一般不超過(guò)0.1mg/kg，COI/T.20/Doc.no.11/Rev.2—2001[15]規(guī)定了氣相色譜法分析豆甾二烯的色譜方法。銅葉綠素也叫葉綠素銅，它是葉綠素的一類(lèi)衍生物，在食品工業(yè)中常做著色劑使用，其中原焦脫鎂葉綠酸a是銅葉綠素的主要成分。有些不法商家會(huì)往葵花籽油、大豆油或棉籽油中加葉綠素銅鈉鹽冒充橄欖油銷(xiāo)售。Fang M等[16]使用高分辨質(zhì)譜HPLC-QTrap以及高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器HPLC-DAD鑒定及定量葉綠素銅，當(dāng)檢測(cè)出油脂中原焦脫鎂葉綠酸-a超過(guò)0.05μg/g時(shí)，則認(rèn)為此油可能是利用色素?fù)郊倜俺溟蠙煊?。色譜法建立指紋圖譜庫(kù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的手段鑒定橄欖油是否摻偽也是比較常見(jiàn)的。Dourtoglou V G等[17]利用氣相色譜得到脂肪酸的指紋圖譜結(jié)合主成分分析，建立了一種橄欖油摻偽的鑒別方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，成功鑒別了橄欖油、玉米油、大豆油、葵籽油、棉籽油和它們不同梯度的混合物。同一類(lèi)油都基本聚在了一起，將橄欖油定位，當(dāng)橄欖油有其他油種摻雜時(shí)，隨著摻雜比例的增加，混合樣品的點(diǎn)會(huì)逐漸遠(yuǎn)離橄欖油，朝著其他種類(lèi)油脂的那一類(lèi)靠近。

化學(xué)方法是一類(lèi)常規(guī)方法，通常會(huì)有一類(lèi)或多類(lèi)特征化合物的含量作為是否摻偽的標(biāo)準(zhǔn)，方法傳統(tǒng)成熟，相對(duì)于物理方法更精確、重復(fù)性更高，也可以像物理方法一樣，建立指紋譜庫(kù)，引入化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)摻偽分析進(jìn)行判斷。但是化學(xué)法也有耗時(shí)、需要進(jìn)行大量樣品前處理工作、需要大量人工等缺點(diǎn)，該類(lèi)方法更適用于可疑橄欖油的判定工作。

3 生物檢測(cè)方法

用分子生物學(xué)方法檢測(cè)食用油，是指從食用油中提取DNA，用特定基因引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而鑒別食用油來(lái)源的方法。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于可以定性區(qū)別不同油種，且不受地域、環(huán)境、脂肪酸比例的影響，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)食用油進(jìn)行檢測(cè)越來(lái)越普遍。

基于DNA的分子生物學(xué)鑒別方法主要有常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、高分辨率熔解去曲線（High Resolution Melt，HRM）分析檢測(cè)等技術(shù)，依靠特定基因引物對(duì)食用油中提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)電泳、熒光等手段分析擴(kuò)增結(jié)果，從而對(duì)食用油進(jìn)行定性檢測(cè)。

分子生物學(xué)方法對(duì)食用油的檢測(cè)，前期是從核基因的檢測(cè)開(kāi)始的，如對(duì)橄欖油的檢測(cè)方面，Wu Y等[18]建立了PIP5基因特異片段的檢測(cè)。對(duì)大豆油的檢驗(yàn)方面，Costa J等[19]使用了Lectin基因特異引物檢測(cè)不同加工階段的大豆油。由于核基因拷貝數(shù)低，對(duì)精煉油的檢測(cè)不太適用，現(xiàn)在研究較多的是對(duì)葉綠體基因的檢測(cè)。Vietina M等[20]使用葉綠體RbcL基因?qū)﹂蠙煊蛽絺芜M(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)RbcL通用引物對(duì)不同油種進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，各油種擴(kuò)增出的片段和序列不同，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行HRM（高分辨率熔解去曲線）分析，從而對(duì)油種純度進(jìn)行判斷。

食用油加工過(guò)程中經(jīng)過(guò)很多工序，在脫膠過(guò)程中核酸基本被去除完全，精煉油即使殘留有微量DNA，也已經(jīng)很不完整。Costa J等在大豆油中發(fā)現(xiàn)103bp比118bp的產(chǎn)物擴(kuò)增效果好。Giménez M J等[21]對(duì)橄欖油的檢測(cè)也顯示80bp的擴(kuò)增明顯好于200bp的擴(kuò)增。所以，對(duì)這種微量破碎的DNA檢測(cè)，需要更高效的DNA提取方法和更靈敏的DNA檢測(cè)方法。

對(duì)多種油種的定性檢測(cè)與食用油的摻偽檢測(cè)是目前面臨的挑戰(zhàn)，對(duì)不同油種進(jìn)行DNA提取，開(kāi)發(fā)更靈敏高效的檢測(cè)方法是食用油生物學(xué)檢測(cè)的研究方向。

4 結(jié) 論

隨著物理、化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及其在橄欖油摻偽檢測(cè)研究中的廣泛應(yīng)用，綜合集成應(yīng)用將是一種趨勢(shì)，可以對(duì)橄欖油樣品進(jìn)行定性和定量分析。同時(shí)，還應(yīng)該收集和建立橄欖油樣本庫(kù)，從而更有效地鑒定橄欖油摻偽。

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