豬肉中氯丙嗪殘留UPLC-MS/MS檢測(cè)法的優(yōu)化研究

王婷

摘 要：本文在《豬腎和肌肉組織中氯丙嗪殘留量的測(cè)定》（GB/T 20763-2006）的基礎(chǔ)上優(yōu)化了樣品的提取凈化方式，增加了定性離子，建立了操作便捷、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的豬肉中氯丙嗪殘留量液質(zhì)檢測(cè)的新方法。具體操作為，樣品在堿性條件下經(jīng)特丁基甲醚提取，冷凍離心除脂后取上清液，經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析檢測(cè)。結(jié)果表明，優(yōu)化后的方法在0.5～20ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9997;在0.5～5μg/kg范圍內(nèi)，3個(gè)濃度的加標(biāo)回收率均在75%～95%之間，測(cè)定結(jié)果均滿足國(guó)標(biāo)方法中的重復(fù)性要求（含量范圍：0.750～4.800μg/kg、r=0.4736m-0.1775）。

關(guān)鍵詞：氯丙嗪 ?液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 ?殘留量 ?豬肉

氯丙嗪屬于吩噻嗪類藥物，可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，故被作為中樞多巴胺受體的阻斷劑，具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)吐、抗暈眩等功效[1-3]。當(dāng)前，氯丙嗪常被一些養(yǎng)殖戶違規(guī)添加至家畜飼料中，目的是通過抑制家畜運(yùn)動(dòng)來達(dá)到“短期育肥”的效果，或在家畜長(zhǎng)途運(yùn)輸過程中減少其應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而降低死亡率[4-5]。氯丙嗪的藥物濫用造成其在動(dòng)物體內(nèi)大量殘留，并通過食物鏈進(jìn)入人體，長(zhǎng)期蓄積會(huì)引發(fā)人體食物中毒、肝臟和腎臟病變等，直接危害人體健康[6-7]。目前，歐盟及我國(guó)相關(guān)部門均明令規(guī)定“不得在動(dòng)物源性食品中檢出氯丙嗪”[8-9]。當(dāng)前，我國(guó)對(duì)氯丙嗪藥物在食品中的殘留檢測(cè)方法主要采用《豬腎和肌肉組織中氯丙嗪殘留量的測(cè)定》（GB/T 20763-2006）。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)方法前處理過程中的提取和凈化操作是通過調(diào)節(jié)pH值控制目標(biāo)物在有機(jī)相和水相兩相間重復(fù)萃取，處理過程繁瑣，特丁基甲醚用量大、次數(shù)多，且目標(biāo)物隨特丁基甲醚使用量的增加而不斷損失，導(dǎo)致回收率偏低。因此，本文對(duì)該方法的前處理方法進(jìn)行改進(jìn)，優(yōu)化步驟，建立了操作便捷、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好的前處理方法，希望為提高氯丙嗪的日常檢驗(yàn)效率和標(biāo)準(zhǔn)更新提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

1.1.1 主要儀器及設(shè)備

Thermo TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Fisher科技公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī)，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.1.2 試劑及樣品

1.1.2.1 試劑

鹽酸氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)品，購自北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院;供試試劑試藥：乙腈、甲酸均為色譜級(jí)，氫氧化鈉、特丁基甲醚為優(yōu)級(jí)純，實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水;氫氧化鈉溶液：5mol/L;甲酸水溶液：0.2%（體積分?jǐn)?shù)）;鹽酸氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液：100μg/mL。

1.1.2.2 樣品

將市售豬肉攪碎拌勻，密封，待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱取2.00g（精確到0.01g）均質(zhì)試樣于50mL離心管中，加入0.2mL乙腈混勻，然后加入5mol/L氫氧化鈉溶液400μL，渦流混合30s。置于80±5℃恒溫水浴中1h，期間進(jìn)行兩次渦流混合。1h后取出，冷卻至室溫。精密量取1mL特丁基甲醚加入離心管，高速振蕩15min后置于冷凍離心機(jī)中離心10min（溫度2℃、轉(zhuǎn)速10000r/min），取上清液過0.2μm濾膜上機(jī)。

1.3 儀器分析方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Hypersil Gold C18（內(nèi)徑100×2.1mm，粒徑1.7um）;柱溫：40℃;進(jìn)樣體積：5μL;流速：0.2mL/min;流動(dòng)相A：0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：乙腈。

洗脫程序：0min，B相：5%;0.5min，B相：5%;4min，B相：95%;6min，B相：95%;6.1min，B相：5%;10min，B相：5%。

1.3.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子模式，噴霧電壓3.5kV，蒸發(fā)溫度320℃，離子傳輸管溫度300℃，鞘氣（N2）流量35arb，輔助氣（N2）10arb。

氯丙嗪母離子：319.063amu，子離子：58.585amu、86.434amu、214.124amu、246.156amu，86.434amu為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

按照GB/T 20763-2006中的前處理方法進(jìn)行提取、凈化，發(fā)現(xiàn)氯丙嗪回收率極低。參照標(biāo)準(zhǔn)溯源分析發(fā)現(xiàn)，氯丙嗪易溶于特丁基甲醚，故凈化除酯操作過程中，目標(biāo)物易隨特丁基甲醚流失，從而導(dǎo)致回收率低，故針對(duì)上述問題做出如下調(diào)整。

①將標(biāo)準(zhǔn)中“加入12mL特丁基甲醚，……，待凈化”改為“精密量取1mL特丁基甲醚加入離心管”，在保證充分萃取的前提下，減少醚類有毒試劑的使用量。

②將原標(biāo)準(zhǔn)凈化步驟：“在上述15mL離心管中加入1mol/L磷酸二氫鉀溶液（pH值=3）3mL，……，超聲處理10min”改為“提取后置于冷凍離心機(jī)離心10min（溫度為2℃，轉(zhuǎn)速為10000r/min）”。經(jīng)過離心，離心管內(nèi)液體分為3層——下層為水層、中間層為結(jié)塊的油脂、上層為特丁基甲醚，吸取醚層，過0.2μm有機(jī)濾膜直接上機(jī)測(cè)定。

采用優(yōu)化后的步驟進(jìn)行前處理，有效避免了原標(biāo)準(zhǔn)提取和凈化操作步驟中目標(biāo)物在有機(jī)相和水相兩相間反復(fù)萃取造成的損失，且特丁基甲醚用量大幅降低，優(yōu)化后的回收率提高至75%～95%，穩(wěn)定性好，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性高。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

原標(biāo)準(zhǔn)中氯丙嗪的定性子離子為：58.2amu和86.2amu。由于子離子碎片較小，相對(duì)豐度差異較大，因此容易出現(xiàn)共流出干擾。此外，如果出現(xiàn)陽性臨界值樣品，則難以快速準(zhǔn)確定性。通過儀器優(yōu)化，選取58.585amu、86.434amu、214.124amu和246.156amu為定性子離子，多選出來的兩個(gè)子離子可用于輔助定性。

2.3 檢測(cè)結(jié)果分析

2.3.1 線性實(shí)驗(yàn)

精密量取氯丙嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入特丁基甲醚制成濃度為0.5、1、2、5、10、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，采用“1.3”中色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得氯丙嗪線性方程：Y=21341.9+190076X，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。

2.3.2 方法的靈敏度和穩(wěn)定性

原標(biāo)準(zhǔn)方法中的氯丙嗪檢出限為0.5μg/kg，本研究采用豬肉空白基質(zhì)分別按0.5、1、5μg/kg這3個(gè)水平進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，依據(jù)上述方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果均滿足國(guó)標(biāo)方法中的重復(fù)性要求（含量范圍：0.750～4.800μg/kg、r=0.4736m-0.1775），3個(gè)水平的陽性添加回收率均在75%～95%之間，回收率穩(wěn)定。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的方法在原標(biāo)準(zhǔn)檢出限0.5μg/kg處可以準(zhǔn)確定量。

2.3.3 樣品檢測(cè)結(jié)果

20批次樣品中均未檢出氯丙嗪殘留。

3 結(jié)論

通過對(duì)前處理過程中的凈化步驟進(jìn)行改進(jìn)，采用冷凍離心除脂代替了調(diào)節(jié)樣品pH值重復(fù)萃取操作，不僅使有毒試劑的使用量減少，而且大幅縮減了操作時(shí)間，有效減少目標(biāo)物的損失。該前處理方法操作簡(jiǎn)單，安全性高，結(jié)果準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，靈敏度高于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，故適用于大批量豬肉中氯丙嗪殘留量的檢測(cè)。

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