一個以心臟損害為首發(fā)癥狀的杜氏肌營養(yǎng)不良癥家系的遺傳學(xué)及臨床研究

張惠麗 成秋生 陳 希 李 澤

廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科(廣州 510180)

Duchenne型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種最常見的X連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉疾病，其發(fā)病率約為1/3500男嬰。該病系位于Xp21的DMD基因突變致肌細胞膜上的抗肌萎縮蛋白(dystrophin，相對分子質(zhì)量為427KDa)缺失所致[1]，肌纖維發(fā)生變性壞死，并逐漸被脂肪和結(jié)締組織替代。臨床表現(xiàn)為慢性進行性加重的四肢無力、肌肉萎縮，青少年時期常死于呼吸和循環(huán)衰竭[2]。DMD疾病除骨骼肌受累外多伴心臟損害的特點早已獲得共識[3- 4]，但單純以心臟損害的家系研究在國內(nèi)卻鮮有報道?，F(xiàn)將我們診治的一個以心臟損害為首發(fā)癥狀的DMD 家系的臨床資料做如下分析，以提高臨床醫(yī)師對該病的認識和重視程度。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2016 年 12 月—2017年12月在廣州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的臨床初診DMD合并心臟擴大的先證者和此家系中的其他3名患者家系成員。先證者及家系成員需簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 收集所有患者的年齡、性別、起病初始癥狀、體征、心電圖等一般資料。

1.2.2 采用濕化學(xué)的比色法檢測血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶MB (creatine kinase isozyme MB，CK-MB)、B型腦鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)、乳酸脫氫酶 (Lactate deoxidase，LDH)、羥丁酸脫氫酶 (hydroxybutyrate dehydrogenase，HBDH),谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase，ALT)血清酶水平。各參考值分別為25～200 U/L、2～24 U/L、0～84 pg/mL、114～240 U/L、80～220 U/L、<37 U/L和<40 U/L。

圖1 先證者胸片提示心影增大(A 胸部正位照；B胸部側(cè)位照)

1.2.3 心臟彩色超聲:使用美國APOGEE800型彩色多普勒診斷儀，患者左側(cè)臥位，經(jīng)胸超聲掃查，觀察兩側(cè)房室體積、結(jié)構(gòu)、左心室后壁和室間隔厚度、瓣膜結(jié)構(gòu)和活動度、 房室反流部位和程度，評價心臟功能等。各腔參考值分別為，右心房和右心室內(nèi)徑均<20 mm、左心房內(nèi)徑19～35 mm、室間隔厚度6～11 mm、左心室內(nèi)徑35～50 mm、左室壁厚度6～11 mm，超過正常參考值為心房和心室擴大；左心室射血分數(shù)為(60±8)%，<50%提示左室收縮功能降低。

1.2.4 征得先證者及家系成員知情同意后，靜脈采集抗凝血5 mL，用試劑盒抽提外周血基因組DNA，送至北京空軍航空醫(yī)學(xué)研究所附屬醫(yī)院分子病理中心進行DMD基因檢測。對外顯子缺失或重復(fù)患者，采用多重連接依賴性探針擴增(MLPA)技術(shù)檢測79個外顯子；對點突變患者，采用變性高效液相色譜法(DHPLC)進行基因測序。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料

先證者IV- 6, 男， 12歲，行遺傳咨詢前來就診?；颊邿o任何肌無力癥狀，目前走路正常，蹲下起立迅速，跑步快。既往體健。患者為足月順產(chǎn)兒，母親孕期正常，出生時情況良好。父母非近親結(jié)婚，其哥哥在校期間因軍訓(xùn)過勞后出現(xiàn)喘氣困難，乏力，隨后住院治療，診斷為“心肌病”，不久因“心功能不全”去世。內(nèi)科檢查：生命體征平穩(wěn)，皮膚鞏膜無黃染，淺表淋巴結(jié)不腫大，心前區(qū)未觸及震顫，心界擴大，心律齊，心音正常，心前區(qū)可聞及3級收縮期雜音。肺部聽診無異常，肝、脾未觸及。神經(jīng)系統(tǒng)檢查：言清語利，高級皮層功能粗測正常，顱神經(jīng)未見異常，雙小腿肥大，四肢肌力5級，肌張力正常，生理反射存在，病理反射未引出，感覺及共濟未見異常。實驗室檢查：血清酶學(xué)均升高(表1)。心電圖：異常Q波，心電軸右偏。心彩超：左室明顯增大，左室壁運動普遍降低，左房增大，二尖瓣關(guān)閉不全，三尖瓣輕度關(guān)閉不全，左心室收縮功能明顯減輕(EF 28%)(表2)。X線提示心影增大，心胸比例約0.62 (圖1)。

2.2 家系成員

該家系來自廣東省，該家系共9人發(fā)病，全是男性患者，遺傳方式符合X染色體隱性遺傳。目前5名家系成員均已經(jīng)去世，分別為：Ⅱ-1成員因心臟病于50歲去世；Ⅱ- 9 成員因心臟病于40歲去世；Ⅲ-12成員因心臟病于33歲去世；Ⅳ-1 成員于2歲去世，死因不祥；Ⅳ- 5 成員因“心功能不全”于13歲去世。除Ⅳ-1 成員年齡幼小，肢體活動情況無法判斷外，其余4名家系成員生前均無肢體明顯無力，日常運動情況與常人無異。家系圖見圖2。家系中其它的患者(除先證者Ⅳ- 6外)情況如下：

圖2 家系圖

患者Ⅳ- 7，先證者弟弟，男，8歲，目前走路正常，蹲下起立迅速，跑步快，無腿痛，既往體健。患者為足月順產(chǎn)兒，母親孕期正常，出生時情況良好。父母非近親結(jié)婚，其大哥因“心功能不全”去世。其二哥行遺傳咨詢發(fā)現(xiàn)存在心臟擴大。內(nèi)科檢查：無特殊。神經(jīng)系統(tǒng)檢查：除雙小腿肥大、堅實外，其它未見異常。實驗室檢查：血清酶學(xué)均升高(見表1)。心電圖：竇性心律不齊，ST段抬高，異常Q波。心彩超：心內(nèi)結(jié)構(gòu)、活動期血流未見明顯異常，左室舒張功能正常(見表2)。

患者Ⅳ-11，先證者表親，男，15歲，患者于4歲時體檢發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)氨酶升高，經(jīng)多項肝炎病毒檢查未見異常。10歲時走路正常，蹲下起立可，能跑能跳，但打籃球自覺雙上肢乏力。目前15歲仍可走路跑步，但較慢，蹲下起立可，可打羽毛球及跳繩?；颊邽樽阍缕矢箖海?dāng)時臍帶繞頸，幼時運動發(fā)育與同齡人無異。父母非近親結(jié)婚，有一舅舅因“心臟病”于33歲去世。內(nèi)科查體未見異常。神經(jīng)科查體除輕度翼狀肩，雙小腿肥大、堅實外，未見異常。實驗室檢查：血清酶學(xué)均升高(見表1)。心電圖：輕度T波改變，異常Q波。心彩超：左房左室增大，左心室收縮功能稍減低，舒張功能正常(表2)。腓腸肌活檢：HE：肌束結(jié)構(gòu)尚清晰，但肌纖維圓形化和大小不等，并可見少量中央核，但肌纖維壞死不明顯，間質(zhì)內(nèi)無明顯炎癥細胞侵潤和纖維組織增生。ATP酶：未見明顯群群化現(xiàn)象。NADH染色(-)，改良Gomori染色(-)，脂肪染色(-)，Dystrophin染色均(-)。電鏡：偶見肌纖維萎縮。

患者Ⅳ-12，先證者表親，男，3歲，患者目前無肌無力癥狀，走路正常，蹲下起立迅速，跑步快。既往體健?；颊邽樽阍马槷a(chǎn)兒，母親孕期正常，出生時情況良好。其父母非近親結(jié)婚。哥哥患心臟病。內(nèi)科查體未見異常。神經(jīng)科查體除雙小腿肥大、堅實外，未見異常。實驗室檢查：血清酶學(xué)均升高(見表1)。心電圖：輕度T波改變，異常Q波。暫未完善心臟超聲檢查。

2.3 血清酶學(xué)

患者的CK、CK-MB、BNP、LDH、HBDH、AST和ALT水平均高于正常值 (見表1)

2.4 心電圖和心臟彩色超聲檢查結(jié)果

所有患者(100%)都有心電圖異常，且存在2項及2項以上的指標(biāo)異常，包括異常Q波，輕度T波改變。其中1個患者(25%)存在竇性心律不齊，1個患者(25%)存在電軸右偏。除患者Ⅳ-12外，其他患者都接受超聲心動圖檢查，其中先證者IV- 6和患者Ⅳ-11的心臟結(jié)構(gòu)有器質(zhì)性病變，表現(xiàn)為左房左室增大，左心室收縮功能，提示存在擴張性心肌病可能。見表2。

表1 家系成員的血清酶水平

CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶MB；BNP：B型腦鈉肽；LDH：乳酸脫氧酶；HBDH：羥丁酸脫氧酶；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶

表2 家系成員的超聲心動圖檢測值

2.5 基因檢測結(jié)果

所有患者行MLPA檢測未見DMD外顯子缺失重復(fù)。進一步行點突變測序發(fā)現(xiàn)DMD外顯子40存在無義突變c.5632C>T, p(Gln1878*)。

2.6 肌肉病理

目前只有患者IV-11已行肌肉活檢術(shù)。術(shù)后病理HE染色符合典型的肌營養(yǎng)不良改變，免疫組化染色見C/R/N-Dystrophin染色均(-),符合DMD疾病的診斷。

3 討 論

臨床上DMD病情嚴重，預(yù)后差。一般3～5歲起病，以慢性進行性加重的四肢無力為主要表現(xiàn)，10歲后喪失行走能力，20歲左右死于呼吸循環(huán)衰竭。BMD是其等位基因型疾病，病情進展相對緩慢，首次發(fā)病15～20年后仍可有行走能力，有接近正常的生存年限[5]。DMD疾病除骨骼肌系統(tǒng)受累外多伴心臟損害的特點早已獲得共識。文獻報道[6]90%的DMD可出現(xiàn)亞臨床心肌損害，但通常至10歲以后，才表現(xiàn)出明顯的心臟癥狀， 這是由于患者行走能力下降，活動減少，心臟癥狀常被嚴重的骨骼肌無力癥狀掩蓋。大約70% 的 BMD 患者會伴有不同程度的心臟損害，大部分患者終生沒有心功能不全的癥狀[7]。因為癥狀隱匿，部分患者失去最佳治療時機[8]。

文獻報道[9]DMD患者心臟損害表現(xiàn)多樣，最常表現(xiàn)形式為心肌病和心律失常，心肌病表現(xiàn)為心臟擴大。國內(nèi)研究學(xué)者[10]報道DMD患者心房和心室均擴大，尤以左心房和左心室擴大明顯。亦有文獻報道[11]對于低齡組DMD患兒，其超聲心動圖結(jié)果未出現(xiàn)左心室肥厚及心肌病表現(xiàn)。本研究中兩名患者存在心房和心室大，射血分數(shù)降低，符合擴張型心肌病表現(xiàn)。國內(nèi)外研究結(jié)果不相一致，考慮與研究入組的對象年齡不同相關(guān)。

除心肌病外，DMD患者心臟損害常表現(xiàn)為心律失常，而心律失常最簡便可靠的檢測方法為心電圖。心電圖異常發(fā)生頻率在各研究組中不相一致，但均認為心電圖異常明顯早于心臟結(jié)構(gòu)及功能的變化[11- 12]。同樣，本研究家系中患者IV- 7雖未出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)及功能變化，但已出現(xiàn)心電圖異常：竇性心律不齊，ST段抬高，異常Q波，與既往研究相符[11- 12]。DMD患者常見的心電圖損害包括PR間期縮短、異常Q波、V1導(dǎo)聯(lián)R波高大[13]，且心電圖異常的類型與患兒年齡段相關(guān)[11]。本研究的家系成員中，雖然只有4名患兒，但均出現(xiàn)異常Q波。已有研究[14]報道異常的Q波是由于心臟浦肯野纖維的損害造成。心電圖檢查簡單易行，對DMD患兒應(yīng)行常規(guī)檢查，以期早期發(fā)現(xiàn)心臟損害，早期予以干預(yù)。

既往研究認為，心臟損害可能是DMD疾病的合并癥狀，隨著年齡的增長和(或) 病程的延長有升高的趨勢可能[12]。但本家系中的所有患者表現(xiàn)為明顯的心功能異常的同時，但肢體乏力不明顯，日?；顒硬皇芟?，提示骨骼肌不受累，或遠不如心肌受累明顯，此與一般的DMD/BMD患者病程表現(xiàn)不一致。已有文獻報道，DMD基因缺陷除可引起重型DMD和輕型BMD外，還可引起X連鎖擴張型心肌病(X-linked dilated cardiomyopathy，XL-DCM)。后者是DMD編碼的dystrophin蛋白在心臟的表達被選擇性的損害，出現(xiàn)迅速進展的心臟擴大和循環(huán)衰竭，但骨骼肌較少受累[15]。本研究中，先證者的哥哥生前運動情況良好，13歲時在校期間因軍訓(xùn)過勞后出現(xiàn)喘氣困難，乏力，隨后住院治療，診斷為“心肌病”，不久因“心功能不全”去世。整個病情發(fā)展迅速，且骨骼肌較少受累，提示先證者的哥哥可能為XL-DCM。隨后進一步詳細檢查先證者IV- 6發(fā)現(xiàn)，先證者Ⅳ- 6在缺乏骨骼肌受累的情況下,但出現(xiàn)明顯的心臟擴大，左室壁運動普遍降低，左室收縮功能明顯減弱，應(yīng)高度懷疑XL-DCM診斷。同樣本研究家系里的其它患者均出現(xiàn)各種程度的心臟損害，但骨骼肌無受累或受累輕微。所以推測該家系的診斷應(yīng)修正為XL-DCM。

目前關(guān)于DMD基因型與心臟表型的相關(guān)研究有限。國外研究[16]報道DMD基因第12和14～17號外顯子與擴張型心肌病相關(guān)，國內(nèi)研究[10]報道DMD基因第3、 4、21、22和53號外顯子突變與心臟損害相關(guān)。季蘇瓊學(xué)者[17]研究報道7例伴心臟損害的基因型： 3～11號外顯子缺失，3號外顯子缺失，4號外顯子缺失， 3～12外顯子缺失，2號外顯子缺失，45～47外顯子缺失，45～48外顯子缺失。運用預(yù)測模型，Tandon學(xué)者[18]發(fā)現(xiàn)閱讀框規(guī)則同樣可能適用于心臟表型預(yù)測，即整碼突變的患者傾向于出現(xiàn)更溫和的心臟表型。本家系所有患者，對其采用MLPA法未能檢測出DMD基因大片段的缺失或重復(fù)。隨后進一步發(fā)現(xiàn)家系成員存在一個致病性的無義點突變，不能用閱讀框規(guī)則來解釋其嚴重的心臟病變。將來仍需收集更多病例，以分析DMD基因型與心臟表型的關(guān)系。

近年來，選擇性以心肌受累的DMD/BMD家系陸續(xù)有報道。國內(nèi)劉亞欣學(xué)者[19]報道了一個BMD合并心臟擴大的家系。該研究報道的BMD家系患者均有骨骼肌病變，但進展相對緩慢，表現(xiàn)為雙下肢進行性乏力、肌肉酸痛，家系患者均有心臟病變，該家系存在DMD 基因缺失突變(c.4998_5000Del GCA,p.1667del)，導(dǎo)致1667位丙氨酸缺失。Tang學(xué)者[20]報道了一個高CK血癥的X-linked 擴張型心肌病家系，該家系患者存在DMD 基因外顯子1的剪切位點突變(c. 31+1G> C). Tsuda學(xué)者[21]報道了一個擴張型心肌病的BMD家系，2名患者骨骼肌受累輕微，但心肌受累嚴重，其中一名于14歲去世，家系患者存在DMD基因外顯子27的移碼突變(c.3779_3785delCTTTGGAinsGG)。Obler 學(xué)者[22]報道了一個5代共6個患病的家系，其中5個患者在20～30歲接受心臟移植或因心臟病去世，家系患者存在DMD基因第1號外顯子的移碼突變(IVS1+1 G>T)。Chamberlain學(xué)者[23]報道了一個存在DMD基因第13～16號外顯子的重復(fù)突變的XL-DCM家系。本研究報道的家系患者雖有血清酶學(xué)等異常改變，但無明顯的骨骼肌受累，且家系多名患者皆因心臟病早逝，提示心肌病變與骨骼肌病變程度極度不平行。本家系所有患者，對其采用MLPA法未能檢測出DMD基因大片段的缺失或重復(fù)。進一步行點突變測序，發(fā)現(xiàn)DMD 基因第40號外顯子存在無義突變(c.5632C>T, p(Gln1878*)。由此可見XL-DCM的基因型多樣，XL-DCM基因型與心臟表型的關(guān)系尚不明確。

抗肌萎縮蛋白在心臟的表達被選擇性的損害，及心肌受損的程度，目前機制不明。有文獻報道[24]心肌肌鈣蛋白T和抗肌萎縮蛋白與人的擴張型心肌病有關(guān)。另有文獻報道[25]利用抗肌萎縮蛋白亞型在心肌細胞中的亞細胞定位和DMD模型小鼠的表型分析，證明心肌病變主要是由全長型抗肌萎縮蛋白缺陷引起。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展，XL-DCM機制研究將進一步發(fā)展。

總之，本研究報道了一個以心臟損害為首發(fā)癥狀的假肥大肌營養(yǎng)不良癥家系，家系患者出現(xiàn)嚴重的心臟病變，表現(xiàn)為擴張性心肌病及心電圖異常，且心電圖異常明顯早于心臟結(jié)構(gòu)及功能的變化。致病突變?yōu)镈MD第40號外顯子存在無義突變(c.5632C>T, p(Gln1878*)。家系患者呈現(xiàn)心肌受累與骨骼肌受累完全不匹配，考慮為X連鎖擴張型心肌病。本研究進一步擴大了X連鎖擴張型心肌病的基因突變譜。