響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助酶解制備大豆降血糖肽的研究*

段雙庚 張佳鑫 江明珠*

1（江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018）

2（江蘇省大港中學(xué)，江蘇鎮(zhèn)江 212028）

糖尿病逐漸成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后的第三大人類健康殺手，其中多為Ⅱ型糖尿病。目前服用阿卡波糖等降血糖藥物存在惡心、嘔吐等不良反應(yīng)，而具有降血糖功效的天然降糖產(chǎn)物能很好地彌補(bǔ)這些缺陷。有研究表明，蛋白水解產(chǎn)生的多肽可以作為一類α-葡萄糖苷酶抑制劑，與小腸絨毛細(xì)胞表面的α-葡萄糖苷酶活性部位結(jié)合，阻礙雙糖水解，降低餐后血糖，具有輔助降血糖的作用。目前，蠶蛹降糖多肽、漢麻籽粕多肽、啤酒糟多肽、苦瓜多肽和鯊魚肝多肽等均被證明有降血糖活性。大豆含38%以上的蛋白質(zhì)，氨基酸種類較全，是一種優(yōu)良的植物源蛋白質(zhì)，而目前關(guān)于大豆降血糖多肽的研究報(bào)道較少。

超聲波可改變大分子物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)型，使其易于降解。蛋白質(zhì)經(jīng)過超聲波預(yù)處理再用蛋白酶處理，可促進(jìn)酶解進(jìn)程，提高多肽得率。本研究利用超聲輔助酶解大豆蛋白，應(yīng)用響應(yīng)面法分析試驗(yàn)提高大豆蛋白降血糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率，為大豆降血糖肽的后續(xù)研究提供理論依據(jù)，也為大豆蛋白的綜合利用提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小白鼠，江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證編號(hào):NO.201600107）。

大豆分離蛋白，河南天辰生物科技有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶，國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；菠蘿蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（PNPG），阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波發(fā)生器，張家港錦濤超聲電器有限公司；UV-9100 型分光光度計(jì)，美國尤尼柯（上海）儀器有限公司；SpectraMax i3 多功能酶標(biāo)儀，美國分子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠源α-葡萄糖苷酶制備

脫臼處死小白鼠，用0 ℃生理鹽水洗去雜物，液氮中研磨。將pH 值6.8、濃度0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）與液氮研磨粉混合，按照體積質(zhì)量比10∶1 配比，渦旋提取60 s，4 ℃、8 000 r/min 離心15 min，取上清。

1.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測(cè)

參考李婷等方法并進(jìn)行一定修改：96 孔板上加80 μL PBS 緩沖液（pH 值6.8），再加入小鼠小腸提取液10 μL，10 μL 樣品溶液，混勻，37 ℃恒溫靜置15 min，加入10 μ L 5mg/mL 的PNPG，混勻后37 ℃下恒溫反應(yīng)15 min。加入100 μL 0.5 mol/L 的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（OD），計(jì)算公式為：

現(xiàn)有文獻(xiàn)從貿(mào)易邊際的角度來分析物流績(jī)效對(duì)一國產(chǎn)品出口影響的并不多。盛丹和包群（2011）［17］認(rèn)為基礎(chǔ)設(shè)施的建設(shè)能顯著促進(jìn)出口增長(zhǎng)的二元邊際，且對(duì)擴(kuò)展邊際的促進(jìn)作用優(yōu)于集約邊際。黃玖立和徐旻鴻 （2012）［18］考察了境內(nèi)運(yùn)輸成本對(duì)地區(qū)出口模式的影響，認(rèn)為境內(nèi)運(yùn)輸成本顯著制約著一個(gè)地區(qū)產(chǎn)品出口的擴(kuò)展邊際，而對(duì)集約邊際的影響并不明顯。而Feenstra和Ma（2014）［19］在考慮經(jīng)合組織內(nèi)部貿(mào)易時(shí)，發(fā)現(xiàn)港口效率對(duì)出口集約邊際的影響比對(duì)出口擴(kuò)展邊際的影響更為顯著。

其中：ODA表示反應(yīng)中不加抑制劑的試驗(yàn)組吸光值；ODB表示反應(yīng)中加抑制劑的試驗(yàn)組吸光值；ODC表示空白試驗(yàn)組的吸光值，以緩沖液代替抑制劑和PNPG 溶液，消除試劑底色對(duì)吸光值的影響。

1.3.3 多肽含量的檢測(cè)

采用Folin-酚法測(cè)定。

1.3.4 蛋白水解酶篩選方法

稱取大豆蛋白，按料液比為6∶100（g∶mL）配制，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值為11，以促進(jìn)蛋白溶解，室溫下攪拌30 min；調(diào)節(jié)pH 值為各蛋白酶的最適pH 值，酶與底物比為5 000 U/g，在各蛋白酶的最適溫度下反應(yīng)30 min，100 ℃滅酶活10 min，8 000 r/min 離心5 min，測(cè)定其α-葡萄糖苷酶抑制活性，選擇對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高的蛋白酶。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助酶法制備大豆降糖肽試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面曲面分析進(jìn)行制備條件的優(yōu)化，并運(yùn)用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件分析得到最優(yōu)制備條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白水解酶篩選試驗(yàn)

圖1 不同蛋白酶水解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

蛋白水解酶篩選試驗(yàn)結(jié)果見下頁圖1。從圖1中可以看出，胰蛋白酶水解產(chǎn)物抑制率最高，木瓜蛋白酶最低；菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物為負(fù)抑制率，其水解產(chǎn)物可能具有激活α-葡萄糖苷酶的作用。上述結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是，由于堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶這3 種蛋白酶的酶切位點(diǎn)較為廣泛導(dǎo)致產(chǎn)物多樣；胰蛋白酶酶切位點(diǎn)較為專一特殊，酶切位點(diǎn)集中在Arg、Lys 為羧基端的肽鍵部分，由于這種專一而特殊的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生的多肽序列能夠?qū)Ζ?葡萄糖苷酶分子產(chǎn)生抑制作用。因此，選擇胰蛋白酶作為試驗(yàn)用酶。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化大豆蛋白降血糖肽的制備工藝

2.2.1 酶解試驗(yàn)響應(yīng)面分析

酶解試驗(yàn)響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1，用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件分析，建立響應(yīng)面的回歸模型，分析結(jié)果見表2，響應(yīng)面回歸方程為：Y（%）=53.45+0.48X1+1.62X2+0.44X3+0.44X1X2+0.088X1X3+0.26X2X3－1.68X12－2.12X22－1.42X32。

表1 Box-Behnken 酶解響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 酶解過程回歸方程各項(xiàng)的方差分析

從表2 的方差分析可以得出回歸方程的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)極其顯著，說明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系。交互項(xiàng)極其顯著，說明各因素之間的交互作用很好，整個(gè)響應(yīng)面基于各因素間的交互作用構(gòu)成。失擬項(xiàng)極其不顯著，說明試驗(yàn)的誤差很小。

2.2.2 超聲預(yù)處理試驗(yàn)響應(yīng)面分析

超聲波試驗(yàn)響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3，通過建立響應(yīng)面的回歸模型，分析結(jié)果見表4。分析得到的響應(yīng)面回歸方程為：Y（%）=64.74+0.48X4+0.46X5+0.11X6+0.22X4X5－0.13X4X6+0.088X5X6－2.63X42－2.50X52－0.39X62。

表3 Box-Behnken 超聲波預(yù)處理響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 超聲波預(yù)處理回歸方程各項(xiàng)的方差分析

從表4 的方差分析可以得出α-葡萄糖苷酶抑制率方程的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)中除X6、X62不顯著，其余項(xiàng)極其顯著，說明各具體因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的一次線性關(guān)系。交互項(xiàng)不顯著，因此說明各因素之間的交互作用較差，響應(yīng)面因素選擇需要在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步改善。失擬項(xiàng)極不顯著，因此說明試驗(yàn)的誤差很小。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析

通過響應(yīng)曲面分析酶解時(shí)間（X1）、加酶量（X2）、酶解底物濃度（X3）；超聲波處理時(shí)間（X4）、超聲波功率（X5）、超聲波預(yù)處理底物料液比（X6）對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響情況，結(jié)果分別見圖2～圖7。

由響應(yīng)曲面圖可以直觀的分析各因素交互作用對(duì)α-葡萄糖苷抑制率的影響，曲線密集度越大或陡峭程度越高表明對(duì)抑制率得影響越大，因此在本試驗(yàn)條件參數(shù)范圍內(nèi)，酶解過程中，加酶量對(duì)抑制率的影響要大于酶解時(shí)間和酶解底物濃度的影響，酶解時(shí)間和加酶量的交互作用極顯著，加酶量和底物濃度的交互作用顯著；超聲波預(yù)處理過程中，超聲時(shí)間比超時(shí)功率和底物濃度對(duì)抑制率的影響顯著。由響應(yīng)曲面和等高線圖以及回歸方程分析可知，最佳制備條件為：酶解時(shí)間22.0 min、加酶量6 416.61 U/g、酶解底物濃度2.10%；超聲時(shí)間20.9 min，超聲功率245.9 W，超聲底物濃度6.27%。在此條件預(yù)測(cè)抑制率達(dá)到64.82%。為驗(yàn)證模型可靠性，進(jìn)行3 次驗(yàn)證，最終得大豆蛋白肽的抑制率為64.79%，與預(yù)測(cè)值基本一致。

圖2 X1 及X2 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面

圖3 X1 及X3 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面

圖4 X2 及X3 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面

圖5 X4 及X5 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面

圖6 X4 及X6 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面

圖7 X5 及X6 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的響應(yīng)曲面

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法分別優(yōu)化酶解過程和超聲波預(yù)處理輔助酶解過程，得到大豆蛋白肽的α-葡萄糖苷酶抑制率與未經(jīng)超聲波預(yù)處理的試驗(yàn)組比較，α-葡萄糖苷酶抑制率提高了19.01%，這可能是超聲波預(yù)處理對(duì)大豆蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了影響。本試驗(yàn)為進(jìn)一步開發(fā)大豆天然降血糖多肽提供了研究基礎(chǔ)，為Ⅱ型糖尿病患者提供了新型降血糖多肽，也為大豆蛋白的綜合利用提供新的方向。