黃金燦，張磊，常永生

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，天津300070）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一種常見的代謝紊亂疾病，隨著飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣的改變，患病率正呈現(xiàn)快速增高的趨勢。其主要特征為循環(huán)中葡萄糖、脂質(zhì)和炎癥因子的增加，脂肪酸氧化異常等，脂肪酸氧化的減少，使得細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累，嚴(yán)重時會導(dǎo)致肝臟脂肪變性[1]。

Krüppel 樣轉(zhuǎn)錄因子 9（KLF9）屬于 KLFs 家族中的一員，又稱基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白1（basic transc ription element-binding protein-1, BTEB1），是一種鋅指蛋白，初期是從大鼠肝臟cDNA 文庫中克隆獲得，參與調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄[2]。其中KLF9 在腎、肺、肝臟、腦、胸腺、睪丸及脾臟中均有表達(dá)，但是其表達(dá)量在腦組織中相對較高[3-5]。KLF9 與C/EBPα直接相互作用并結(jié)合到過氧化物酶體增殖物活化受體PPAR-γ 的啟動子激活元件上促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的發(fā)育分化[6]。在肝癌細(xì)胞系HepG2 細(xì)胞中，KLF9 通過激活 PPAR-γ 的表達(dá)，促進(jìn)脂合成，從而導(dǎo)致脂滴的異位儲存影響脂肪變性[7]。有最新研究報道，地塞米松可促進(jìn)KLF9 表達(dá)，增加肝臟糖異生，最終導(dǎo)致高血糖現(xiàn)象[8]。但是有關(guān)KLF9 在脂肪酸氧化的研究鮮有文章報道。本研究通過構(gòu)建及驗證KLF9 基因過表達(dá)的腺病毒，進(jìn)一步在肝原代細(xì)胞和小鼠體內(nèi)過表達(dá)KLF9，初步探究KLF9 在肝臟脂肪酸氧化方面的功能。

1 材料與方法

1.1 材料 KLF9 擴增序列引物（TSINGKE），擴增序列：5′-TTGGCGCGCC AAGCCACCATGTCCGCGGCC GCCTACAT-3′（正向）；5′-CGACGCGTCGTCACTTGTC ATCGTCATCCTTGTAGTCGATGTCATGATCTTTATA ATCACCGTCATGGTCTTTGTAGTCCAAGGGGCTGG CAAGAGCCT-3′（反向）；兩端分別添加 PmeI 和PacI 酶切位點，C 端加 3×Flag 標(biāo)簽。PmeI 和 PacI 酶、primer star DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、dNTPs（Takara 公司）；T-easy 質(zhì)粒、實時定量 PCR MIX、Trizol（Invitrogen）；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 和胎牛血清（Sigma），Lipofectamine2000。pAdTrack-CMV,pAd－Track-U6，E.coli.BJ5183,DH5α 感受態(tài)細(xì)菌，HepG2細(xì)胞系，PPAR-γ 協(xié)同刺激因子PGC 1-α 啟動子以及人胚腎細(xì)胞系 293A 由本實驗室保存。pGL3-Basic，pRL-TK 載體購自Promega 公司，pcDNA3.1 購自 Invitrogen 公司，Dual-Luciferase Reporter Assay system（Promega）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI 公司）；青霉素、鏈霉素、胰酶（Solarbio）；明膠和膠原酶（Sigma公司）。anti-KLF9 抗體（abcam，ab227920），anti-PGC1-α 抗體（abcam，ab54481），anti-flag 抗體（Sigma，F(xiàn)7425）。雄性，6 周齡，體質(zhì)量 22～25g 的 12 只 C57BL/6J 小鼠購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，小鼠飼養(yǎng)和管理按照天津醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2 KLF9 腺病毒的構(gòu)建

1.2.1 KLF9 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及腺病毒包裝 將測序正確的連接在T-easy 質(zhì)粒上KLF9 酶切下來，定向連入穿梭載體pAdTrack-CMV 后提質(zhì)粒。取8 μg質(zhì)粒，經(jīng)PmeI 酶切7 h 充分線性化，用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于 20 μL 去離子水中。取100～500 ng 酶切質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E.coli.BJ5183 感受態(tài)細(xì)菌。以200 μL LB 培養(yǎng)基重懸細(xì)菌，涂于卡那霉素抗性的LB 平板，置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)15～20 h。挑克隆，置于5 mL 有卡那霉素抗性的LB 培養(yǎng)基，37℃搖床過夜后提質(zhì)粒，通過PacI 酶切可得3.0 和4.5 kb兩條帶，即為陽性克隆。將陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，涂板挑菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒。取14 μg所得的重組質(zhì)粒用PacI 酶切7～9 h，經(jīng)酚/氯仿抽提，溶于20 μL 去離子水。將重組質(zhì)粒以轉(zhuǎn)染密度50%～80%接種于10 cm 培養(yǎng)皿的293A 細(xì)胞中，孵箱中培養(yǎng)10～15 d，不用換培養(yǎng)基，隔天補500 μL DMEM 完全培養(yǎng)基。一般轉(zhuǎn)染5～7 d 后可以通過熒光顯微鏡觀察到GFP 斑。

1.2.2 KLF9 腺病毒的擴增 將構(gòu)建好的KLF9 腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)293A 細(xì)胞，48 h 后將細(xì)胞收到50 mL離心管中。離心去上清后，在液氮和37℃反復(fù)凍融4次，4℃12 000 r/min 離心，收集上清，即病毒裂解液。第2 輪擴增，加病毒裂解液到6 個15 cm 培養(yǎng)皿（接種293A 細(xì)胞，匯合度90%），細(xì)胞全部呈綠色且30%～50%細(xì)胞懸浮時，收集細(xì)胞，離心去上清，在液氮和37℃反復(fù)凍融4 次，收集病毒裂解液。第3 輪擴增，步驟同第2 輪擴增。

1.2.3 KLF9 腺病毒的純化 先在50 mL 離心管中緩慢加入1.4 g/mL 氯化銫8 mL，再緩慢加入1.2 g/mL氯化銫6 mL，在不連續(xù)梯度頂部加入20 mL DMEM 5%病毒保存液。4℃，100 000×g，離心 90 min。抽吸病毒帶至無菌15 mL 離心管中，加入1×TE 把溶液濃度降低到1.2 g/mL 以下。用連續(xù)密度發(fā)生器將12 mL 1.4 g/mL 和14 mL 1.29 g/mL 氯化銫連續(xù)密度梯度加入，在密度梯度頂部加入8～10 mL 上述稀釋的病毒懸液，4 ℃，100 000×g離心 16～20 h。抽吸藍(lán)白色病毒帶透析后，即為純化的腺病毒，可用于下一步尾靜脈注射老鼠。

1.3 細(xì)胞實驗

1.3.1 腺病毒感染細(xì)胞及Trizol 法提取RNA 用經(jīng)典的灌流-膠原酶消化法獲得小鼠肝臟原代細(xì)胞，鋪至 6 孔板中，用 1640（10%的血清，100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素）培養(yǎng)，感染病毒前換新鮮的培養(yǎng)基。每個孔加120 pfu 的病毒。采用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)293A 細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 鏈霉素，細(xì)胞在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞。感染病毒前換新鮮的培養(yǎng)基。每個孔加120 pfu的病毒，Trizol 法提取293A 細(xì)胞和肝臟原代細(xì)胞總RNA，超微量分光光度計定量，取 2 μg 總 RNA，加入Random primer 用Thermofisher 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以100ngcDNA 為模板，在羅氏LightCycler96儀器上進(jìn)行擴增反應(yīng)，條件為：95℃10 min、95℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s（捕捉熒光值），循環(huán) 55 次，并作熔解曲線。各基因的Q-PCR 引物序列見表1。樣本結(jié)果以目的基因與36B4 的比值做相對定量分析，數(shù)據(jù)分析采用比較CT 法，重復(fù)樣本（n=3）取平均值。

表1 實時熒光定量PCR 的引物序列Tab 1 The primer sequence of real-time quantitative PCR

1.3.2 雙熒光素酶報告試劑盒測定PGC1-α 基因啟動子活性 將HepG2 細(xì)胞接種至24 孔板，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用50 μL 無血清DMEM分別稀釋3.2 μL 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（1 mg/mL）和 0.8 μg 質(zhì)粒（表達(dá)質(zhì)粒：報告質(zhì)粒：TK 質(zhì)粒=30:30:1），輕輕混勻后室溫靜置5 min，其中質(zhì)粒（μg）：Lipofectamine 2000（μL）=1:4 將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑逐滴加入DNA 混懸液中室溫靜置15 min。將DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的混懸液逐滴加入24 孔板細(xì)胞中，混勻后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h 后棄去培養(yǎng)基，用 100 μL 1×passive lysis buffer 裂解細(xì)胞20 min，取10 μL 轉(zhuǎn)移至96 孔熒光檢測板中。將熒光素酶底物反應(yīng)液混勻備用。按照Promega 公司的雙熒光素酶報告試劑盒說明，在熒光檢測儀Turner Modulus 上對每孔細(xì)胞Firefly 和Renilla 熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.3.3 ChIP 實驗 通過經(jīng)典的灌流-膠原酶消化法獲得小鼠肝原代細(xì)胞并在室溫下用1%甲醛處理10min，然后用ChIP 細(xì)胞裂解緩沖液（10 mmol/L pH 8.0 的Tris-HCl,10 mmol/L NaCl,3 mmol/L MgCl2，0.5%NP-40 和蛋白酶抑制劑混合物）和ChIP 核裂解緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.05 mmol/L EDTA,1%SDS和蛋白酶抑制劑混合物）處理細(xì)胞。通過超聲處理細(xì)胞裂解液以剪切染色質(zhì)，并用對KLF9 特異的抗體和非特異性IgG 進(jìn)行免疫沉淀。使用蛋白A/G-瓊脂糖珠（Invitrogen）分離免疫沉淀物，將其洗滌，并用0.1%NaHCO3洗脫。在65℃孵育過夜并使用蛋白酶K 解交聯(lián)后，通過酚氯仿抽提免疫沉淀DNA 片段和Input 的DNA 片段。純化的DNA 用于擴增小鼠PGC1-α 啟動子。PGC1-α 的引物設(shè)計見表2。

表2 ChIP 的引物序列Tab 2 The primer sequence of ChIP

1.4 小鼠分組和處理 從北京斯貝福生物科技有限公司購買C57BL/6J 小鼠12 只，隨機選擇6 只小鼠用脂肪含量10%普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，另外6只用脂肪含量60%高脂飼料喂養(yǎng)90 d，小鼠自由飲食飲水，飼養(yǎng)在溫度（22±2）℃、濕度（55±10）%、12 h 照明/非照明循環(huán)房間。將普通飼料喂養(yǎng)的小鼠隨機分為2 組：（1）對照組3 只：尾靜脈注射純化過的腺病毒空載體（Ad-GFP），注射量為 100 μL/只；（2）實驗組3 只：尾靜脈注射純化過的Ad-KLF9，注射量為100 μL/只。腺病毒注射10 d 后處死小鼠，取肝臟組織，提取組織總蛋白和RNA，檢測KLF9、PGC1-α、Cpt1a、Cyp4a10、Cyp4a14、Acdam、PPAR-α以及內(nèi)參基因36B4。高脂飲食小鼠的處理同上。

1.5 Western blot 蛋白樣品以SDS-PAGE（分離膠濃度為10%）分離；電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，電轉(zhuǎn)2 h，5%牛奶室溫封閉PVDF 膜 1 h；PVDF 膜置于一抗溶液中，4℃搖床過夜；TBST 洗 PVDF 膜 3 次，每次 15 min；PVDF 膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（用TBST 配制的5%牛奶以 1∶5 000 稀釋） 室溫作用 1 h；TBST 洗 PVDF 膜5 次，每次10 min；將ECL 化學(xué)發(fā)光試劑A 液和 B液以1∶1 的比例混勻，滴加在PVDF 膜上，室溫反應(yīng)3 min 后在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中曝光。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism8 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)均以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ad-KLF9 在293A 細(xì)胞中過表達(dá) 使用融合表達(dá)3×Flag 的 KLF9 過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染 293A 細(xì)胞，48 h 后通過熒光顯微鏡可見明顯的綠色熒光，感染效率達(dá)90%以上（圖1A）。收集細(xì)胞并提取總細(xì)胞蛋白和RNA，通過Western 印跡檢測后，發(fā)現(xiàn)在分子量35 KD 處有一條特異性的條帶，而感染Ad-GFP 的對照組則沒有條帶（圖1B）。通過Q-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)與感染Ad-GFP 組相比，感染Ad-KLF9 組293A 細(xì)胞中 KLF9 的表達(dá)量上調(diào)約 20 倍（圖1C，1D）。

圖1 KLF9 基因腺病毒載體的包裝驗證Fig 1 The identification of KLF9 adenoviral vector

2.2 KLF9 直接調(diào)控PGC1-α 的轉(zhuǎn)錄 通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，PGC1-α 上存在KLF9 能夠結(jié)合的順式作用元件，ChIP-Q-PCR 實驗進(jìn)一步證明KLF9 能夠直接結(jié)合到PGC1-α 的啟動子上，促進(jìn) PGC1-α 基因的表達(dá)（圖2）。

2.3 Ad-KLF9 促進(jìn)小鼠肝原代細(xì)胞中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá) 用經(jīng)典的灌流-膠原酶消化法獲取成活率為90%以上的C57BL/6J 小鼠肝原代細(xì)胞，鋪至6 孔板中，分別感染Ad-GFP 和Ad-KLF9，48 h后提取細(xì)胞總蛋白和RNA。通過Western blot 檢測，發(fā)現(xiàn)感染Ad-KLF9 與感染Ad-GFP 的肝原代細(xì)胞相比，在分子量100 KD 和35 KD 處，靶基因PGC1-α和KLF9 蛋白表達(dá)增強（圖3A）。經(jīng)Q-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)脂肪酸氧化的基因表達(dá)（Cpt1a，Cyp4a10，Cyp4a14，Acdam，PPAR-α）呈上調(diào)趨勢（圖3B，3C）。

2.4 KLF9 促進(jìn)小鼠肝臟中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá) 將純化過的Ad-GFP 和Ad-KLF9 分別通過尾靜脈注射到老鼠體內(nèi)，10 d 后，取肝臟組織，提取組織總蛋白和RNA。通過Western blot 檢測，與注射Ad-GFP 相比，注射Ad-KLF9 的小鼠肝臟中，在分子量分別為 100 KD 與 35 KD 處，PGC1-α 和KLF9表達(dá)增強（圖4A）。經(jīng)Q-PCR 檢測，KLF9 以及促進(jìn)脂肪酸氧化相關(guān)基因（Cpt1a，Cyp4a10，Cyp4a14，Acdam，PPAR-α）的表達(dá)均明顯上調(diào)（圖4B，4C）。

圖2 KLF9 促進(jìn) PGC1-α 的表達(dá)Fig 2 KLF9 promotes expression of PGC1-α

圖3 KLF9 上調(diào)小鼠肝原代細(xì)胞脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)Fig 3 The expression of fatty acid oxidation genes in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

圖4 KLF9 上調(diào)小鼠肝臟組織中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)Fig 4 The expression of fatty acid oxidation genes in mouse liver injected with Ad-GFP and Ad-KLF9 via the tail vein

2.5 KLF9 改善高脂小鼠非酒精性脂肪肝 將純化的Ad-GFP 和Ad-KLF9 分別通過尾靜脈注射到高脂小鼠體內(nèi)，10 d 后，取肝臟組織做HE 染色和油紅O 染色，同時提取組織總蛋白和RNA。通過HE 和油紅O 染色，可以觀察到注射Ad-KLF9 的高脂小鼠肝臟脂滴形態(tài)變小，數(shù)量明顯減少，肝臟中脂肪堆積明顯得到改善（圖5A）。通過Western blot 和Q-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)與注射Ad-GFP 相比，注射Ad-KLF9 的高脂小鼠肝臟中，脂肪酸氧化相關(guān)基因（Cpt1a，Cyp4a10,Cyp4a14，Acdam，PPAR-α）表達(dá)明顯上調(diào)（圖 5B，5C，5D）。由此說明KLF9 可以促進(jìn)脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)，改善高脂小鼠脂肪肝。

圖5 KLF9 上調(diào)高脂小鼠肝臟組織中脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)Fig 5 The expression of fatty acid oxidation genes in liver of highfat mice increased by KLF9

3 討論

NAFLD 是世界范圍內(nèi)越來越常見的肝功能障礙疾病，影響著全球30%的人群，對人類健康產(chǎn)生巨大的威脅。其是肝臟脂質(zhì)堆積引發(fā)的肝細(xì)胞損傷、炎癥和纖維化，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝臟疾病，如肝硬化以及肝細(xì)胞癌等[9-10]。研究表明肥胖和2 型糖尿病都與NAFLD 密切相關(guān)[11]。肝臟作為機體內(nèi)主要代謝器官，可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，包括脂肪酸氧化，脂肪生成以及高、低密度脂蛋白吸收。其中脂肪酸氧化異常和過量轉(zhuǎn)移脂肪脂代謝異常相關(guān)疾病的風(fēng)險因素[12]。

有研究報道，KLF3 通過促進(jìn)脂肪酸β 氧化來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[13]。KLF5 可以調(diào)控糖尿病小鼠心肌細(xì)胞PPAR-α 的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)代謝[14]。KLF11 過表達(dá)激活PPAR-α 信號通路和脂肪酸氧化，進(jìn)而改善DIO 小鼠和db/db 小鼠的脂肪肝表型，減少巨噬細(xì)胞浸潤[15]。由此，筆者對KLF 家族中的另外一位成員KLF9 與脂肪酸氧化之間的關(guān)系產(chǎn)生了興趣。在調(diào)節(jié)肝臟脂代謝的眾多因子中，轉(zhuǎn)錄因子PGC1-α和PPAR-α 尤為重要。PGC1-α 是一種多功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以募集轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄復(fù)合體到達(dá)下游靶基因啟動子周圍并與其相互作用，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。有研究報道，與野生型小鼠相比，PGC1-α 基因敲除小鼠表現(xiàn)出肝臟糖異生功能下降，脂肪酸氧化和線粒體能量代謝下降，并且編碼脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的基因表達(dá)都下降[16]。轉(zhuǎn)錄因子PPAR-α 一旦被配體激活，可以誘導(dǎo)與脂代謝平衡相關(guān)基因的表達(dá)。PPAR-α 基因缺陷小鼠在禁食狀態(tài)下肝臟中將會積累大量的甘油三酯，并且會出現(xiàn)低酮體和低血糖癥狀[17]。在眾多被PPAR-α 調(diào)節(jié)的基因中，編碼肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1a（Cpt1a）和中鏈乙酰輔酶 A 脫氫酶（MCAD）基因與線粒體的脂肪酸氧化有關(guān)；編碼微粒體細(xì)胞色素P450 酶（Cyp4a10 和Cyp4a14）的基因與催化微粒體中的脂肪酸氧化相關(guān)[15]。

本研究中首先通過雙熒光素酶報告基因和ChIP 實驗得出，KLF9 可以結(jié)合到 PGC1-α 的啟動子上，促進(jìn)PGC1-α 基因的表達(dá)。然后將過表達(dá)KLF9 的腺病毒感染小鼠肝原代細(xì)胞，檢測與脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)，同時在蛋白水平驗證KLF9 和PGC1-α 的表達(dá)情況。為了證實細(xì)胞實驗的結(jié)果可靠性，進(jìn)一步通過尾靜脈注射過表達(dá)腺病毒和空載，同樣在蛋白水平驗證KLF9 和PGC1-α的表達(dá)情況，進(jìn)而檢測脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在小鼠肝原代細(xì)胞或者在小鼠體內(nèi)過表達(dá) KLF9 都會增強 PGC1-α、PPAR-α 及其下游靶基因的表達(dá)，并且進(jìn)一步改善肝臟脂肪變，筆者初步證實KLF9 在脂肪酸氧化中存在調(diào)控作用。