小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的構建及其負載百里香酚研究

許雪兒 王天緣 陳正行

(鹽城工業(yè)職業(yè)技術學院1，鹽城 224005) (江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室2，無錫 214000)

微生物的污染往往是造成食源性疾病的主要原因。百里香酚是一種天然的防腐抑菌物質，其具有綠色、無毒的作用。因此，常被作為綠色環(huán)保的抗菌物質得到廣泛研究。但目前百里香酚所存在的水溶性差、生物利用率低[2]的問題在一定程度上限制其應用。因此，本文首次通過制備復合阿拉伯膠的小麥醇溶蛋白納米顆粒，實現(xiàn)對百里香酚的負載，在改善其疏水性的同時，提高小麥醇溶蛋白的利用率，開拓阿拉伯膠在制備納米顆粒方面的可能性。小麥醇溶蛋白占據小麥面筋蛋白總量的40%～50%。小麥醇溶蛋白是由單鏈的多肽以分子間二硫鍵相連接而形成，其水溶性較差，但能夠溶解于一定濃度的乙醇溶液中[3]。同時，因小麥醇溶蛋白含有一定量的色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸，使得小麥醇溶蛋白呈現(xiàn)兩親性[4]。因此，為提高小麥醇溶蛋白利用率、積極開發(fā)新產品，本文考慮將小麥醇溶蛋白作為制備納米顆粒的壁材。同時，阿拉伯膠是一類天然的陰離子多糖，其獨特的蛋白質和鼠李糖分子結構，使得阿拉伯膠也具有良好的兩親性[5]，因此，本研究擬通過構建并制備結合阿拉伯膠的小麥醇溶蛋白納米顆粒運載體系，以此提高小麥醇溶蛋白納米顆粒水溶性的同時有效改善百里香酚的疏水性?？紫檎涞萚6]通過制備小麥醇溶蛋白納米顆粒實現(xiàn)對營養(yǎng)物質的負載，尹業(yè)充等[7]通過構建百里香酚-玉米醇溶蛋白的納米顆粒，在提高百里香酚負載率的同時，可有效達到抑菌作用。

采用反溶劑法制備小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠的復合納米顆粒，通過改變不同小麥醇溶蛋白儲備液濃度、不同攪拌速度等以探究其對復合納米顆粒的穩(wěn)定性；通過分析不同pH、不同鹽離子濃度的條件對復合納米顆粒穩(wěn)定性的影響；最后，通過測定復合納米顆粒對百里香酚的包封率及負載百里香酚的復合納米顆粒的穩(wěn)定性進行分析，可為構建負載疏水性營養(yǎng)物質的小麥醇溶蛋白-多糖的復合納米顆粒的可行性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥谷朊粉、阿拉伯膠、百里香酚；無水乙醇、石油醚等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

R-1001N旋轉蒸發(fā)儀；磁力攪拌器；CR21G型冷凍干燥機；Zetasizer Nano 納米粒度儀；WFZ UV-2000型紫外分光光度計；LXJ-IIB型臺式離心機；DHG-9101·3SA型恒溫干燥箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 小麥醇溶蛋白的提取

稱取100 g谷朊粉置于1 L的體積分數為70%的乙醇水溶液中，并置于磁力攪拌器上，以1 000r/min的轉速持續(xù)攪拌3 h后，設定5 000 r/min轉速離心10 min除去沉淀物，并收集上清液，在55 ℃條件下，旋轉蒸發(fā)除去乙醇。將旋蒸后的物質冷凍干燥72 h后即可得到小麥醇溶蛋白。

1.3.2 小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒制備

首先制備小麥醇溶蛋白的乙醇溶液：稱量0.5 g在1.3.1中制備所得的小麥醇溶蛋白并置于10 mL 70%的乙醇水溶液中，并將小麥醇溶蛋白的乙醇溶液置于磁力攪拌器上以一定的攪拌速度攪拌10 min備用；其次，制備阿拉伯膠的水溶液：稱量2 g 阿拉伯膠置于去離子水中，并以一定的攪拌速度持續(xù)攪拌1 h；隨后開始制備小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒，具體過程如下：移取一定體積的小麥醇溶蛋白的乙醇溶液，并以一定的滴加速度滴至體積為38.9 mL的去離子水中，得到小麥醇溶蛋白納米顆粒，然后再以小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠(1∶2)的比例，移取不同體積的阿拉伯膠水溶液至于小麥醇溶蛋白納米顆粒中，以一定的攪拌速度攪拌60 min后，以4 000 r/min的轉速離心10 min得到其上清液[8]，即為小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒。

1.3.3 不同小麥醇溶蛋白儲備液濃度下納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(polydispersity index，PDI)測定

分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g 小麥醇溶蛋白溶解于10 mL體積分數為70%乙醇中，磁力攪拌30 min作為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%質量分數的小麥醇溶蛋白儲備液，具體步驟同1.3.2；所得納米顆粒稀釋至10倍，分散均勻后取1 mL放入樣品池后進行測定。

1.3.4 不同攪拌速度下對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒穩(wěn)定性的影響

控制納米顆粒制備過程中的攪拌速度(300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200、1 300 r/min)對納米顆粒進行制備，具體步驟同1.3.2，穩(wěn)定性探究同1.3.3。

1.3.5 pH對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒穩(wěn)定性的影響

用pH范圍在3～9的磷酸鹽緩沖溶液調節(jié)納米顆粒的pH為3～9，制備得到不同pH值的納米顆粒后，穩(wěn)定性探究同1.3.3。

1.3.6 不同鹽離子濃度對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒穩(wěn)定性的影響

先后移取10 mL濃度分別為(0、10、20、30、50、100 mmol/L)的鹽溶液，置于6只50 mL的離心管中，隨后，在每管中加入10 mL小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒，并將納米顆粒與鹽離子溶液充分混合均勻，室溫下靜置30 min后，觀察鹽離子對復合納米顆粒干擾后的體系穩(wěn)定狀態(tài)[9]。粒徑、電位、多分散指數的測定步驟同1.3.3。

1.3.7 負載百里香酚的小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒制備

按照一定小麥醇溶蛋白/阿拉伯膠：百里香酚(1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)的比例制備不同比例的復合納米顆粒，移取一定量的百里香酚置于1.3.2中制備所得小麥醇溶蛋白的乙醇溶液，得到負載百里香酚的小麥醇溶蛋白的乙醇溶液；然后將移取一定量的負載百里香酚的小麥醇溶蛋白的乙醇溶液以1.3.2中具體步驟進行制備，以得到負載百里香酚的小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒。

1.3.8 不同小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒:百里香酚比例下納米顆粒粒徑、電位、多分散指數(PDI)測定

取1 mL 新鮮制備的不同小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠:百里香酚比例(1∶1、2∶1、10∶1、50∶1、100∶1)的納米顆粒，粒徑、電位、多分散指數的測定步驟同1.3.3。

1.3.9 百里香酚包封率的測定

負載百里香酚的小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒對百里香酚包封率測定方法如下：將5 mL制備所得的小麥醇溶蛋白/阿拉伯膠-百里香酚納米顆粒移入燒杯中，隨后將3 mL乙酸乙酯加入納米顆粒中攪拌60 min，以期達到萃取百里香酚的作用，重復萃取后合并萃取液，并以乙酸乙酯作為空白樣，在276 nm處對樣品的吸光值進行測定。根據所得百里香酚吸光值繪制標準曲線，得到方程：y=9.820x+0.019(R2=0.993)，并以此計算包封率[10]：

百里香酚包封率=

2 結果與分析

2.1 不同小麥醇溶蛋白儲備液濃度對復合納米顆粒的影響

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),余同。
圖1 不同小麥醇溶蛋白儲備液濃度下納米顆粒粒徑、PDI、電位圖

如圖1a所示，隨著小麥醇溶蛋白儲備液濃度的升高，小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的粒徑、PDI變化為：從2%～6%的穩(wěn)定變?yōu)?%～8%的顯著上升。其中，當小麥醇溶蛋白儲備液濃度在6%時，復合納米顆粒的粒徑為223.6 nm，PDI為0.35，而當超過儲備液質量分數超過6%時，復合納米顆粒的粒徑顯著增大，這可能是由于當濃度低于6%之時，小麥醇溶蛋白充分分散于水相之中，并形成納米顆粒，而當蛋白濃度過高時，部分過剩的蛋白分子便不能形成穩(wěn)定的納米顆粒，并直接影響制備過程中的粒徑和PDI值。從圖1b中也可以看出，復合納米顆粒在不同小麥醇溶蛋白儲備液濃度下電位的變化趨勢與粒徑及PDI的變化趨勢相同，其中當小麥醇溶蛋白儲備液質量分數在6%時，復合納米顆粒的電位為-29.8 mV。該結果與王麗娟等[11]和Fu等[12]的究玉米醇溶蛋白-果膠復合納米顆粒時所探究得出的，若蛋白的初始儲備液濃度過高時，會對納米顆粒的形成及其粒徑、電位大小有直接影響的結果一致。綜上所述，制備納米顆粒時選取6%的小麥醇溶蛋白儲備液濃度，在提高納米顆粒得率的同時，又不影響其粒徑、電位等穩(wěn)定性指標。

2.2 不同攪拌速度對小麥醇溶蛋白與阿拉伯膠納米顆粒的影響

從圖2中可以看出，當攪拌速度小于400 r/min時，所形成的納米顆粒的粒徑大于300 nm，且體系穩(wěn)定性較差，該結果表明，較低的攪拌速度不能形成穩(wěn)定的納米顆粒；當攪拌速度提高至800 r/min時，體系粒徑最低；當攪拌速度為800～1 200 r/min之間時，納米顆粒體系的粒徑趨于穩(wěn)定；而當攪拌速度提高至1 200 r/min時，復合納米顆粒體系粒徑顯著變大，分析該粒徑變化結果，這可能是由于較大的剪切力破壞復合納米顆粒的形成，并使得蛋白納米顆粒與阿拉伯膠之間發(fā)生絮凝，對體系起反作用。因此，確定800 r/min的攪拌速度為納米顆粒的最適攪拌速度。Gagliardi等[13]在研究小麥醇溶蛋白的納米顆粒形成時表明，攪拌速度所產生的剪切力較大時，會顯著破壞納米顆粒的形成。

圖2 不同攪拌速度對小麥醇溶蛋白復合納米顆粒的 粒徑的影響

2.3 pH對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的影響

從圖3a可以看出，在不同的pH環(huán)境下，復合納米顆粒的粒徑和PDI沒有顯著變化，該結果表明，復合納米顆粒在不同pH環(huán)境下的耐受性較強，該結果可能是由于阿拉伯膠與小麥醇溶蛋白相互作用形成穩(wěn)定的納米顆粒，在保護了小麥醇溶蛋白納米顆粒不被胃酸環(huán)境破壞的同時，還改善了納米顆粒體系的穩(wěn)定性。同時，圖3b的電位圖可以看出，當pH=3時，小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒電位較低，表明該體系不穩(wěn)定，推測是由于此時pH的環(huán)境與阿拉伯膠的pka值(2.3)相近，因此阿拉伯膠的穩(wěn)定性較差，進而無法促進體系穩(wěn)定性的形成；在pH=4～9的環(huán)境下，復合納米顆粒電位值均較為穩(wěn)定。由此結論可以得出，阿拉伯膠可以有效結合小麥醇溶蛋白并形成穩(wěn)定的納米顆粒體系，而當環(huán)境pH達到蛋白質等電點時，蛋白質易聚集的現(xiàn)象。吳煒豪等[14]在研究小麥醇溶蛋白納米顆粒的制備時也發(fā)現(xiàn)相同結論。

圖3 pH對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒粒徑、 PDI、電位的影響

2.4 不同鹽離子濃度對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的影響

從表1中可以看出，不同鹽離子濃度對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的粒徑、PDI、電位的影響，當其中，當鹽離子濃度小于20 mmol/L時，納米顆粒體系為納米級，且PDI也較為穩(wěn)定，隨著鹽離子濃度上升到30 mmol/L時，納米顆粒體系的粒徑增大至微米級，且PDI為1；電位也接近于0 mV；體系的不穩(wěn)定性也能夠表明，小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的鹽離子耐受濃度為20 mmol/L，推測是由于阿拉伯膠與小麥醇溶蛋白之間通過相互作用力結合生成穩(wěn)定的復合物[15]，20 mmol/L的鹽離子濃度，不足以破壞小麥醇溶蛋白與阿拉伯膠之間的相互作用力，而當鹽離子濃度大于20 mmol/L時，體系易發(fā)生電荷屏蔽效應，使得體系粒徑變大、絮凝狀態(tài)變嚴重。該結果與Dai等[16]研究鹽離子對玉米醇溶蛋白納米顆粒的干擾作用時結果相同。

表1 不同鹽離子濃度對小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠 納米顆粒的影響

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。

2.5 不同小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠:百里香酚比例的納米顆粒粒徑、PDI、電位值

從圖4a中可看出，不同小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠∶百里香酚比例的納米顆粒的粒徑、PDI值，結果表明，當小麥醇溶蛋白負載生育酚的比例逐漸變大時，復合納米顆粒的粒徑逐漸增高，具體表現(xiàn)為，當小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠∶百里香酚大于5∶1時，負載百里香酚的納米顆粒粒徑、PDI均較為穩(wěn)定，即可分析為，小麥醇溶蛋白可充分包裹住百里香酚并結合成納米顆粒；其中，小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠∶百里香酚=5∶1時粒徑為251.2 nm，PDI為0.36；而當比例小于5∶1時納米顆粒粒徑較大達到 280 nm； PDI也大于0.36。同時，如圖4b所示，隨著小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠∶百里香酚比例的減小，納米顆粒電位也逐漸下降, 小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠∶百里香酚=5∶1時電位為-28.3 mV。該結果與 Wongsasulak等[17]和Gulfam等[18]研究結果一致。綜上所述，小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠∶百里香酚=5∶1時復合納米顆粒的粒徑、PDI、電位和包封率均達到穩(wěn)定體系狀態(tài)，此時，小麥醇溶蛋白復合阿拉伯膠的生物大分子納米顆粒具備對百里香酚的負載能力。

圖4 不同小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠:百里香酚比例 納米顆粒粒徑、 PDI和電位對比圖

2.6 負載百里香酚的小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒包封率

表2是負載不同百里香酚含量的小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的包封率情況，其中當小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆?！冒倮锵惴拥谋壤?00∶1、50∶1、10∶1時，包封率均達到90%以上；當比率達到5∶1，2∶1，1∶1時，百里香酚的包封率逐漸降低。該結果表明，當百里香酚負載量較低時，小麥醇溶蛋白和阿拉伯膠能夠較大程度的包裹百里香酚[19]，即與百里香酚能夠有效結合。而當百里香酚負載量較高時，所制備得到的復合納米顆粒不能與百里香酚充分融合，負載率較低。黃曉霞等[20]在研究負載姜黃素的玉米醇溶蛋白納米顆粒時，表明所得的復合納米顆粒具在比率低于1∶1時，對姜黃素都有較高的負載率。

表2 負載百里香酚小麥醇溶蛋白-阿拉伯膠復合納米顆粒的包封率

3 結論

探討小麥醇溶蛋白儲備液濃度、攪拌速度、pH以及鹽離子濃度等因素對小麥醇溶蛋白與阿拉伯膠復合納米顆粒的穩(wěn)定性影響，該復合納米顆粒均具備耐酸堿性和一定程度的鹽離子耐受性，并具備對百里香酚的負載能力；因此，阿拉伯膠對小麥醇溶蛋白的結合，可一定程度上保護小麥醇溶蛋白納米顆粒在酸性條件及等電點環(huán)境下的分解，實現(xiàn)了對百里香酚的高效負載并有效拓寬小麥醇溶蛋白的應用，由此可得出，小麥醇溶蛋白與阿拉伯膠的復合納米顆粒可被考慮作為生物運載體系，以實現(xiàn)對百里香酚的運載。