奶牛胚胎早期死亡的轉錄組初探

呂小青，劉林，薛建華，王彥平，李艷華，麻柱

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.農業(yè)農村部奶牛遺傳育種重點實驗室，北京 100192;3.奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點實驗室，北京 100192）

早期胚胎丟失是奶牛繁殖失敗的主要原因之一，主要發(fā)生在胚胎附植前后，有多個因素影響胚胎丟失，如遺傳（SNPs、CNV等）、環(huán)境、疾病、病原微生物等都能引起胚胎死亡[1,2]。受精失敗引起的胚胎損失達17%，卵裂階段的胚胎損失達37%[3,4]。本研究篩選了兩個不同卵裂階段，對奶牛早期死亡胚胎進行了轉錄組分析。

轉錄組測序現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應用于人類、小鼠、豬、牛等動物研究中[5～7]，能快速地獲得樣本的序列信息和表達信息，具有高通量、全面等優(yōu)點，為研究基因表達調控的重要方法。本研究的目的是挖掘引起奶牛胚胎早期死亡的關鍵基因或突變，目前國內還沒有相關的報道，具體包括采用轉錄組測序技術對奶牛8-細胞期和桑葚胚期死亡和正常的胚胎樣本進行基因表達變化的分析，本研究分別針對奶牛胚胎的兩種不同時期進行細胞組學測序，聯(lián)合分析不同時期胚胎之間的差異表達基因，獲得與奶牛胚胎發(fā)育相關的生物標志物，為奶牛群體篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 體外胚胎的生產(chǎn)

屠宰場收集的卵巢通過保溫瓶運回實驗室后，用10mL注射器采集卵母細胞。將鑒定可用的卵母細胞洗滌4遍后，放入成熟液滴中，成熟培養(yǎng)22～24h，并利用鮮精體外受精后，精卵共培養(yǎng)6～8h。之后將受精后的合子轉移到胚胎發(fā)育液滴中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5℃、5% CO2、飽和濕度，期間每隔48h半量換液。

在受精88～96h后收集8-細胞階段正常胚胎和死亡胚胎，并在受精第6天時收集正常桑葚胚和死亡桑葚胚，提取RNA。胚胎發(fā)育階段和胚胎分級評定標準參考國際胚胎移植協(xié)會標準。

1.2 cDNA文庫構建及測序

利用鏈霉蛋白酶將胚胎的透明帶消化掉，并利用玻針將單個卵裂球轉移至裂解液中，立即凍存于-80℃冰箱。之后對單個卵裂球進行裂解，并反轉錄成1st cDNA。通過PCR擴增富集、核酸純化、構建文庫等之后，利用Illumina平臺進行測序[8]，測序策略為PE 150。

1.3 單細胞轉錄組測序及數(shù)據(jù)處理

測序完成后，用 Casava1.8.2 軟件將圖像格式的測序數(shù)據(jù)轉化為fastq格式，得到的原始數(shù)據(jù)進行過濾獲得高質量Clean Reads，再進行后續(xù)分析，后續(xù)分析都基于Clean Reads[9,10]。本研究對獲得的測序數(shù)據(jù)與?；蚪M參考序列（UMD3.1）進行比對分析，采取HiSAT2軟件將各樣品過濾后的RNA-seq數(shù)據(jù)同基因組進行比對分析，比對率達92%。每個組設置兩個生物學重復，采用DESeq2進行基因差異表達分析，并選取|log2Ratio|≥1和q＜0.05的基因作為顯著差異表達基因，從而獲得上下調基因個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 8-細胞期胚胎和桑葚胚表達譜變化

通過對奶牛8-細胞期和桑葚胚時期死亡和正常的胚胎樣本進行基因轉錄組測序，聯(lián)合分析不同時期胚胎之間的差異表達基因，挖掘奶牛胚胎早期死亡的關鍵基因。

本研究設置了8-細胞期死亡組和正常組、桑葚胚死亡組和正常組，共4個組別，每組兩個生物學重復，因此共建立了8個cDNA文庫，并且利用了Illumina平臺進行測序。8個測序樣本共計獲得52、257、166條Reads，之后用DESeq2進行差異基因分析，并選取|log2Ratio|≥1和q＜0.05的為差異顯著。

通過8-細胞期正常組與死亡組，桑葚胚期正常組與死亡組差異基因比較分析，獲得上下調基因個數(shù)。分析結果顯示，在8-細胞期獲得2倍以上差異表達基因157個，其中上調基因6個，下調基因151個；在桑葚胚期獲得2倍以上差異表達基因269個，其中上調基因10個，下調基因259個。

2.2 差異表達基因的GO統(tǒng)計

基因功能注釋（Gene Ontology，GO）可分為三個部分，分別描述基因的分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cellular Component，CC）、生物過程（Biological Process，BP）。本研究通過差異基因分析在CC分類中有14個條目表達差異，其中差異基因占比最大的是細胞部分，其次為細胞器；在BP分類中有18個條目表達差異，其中差異基因占比最大的是繁殖過程；在MF分類中有10個條目表達差異，其中差異基因占比最大的是結合，其次是催化活性。GO詳細統(tǒng)計結果如圖1。

圖1 差異基因的GO統(tǒng)計柱狀圖

2.3 差異基因KEGG通路分析

本研究對8-細胞期正常胚胎和死亡胚胎的差異表達基因，進行了KEGG通路分析，同時對桑葚胚期也進行了KEGG信號分析，與胚胎早期死亡相關性較高的通路為細胞凋亡信號通路和內質網(wǎng)蛋白合成通路。

3 討論

Shinji Sasaki等對日本和牛人工授精30～60d期間死亡的791個胚胎進行了以CNV為變異類型的GWAS分析，發(fā)現(xiàn)定位到8號染色體上378 127到412 061bp位置的ANXA 10基因第2～6外顯子區(qū)域的拷貝數(shù)變化（CNV） 與胚胎死亡有關。這項研究確定了一種缺失型CNV，在奶牛中包含ANXA10，與人工授精后30～60d的胚胎死亡率相關[11]。

2011年，VanRaden等人利用北美58 453頭荷斯坦牛、5 288頭娟姍牛及1 991頭瑞士褐牛的50K Illumina SNPs基因型數(shù)據(jù)[12]，通過軟件（Findhap.f90 version2）將其轉化為單倍型數(shù)據(jù)，得到長度小于75個標記的單倍型，通過不同世代個體比對，發(fā)現(xiàn)11種群體頻率很高的單倍型從來沒有以純合的形式出現(xiàn)，然后進行系譜分析，觀察其遺傳方式，并通過和具體繁殖性狀（SCR、妊娠率、死胎率）的關聯(lián)分析，推測出5種單倍型，當其純合時，會導致早期流產(chǎn)或死胎。

本研究利用高通量測序對8-細胞期、桑葚胚期的正常和死亡胚胎進行了單細胞轉錄組測序，通過對差異表達基因的通路分析，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡信號通路差異極顯著。但是轉錄組測序數(shù)據(jù)量大，下一步將利用定量PCR技術對獲得的差異顯著基因進行驗證，以進一步獲得引起胚胎早期死亡的重要標志基因。

本研究初步對早期死亡胚胎進行了轉錄組分析，為進一步研究胚胎發(fā)育潛能和體外胚胎生產(chǎn)提供了基礎，對提高胚胎生產(chǎn)效率具有重要意義。