探針導向重組酶介導等溫擴增法檢測MTB rpoB基因突變的應(yīng)用價值

李鑫娜 申辛欣 王瑞白 段素霞 張瑞卿 王瑞歡 白雪丁 凡國豪 王金榮 高源 陳子巍 馬學軍

利福平作為一線抗結(jié)核藥物，主要通過與細菌的RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合，干擾細菌的RNA轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮殺菌作用。編碼RNA聚合酶β亞單位的基因(rpoB基因)中有一段長81 bp的利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance-determining region, RRDR；密碼子507～533，共27個氨基酸)，超過95%的利福平耐藥MTB菌株在該區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變，而密碼子516、526和531是最常見的突變位點[1]。

目前，核酸檢測技術(shù)更迭迅速，使得MTB分子生物學藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)技術(shù)發(fā)展迅速，例如，聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法(PCR-SSCP)[2]、熒光定量PCR方法[3]、高分辨率熔解曲線法[4-5]、反向探針雜交方法[6]、基因芯片技術(shù)[7-8]等。這些方法和技術(shù)雖結(jié)果準確，但需要專業(yè)人員進行操作，且實驗對儀器設(shè)備依賴性較高，需要高精密儀器。重組酶介導等溫擴增法(recombinase aided amplification, RAA)是一種適合現(xiàn)場和基層的等溫核酸擴增方法。該方法操作簡便，可利用便攜式儀器快速進行病原微生物檢測[9-10]。筆者實驗室曾建立探針導向的重組酶介導的等溫擴增法(probe-directed recombinase amplification，PDRA)，并成功應(yīng)用于5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)A1298C的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點檢測[11]。本研究中，筆者擬探究采用PDRA方法檢測MTB的rpoB基因516位點突變的應(yīng)用價值。

材料和方法

1.菌株來源：6株MTB利福平耐藥菌株、35份MTB培養(yǎng)陽性的痰標本均來自中國疾病預防控制中心傳染病所結(jié)核病室。

2.細菌基因組制備：采用十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)方法進行細菌基因組提取[12]。方法簡述如下：80 ℃滅活30 min，離心棄上清，菌體沉淀用400 μl TE緩沖液旋起，加入溶菌酶，37 ℃孵育16～20 h。加入10% 十二烷基硫酸鈉(SDS)/蛋白酶K混合液，65 ℃孵育10 min，加入氯化鈉(NaCl)和CTAB/NaCl混合液，65 ℃孵育10 min，加入氯仿/異戊醇混合液，離心并轉(zhuǎn)移上清，加入0.6倍體積異丙醇以沉淀DNA，-20 ℃放置30 min，離心棄上清，用1 ml 70%冰乙醇洗滌DNA沉淀；離心并且干燥，用TE緩沖液溶解DNA。

3.標準質(zhì)粒制備：質(zhì)粒合成由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成，包括1種野生型(TB-516-GAC，即TB-516-W)和3種516位點單點突變型(TB-516-GGC突變、TB-516-GTC突變、TB-516-TAC突變)。片段長度為960 bp的rpoB基因，其中包含81 bp 的RRDR決定區(qū)。

4.儀器與試劑：RAA 熒光檢測儀QT-7200、RAA熒光基礎(chǔ)試劑盒均購自江蘇奇天基因生物科技有限公司，引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

5.引物和探針設(shè)計：通過NCBI下載rpoB基因序列，在516位點附近設(shè)計探針和引物，避免出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)及形成引物二聚體。設(shè)計1條野生型探針、3條突變型探針、1條反向引物。探針長46～52個堿基，3′端采用C3-spacer阻斷，熒光基團和淬滅基團標記在中間相鄰近的T堿基上，突變點位于四氫呋喃(THF)的5′端。具體序列見表1。

6.PDRA 擴增體系及條件：參照文獻[11]，516位點常見突變包括3種類型(GGC、GTC、TAC)，需配制4種反應(yīng)體系，分別檢測野生型及3種突變型。4種檢測體系的引物組成如下：TB-516-W檢測體系為P-W和R，TB-516-GGC檢測體系為P-GGC和R，TB-516-GTC檢測體系為P-GTC和R，TB-516-TAC檢測體系為P-TAC和R。以TB-516-W檢測體系為例，總體積50 μl，包括300 nmol/L正向探針(P-W)，420 nmol/L反向引物(R)以及1×緩沖液。向裝有干粉的反應(yīng)管中加入上述混合液和2 μl模板DNA，并將2.5 μl醋酸鎂(280 mmol/L)加入管蓋內(nèi)，蓋上管蓋，混勻離心使醋酸鎂進入擴增體系。其他檢測體系配制同上，只需進行探針替換即可。將上述反應(yīng)管放入QT-7200熒光檢測儀中，39 ℃反應(yīng)40 min，實時收集熒光。通過比較檢測樣品在4種反應(yīng)體系的擴增時間差異來判斷是否發(fā)生突變及突變類型。

表1 PDRA方法的探針及引物

注標注下劃線的堿基為516突變點

圖1～4 PDRA方法特異度檢測。圖1為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝野生型質(zhì)粒情況，可見TB-516-W體系的陽性閾值時間早于其他體系。 圖2為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝 TB-516-GGC突變型質(zhì)粒情況，可見TB-516-GGC體系的陽性閾值時間早于其他體系的陽性閾值時間。圖3為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝 TB-516-GTC突變型質(zhì)粒情況，可見TB-516-GTC 體系的陽性閾值時間早于其他體系的陽性閾值時間。圖4為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝 TB-516-TAC突變型質(zhì)粒情況，可見TB-516-TAC體系的陽性閾值時間明顯早于其他體系的陽性閾值時間

圖5～8 PDRA方法敏感度檢測。圖5為TB-516-W體系檢測1010～103拷貝/μl野生型質(zhì)粒。圖6為TB-516-GGC體系檢測1010～103拷貝/μl TB-516-GGC突變型質(zhì)粒。圖7為TB-516-GTC體系檢測1010～103拷貝/μl TB-516-GTC突變型質(zhì)粒。圖8為TB-516-TAC體系檢測1010～103拷貝/μl TB-516-TAC突變型質(zhì)粒

7.PDRA方法的特異度和敏感度檢測：4種類型的質(zhì)粒，包括一種野生型和3種突變型質(zhì)粒，作為模板進行特異度實驗；分別將質(zhì)粒10倍稀釋為1×1010～1×103拷貝/μl用以敏感度檢測實驗，以無核酶水作為陰性對照，重復3次獨立實驗并記錄實驗結(jié)果，以3次均可檢測出的最低拷貝數(shù)濃度作為檢測敏感度。

8.方法測試：(1)菌株測試：對MTB利福平耐藥菌株，采用CTAB法提取基因組，經(jīng)PCR后進行測序[13]，同時用本研究建立的檢測516位點的PDRA方法進行測試。(2)臨床標本測試：經(jīng)培養(yǎng)后的痰液臨床標本，采用CTAB法提取基因組，經(jīng)PCR后進行測序[13]，并且進行516位點的PDRA方法測試。

結(jié) 果

1.PDRA方法特異度：通過4種檢測體系分別檢測4種不同類型的質(zhì)粒，只有檢測探針與檢測模板完全匹配的檢測體系，陽性閾值時間最早，相對熒光強度值最高；而其他擴增體系的陽性閾值時間滯后或者熒光值低。圖1～4顯示了4種檢測體系檢測2×105拷貝質(zhì)粒的情況。當檢測體系的探針與模板為相互對應(yīng)關(guān)系時，陽性閾值時間最早；當檢測體系的探針與模板不是對應(yīng)關(guān)系時，則表現(xiàn)為陽性閾值時間滯后。檢測體系TB-516-W、TB-516-GGC、TB-516-GTC和TB-516-TAC的陽性閾值時間差值分別為7.0、5.8、10.0、7.0 min。4種檢測體系穩(wěn)定，在檢測不同濃度的模板時，擁有相對穩(wěn)定的陽性閾值時間及時間差值。

2.PDRA方法敏感度：4種檢測體系分別檢測對應(yīng)類型的質(zhì)粒DNA(1010～103拷貝/μl)，從而確定PDRA方法的敏感度，如圖5～8所示，在40 min內(nèi)，4種檢測體系的敏感度均可達到1000拷貝/μl。

3.菌株測試結(jié)果：采用PDRA法及測序法檢測6株利福平耐藥MTB，6株MTB經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)有3株發(fā)生516位點突變，3株發(fā)生526位點突變，1株發(fā)生531位點突變，其中1株發(fā)生了雙位點突變(菌株T5)，PDRA方法檢測各菌株516位點的結(jié)果與預期結(jié)果一致，可正確區(qū)分是否發(fā)生516位點突變，并且可確定516位點突變類型。具體表現(xiàn)為516位點突變的菌株，PDRA檢測結(jié)果顯示突變型體系陽性閾值時間早于野生型體系，而突變類型不同，則對應(yīng)體系的陽性閾值時間更早(圖9～11)；而對于非516位點突變菌株，PDRA檢測結(jié)果顯示野生型體系的陽性閾值時間更早(圖12～14)。

圖9～14 PDRA法及測序法檢測MTB菌株結(jié)果對比。圖9為MTB菌株HN05021(516-GGC突變)檢測結(jié)果。圖10為MTB菌株HeN05046(516-GTC突變)檢測結(jié)果。圖11為MTB菌株T5(516-TAC，526-GAC突變)檢測結(jié)果。圖12 為MTB菌株T7(516-W，526-TAC 突變)檢測結(jié)果。圖13為MTB菌株T4(516-W，526-CGC突變)檢測結(jié)果。圖14為MTB菌株FJ-14011(516-W，531-TTG突變)檢測結(jié)果

4.臨床標本測試結(jié)果：35份痰標本，經(jīng)測序后確定有8份(22.9%)在rpoB基因RRDR決定區(qū)發(fā)現(xiàn)點突變，其中2份(5.7%)發(fā)現(xiàn)516位點突變(GGC、GTC)，1份(2.9%)發(fā)現(xiàn)526位點突變，5份(14.3%)發(fā)現(xiàn)531位點突變。針對516位點的PDRA方法檢測標本的實驗結(jié)果與預期結(jié)果一致，可識別516位點有無突變，以及發(fā)生突變的類型。標本檢測結(jié)果示例見圖15～18，如圖15、16所示：2份516位點突變標本經(jīng)PDRA測試，表現(xiàn)為對應(yīng)的突變型體系陽性閾值時間早；如圖17、18所示： 531位點突變標本及野生型標本經(jīng)PDRA測試，表現(xiàn)為野生型體系的陽性閾值時間早。

圖15～18 PDRA法及測序法檢測MTB培養(yǎng)陽性痰標本結(jié)果對比。圖15為標本181030(516-GGC突變)檢測情況。圖16為標本181076(516-GTC突變)檢測情況。圖17為標本181059(516-W，531-TTG突變)檢測情況。圖18為標本181034(野生型)檢測情況

討 論

本研究應(yīng)用PDRA法檢測MTB利福平耐藥基因rpoB基因的516突變位點，通過設(shè)計特異性探針識別單個堿基，利用單引物和單探針進行擴增，借助便攜熒光檢測儀判斷該位點是否發(fā)生突變。因rpoB基因516位點常出現(xiàn)3種突變類型(GGC、GTC、TAC)，所以設(shè)計4條特異性探針(1條野生型探針和3條突變型探針)和1條共同的反向引物，建立4種平行檢測體系檢測模板，在恒溫39 ℃條件下反應(yīng)40 min，依據(jù)陽性閾值時間早晚進行516位點突變點識別。不同檢測體系在檢測相同模板時，陽性閾值時間不同，只有體系的探針與模板完全匹配時，其陽性閾值時間最早，相對熒光強度值最高；而體系的探針與模板不匹配時，則陽性閾值時間晚，熒光值低。通過4種體系檢測同一類型的重組質(zhì)粒，確定了該方法的特異度；通過系列稀釋的重組質(zhì)粒，確定了該方法的檢測敏感度為1000拷貝/μl。該方法與測序法同時檢測利福平耐藥菌株及痰標本， 所得結(jié)果一致。

目前已有將RAA方法應(yīng)用于MTB和非結(jié)核分枝桿菌檢測的研究。陳淑丹等[14]應(yīng)用RAA方法檢測3種非結(jié)核分枝桿菌(海分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌)，檢測下限可達1000拷貝/μl質(zhì)粒DNA。陳斌等[15]應(yīng)用RAA方法檢測MTB，最低敏感度為0.043 ng/μl MTB基因組DNA，與其他呼吸道病原菌無交叉反應(yīng)。兩項研究側(cè)重于病原體的定性檢測，不涉及耐藥突變位點的檢測。而本研究的側(cè)重點是已知MTB感染的前提下，進行MTB利福平耐藥基因突變位點檢測。在PDRA檢測體系優(yōu)化過程中，筆者借鑒等位基因特異性PCR(AS-PCR)的3′端錯配原則，在探針的突變位點的5′方向加入人為錯配堿基，但檢測結(jié)果與預期相反，其區(qū)分度反而下降。分析可能的原因是RAA的擴增原理與PCR的擴增原理不同：RAA體系主要依賴重組酶與引物或探針形成核酸蛋白復合物，掃描模板，找到同源序列后可解開雙鏈，啟動延伸反應(yīng)；而PCR則是通過溫度循環(huán)保證擴增反應(yīng)(變性-退火-延伸)順利進行。在RAA體系里，序列同源性是非常重要的，引入人為錯配堿基，降低了同源性比例，反而降低了探針的特異度。筆者曾嘗試加入甜菜堿來提高特異度，但實驗結(jié)果表明，加入甜菜堿后在某些檢測體系(TB-516-GTC)中表現(xiàn)為促進作用，而某些檢測體系(TB-516-GGC)則表現(xiàn)為抑制作用。這種拮抗作用的具體機制未明。為了保證檢測體系的一致性。本次研究選擇不加甜菜堿。

綜上，本研究建立了一種檢測MTB利福平耐藥rpoB基因516突變位點的等溫核酸擴增方法，該方法具有以下特點：(1)39 ℃恒溫反應(yīng)，無需精密PCR儀，只需一臺便攜式熒光檢測儀；(2)檢測快速，檢測可在40 min內(nèi)完成；(3)閉管操作，不易造成交叉污染；(4)檢測結(jié)果通過熒光曲線有無及陽性閾值時間進行判定，直觀易判斷。本研究作為一個初步研究，證明PDRA方法可以應(yīng)用于MTB利福平耐藥基因位點突變的檢測。但本研究也存在一些不足：造成利福平耐藥的常見rpoB基因突變類型有3種，包括531位點、526位點及516位點[1]，而筆者本次研究只建立了針對516位點的PDRA檢測方法，后續(xù)還將進一步補充526、531位點的PDRA檢測方法，并收集更多的測試標本完成方法學評估。