丹紅注射液聯(lián)合替羅非班對(duì)急性腦梗死患者NF-κB炎癥信號(hào)通路及療效的影響

康梅娟，溫昌明，劉義鋒，孫 軍，張保朝

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院，南陽(yáng) 473000)

急性腦梗死(acute cerebral infarction, ACI)是神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，好發(fā)于中老年群體，多由于血栓形成或動(dòng)脈壁上血栓脫落經(jīng)血循環(huán)流入并阻塞腦動(dòng)脈，導(dǎo)致相應(yīng)部位供血、供氧不足或缺乏而誘發(fā)[1]?，F(xiàn)階段，臨床治療ACI應(yīng)在盡早恢復(fù)腦血管血流供應(yīng)、減少腦組織梗死范圍的基礎(chǔ)上，關(guān)注缺血再灌注損傷、血栓再形成風(fēng)險(xiǎn)，以減少ACI的后遺癥或死亡率[2]?？寡“寰奂乾F(xiàn)行治療ACI的主要方法之一，而《2018年美國(guó)急性缺血性卒中早期管理指南》修改抗血小板藥物替羅非班推薦級(jí)別為Ⅱb級(jí)，其不僅可抑制血小板聚集，還可阻止血栓形成、擴(kuò)散[3]。丹紅注射液是一種經(jīng)現(xiàn)代科技提取而成的中藥復(fù)方制劑，主要含有丹參酮、丹參酸及紅花黃色素、紅花酚苷等化學(xué)成分。有研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，其可通過(guò)抗血栓形成、促進(jìn)血管生成、制約氧化修飾、減輕局部炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)等多種機(jī)制和途徑發(fā)揮保護(hù)腦血管系統(tǒng)的作用。本研究就丹紅注射液聯(lián)合替羅非班治療ACI的效果以及可能作用機(jī)制進(jìn)行回顧性分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月～2019年8月于我院收治的ACI患者125例，均符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南》中的ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：① 急性起病，且發(fā)病至入組時(shí)間<5 h。② TOAST分型為小動(dòng)脈閉塞性卒中型及大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中型。③ 近期未輸血或接受抗凝藥或抗血小板藥治療。④ 入選患者均自愿參加并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 近3個(gè)月有創(chuàng)傷史或行外科手術(shù)的患者。② 伴有急性、慢性感染或嚴(yán)重凝血功能障礙者。③ 患有其他嚴(yán)重疾病，如心力衰竭、肝腎功能不全等。④ 對(duì)丹紅注射液、替羅非班過(guò)敏或伴有影響藥物吸收疾病者。⑤ 臨床病歷資料不完整患者。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按隨機(jī)數(shù)字表法將納入病例分為治療組(n=65)和對(duì)照組(n=60)。治療組男性37例、女性28例；年齡 40～81歲，平均年齡(55.42±5.99)歲；病程0.7～4.8 h，平均病程(3.19±0.88) h；體重指數(shù)(BMI)21.58～25.17 kg/m2，平均BMI(23.37±2.97) kg/m2；合并癥：既往高血壓40例，糖尿病25例；既往吸煙史34例，飲酒史31例。對(duì)照組男性35例、女性25例，年齡41～79歲；平均年齡(54.95±5.93)歲；病程0.6～4.9 h，平均病程(3.27±0.92) h；BMI 21.40～25.30 kg/m2，平均BMI(23.24±2.80) kg/m2；合并癥：既往高血壓37例，糖尿病23例；既往吸煙史32例，飲酒史28例。兩組基線資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具可比性。

1.2 給藥方法

兩組入院后經(jīng)綠色通道盡快完成治療前相關(guān)檢查，合并高血壓、糖尿病等患者給予相應(yīng)的對(duì)癥藥物治療，并根據(jù)病情控制血壓、血糖，維持水電解質(zhì)、酸堿平衡，同時(shí)予依達(dá)拉奉(西安利君有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20080495，批號(hào)：1911021，規(guī)格：20 ml∶30 mg)30 mg+100 ml 0.9%氯化鈉注射液靜脈滴注，bid，以清除自由基；予奧拉西坦注射液(河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心，國(guó)藥準(zhǔn)字H20174066，批號(hào)：190315，規(guī)格: 5 ml∶1.0 g)4.0 g+250 ml 0.9%氯化鈉注射液靜脈滴注，qd，以保護(hù)神經(jīng)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)照組予以鹽酸替羅非班(魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20041164，批號(hào)：85191201，規(guī)格：100 ml∶5 mg)0.4 μg/(kg·min)，靜脈滴注30 min后，并以0.1 μg/(kg·min)的速度靜脈微泵替羅非班，持續(xù)1天。停用鹽酸替羅非班2 h前，口服硫酸氫氯吡格雷片(賽諾菲制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20123115，批號(hào)：181126，規(guī)格：75 mg/片)75 mg，1次/d；拜阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20171021，批號(hào)：BJ48737，規(guī)格:100 mg/片)100 mg/d，qd，并維持用藥2周。

治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加予丹紅注射液(山東丹紅制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026866，批號(hào)：18101023，規(guī)格：10 ml/支)20 ml+0.9%氯化鈉注射液250 ml靜脈滴注，qd，持續(xù)治療2周。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1NF-κB p50和p65 mRNA

采用熒光定量PCR法檢測(cè)，即用Trizol試劑(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)LM-0010)提取血液中的總RNA，并參照試劑盒說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。據(jù)PCR試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨號(hào)KM-90408)操作說(shuō)明，以β-actin為內(nèi)對(duì)照，并用同一樣品的cDNA和同樣的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行NF-κB p50、p65的mRNA擴(kuò)增。完畢后以Primer軟件設(shè)計(jì)引物，分析界面并計(jì)算樣品中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平為2-ΔΔCt。引物序列見表1。

表1 Real time-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3.2NF-κB p50和p65蛋白

外周血加入200 μl紅細(xì)胞裂解試劑(北京博蕾德科技發(fā)展有限公司)，冰上放置30 min充分裂解細(xì)胞，3000 r/min離心10 min，收集上清為細(xì)胞裂解液。用Thermo Sdentific Pierce BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)進(jìn)行蛋白定量，即為RIPA提取腦組織蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，10%)分離蛋白質(zhì)樣品，上樣量為30 μg/孔，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，10%脫脂奶粉室溫振蕩封閉2 h，然后加入1∶3000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔的二抗(上海研生生化試劑有限公司)室溫孵育過(guò)夜，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。設(shè)β-actin為內(nèi)參照基因，采用軟件對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析，測(cè)出各條帶IOD值，表示NF-κB p50、p65二者相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3炎癥反應(yīng)指標(biāo)

分別于治療前后，采集患者空腹外周靜脈血 6 ml，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝，抗凝劑與靜脈血的比例為9∶1，輕輕充分混勻，以轉(zhuǎn)速3000 r/min離心6 min，取上清液于-20 ℃保存待測(cè)，采用ELISA檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-8(IL-8)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。

1.3.4療效判斷

采用日常生活活動(dòng)(ADL)評(píng)分測(cè)評(píng)生活質(zhì)量，分值范圍在0～100分，分值與生活質(zhì)量呈正相關(guān)；采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評(píng)分測(cè)評(píng)患者的神經(jīng)缺損情況，分值范圍在0～42分，分值與生活質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。

1.3.5用藥安全性

觀察并記錄兩組患者治療期間出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達(dá)

治療前，兩組的NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白無(wú)顯著差異(P>0.05)。治療后，兩組的NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白均下降，且治療組低于對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

組別NF-κB p50NF-κB p65mRNA蛋白mRNA蛋白治療前治療2周后治療前治療2周后治療前治療2周后治療前治療2周后治療組(n=65)2.07±0.511.00±0.201.95±0.520.92±0.183.20±0.681.88±0.223.24±0.701.90±0.21對(duì)照組(n=60)2.04±0.521.39±0.271.91±0.511.34±0.263.23±0.702.62±0.293.26±0.682.55±0.35t值0.339.120.4310.420.2415.970.1612.46P值0.750.000.670.000.810.000.870.00

2.2 炎癥反應(yīng)指標(biāo)

治療前，兩組的血清TNF-α、IL-8、IL-1β無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。治療后，兩組的血清TNF-α、IL-8、IL-1β均下降，且治療組低于對(duì)照組(P<0.01)。見表3。

組別 TNF-α(ng/L)IL-8(pg/ml)IL-1β(ng/L)治療前治療2周后治療前治療2周后治療前治療2周后治療組(n=65)30.50±5.2912.24±2.07349.47±38.92194.42±20.9020.16±4.617.52±2.31對(duì)照組(n=60)30.31±5.2219.50±3.26351.59±39.25237.72±28.5920.36±4.5912.34±3.60t值0.20114.730.309.600.248.83P值0.840.000.760.000.810.00

2.3 療效判斷

治療前，兩組的NHISS評(píng)分、ADL評(píng)分無(wú)顯著差異(P>0.05)。治療后，兩組的NHISS評(píng)分均下降，且治療組低于對(duì)照組(P<0.01)；兩組的ADL評(píng)分均上升，且治療組高于對(duì)照組(P<0.01)。見表4。

表4 兩組療效判斷比較 分

2.4 不良反應(yīng)

125例患者全部完成試驗(yàn)，無(wú)病死與脫失病例，且治療前后心電圖、生化檢查等未見顯著變化，無(wú)低灌注等情況發(fā)生。

3 討論

ACI多是供應(yīng)腦部血液的動(dòng)脈被粥樣硬化、血栓或栓子堵塞所致的嚴(yán)重腦組織軟化、壞死，在臨床上具有發(fā)病急、進(jìn)展快、治療難度大等特點(diǎn)[7]。相關(guān)統(tǒng)計(jì)調(diào)查表明[8]，生活節(jié)奏加快、人口老齡化程度加重以及高脂飲食、運(yùn)動(dòng)減少等均導(dǎo)致ACI患病率逐漸升高，約有65%～70%的患者有再次發(fā)生急性腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，具有更高的病死率。

既往研究發(fā)現(xiàn)[9]，NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活是ACI發(fā)展的重要病理機(jī)制，其既可維持腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，又可介導(dǎo)病原特異性應(yīng)答。NF-κB屬NF-κB/Rel家族中的一員，正常生理?xiàng)l件下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中以p50/p65二聚體形式存在，并與其抑制蛋白IκB結(jié)合，滯留于細(xì)胞質(zhì)中且無(wú)轉(zhuǎn)錄活性[10]。當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，腦組織內(nèi)TNF-α、IL-1β等炎癥介質(zhì)含量增多，可導(dǎo)致NF-κB的激活，而源于炎癥反應(yīng)激活的NF-κB可刺激誘導(dǎo)炎癥因子、活性氧(ROS)等的產(chǎn)生，而二者又可反饋激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物IKKs，后者將三聚體p50/p65/IκB的IκB亞基調(diào)節(jié)位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化，IκB蛋白從三聚體解離下來(lái)，使p50及p65暴露，繼而釋放p50/p65并發(fā)生核轉(zhuǎn)位與相應(yīng)靶基因上的κB位點(diǎn)結(jié)合調(diào)節(jié)TNF-α、IL-8、IL-1β、Bcl-2等靶基因轉(zhuǎn)錄[11]。研究結(jié)果顯示[12]，TNF-α、IL-8、IL-1β水平隨缺血再灌注損傷病情進(jìn)展不斷升高，形成“瀑布效應(yīng)”，加重腦組織損傷。TNF-α是炎癥反應(yīng)的觸發(fā)因子，能夠介導(dǎo)炎癥細(xì)胞發(fā)生聚集與黏附，同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞等合成并分泌大量IL-1β等二級(jí)炎癥因子，由此造成的炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)可造成遠(yuǎn)隔組織的功能損傷，而后者又正反饋調(diào)節(jié)NF-κB的激活，刺激多種凋亡相關(guān)基因的表達(dá)并造成神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，形成惡性循環(huán)[13]。IL-8多由于NF-κB過(guò)度表達(dá)所激活和釋放，其可結(jié)合趨化因子受體IL-8受體α，誘導(dǎo)釋放大量蛋白酶直接損傷腦組織，促進(jìn)后續(xù)一系列病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞及缺血組織損傷加劇[14]。由此可見，ACI患者長(zhǎng)期處于一種炎性損害循環(huán)中，而若ACI患者本身合并有高血壓、糖尿病等慢性炎癥疾病，NF-κB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對(duì)其影響更為嚴(yán)重，因此探究NF-κB的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要[15]。本研究結(jié)果可見，治療組的NF-κB p50、p65 mRNA和蛋白表達(dá)以及炎癥反應(yīng)指標(biāo)TNF-α、IL-8、IL-1β水平均低于對(duì)照組。提示丹紅注射液輔助治療能夠抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活和炎癥因子的釋放，這可能是該方案改善患者腦組織損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要因素之一。

既往文獻(xiàn)指出[16]，對(duì)于ACI患者而言，生理、生活質(zhì)量的綜合康復(fù)在推動(dòng)患者回歸社會(huì)進(jìn)程中起重要作用，因此，為更準(zhǔn)確地提供上述領(lǐng)域細(xì)節(jié)上的信息，本研究采用ADL評(píng)分、NHISS評(píng)分進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，經(jīng)治療干預(yù)后治療組ADL評(píng)分高于對(duì)照組，NHISS評(píng)分低于對(duì)照組。提示丹紅注射液聯(lián)合替羅非班較單一應(yīng)用替羅非班更能夠有效減輕患者腦損傷程度，改善其神經(jīng)功能及生活質(zhì)量，治療效果確切。分析原因可能是丹紅注射液聯(lián)合替羅非班均具有抗血小板作用，可發(fā)揮一定協(xié)同作用，促使血管舒張，增加血管通透性。同時(shí)，丹紅注射液亦可激活內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制動(dòng)脈硬化進(jìn)程，以恢復(fù)血腦屏障正常結(jié)構(gòu)并改善腦內(nèi)供血和供氧，保護(hù)腦組織內(nèi)環(huán)境[9]，進(jìn)而達(dá)到治療目的。

綜上，丹紅注射液聯(lián)合替羅非班治療ACI能進(jìn)一步改善患者預(yù)后，其機(jī)制可能與抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的活化及炎癥因子釋放有關(guān)。然而，本研究時(shí)間較短，可能對(duì)研究結(jié)果可信度造成一定影響，此為不足之處，因此該方案的中長(zhǎng)期療效尚有待更長(zhǎng)期的大樣本研究加以證實(shí)。