液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中西布曲明的不確定度

王賽楠 - 鄧迎春 - 高天藍(lán)星 --任夢(mèng)柯 - 魏華琳 - 智文莉 - 郭旭光 -

(河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測(cè)所，河南 鄭州 450003)

西布曲明是一種中樞神經(jīng)抑制劑，主要通過(guò)其次級(jí)和初級(jí)類代謝產(chǎn)物而產(chǎn)生作用，其作用機(jī)理為抑制5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺的再攝取，增強(qiáng)飽食感并加速能量消耗，由此達(dá)到治療肥胖癥的效果。研究表明，西布曲明可能會(huì)導(dǎo)致口干、頭痛、煩躁、失眠、厭食[1-2]，引起神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的不良反應(yīng)[3]。2010年，中國(guó)國(guó)家藥監(jiān)局要求停止西布曲明的生產(chǎn)、銷售和使用，但違規(guī)添加西布曲明制造假冒減肥藥、減肥食品的案件仍層出不窮[4-6]。

不確定度是評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的指標(biāo)，其值越小，試驗(yàn)值與真實(shí)值越接近[7-8]。文章擬根據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS-GL06：2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》的規(guī)定，建立測(cè)量模型，對(duì)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定保健食品中西布曲明含量的不確定度進(jìn)行分析，找出影響檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵因素，旨在為保健食品中西布曲明的檢測(cè)數(shù)據(jù)使用和準(zhǔn)確評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ ALTIS型，配有電噴霧離子源ESI，美國(guó)Thermo公司；

電子天平：XPE205TDR型，瑞士Mettler Toledo公司；

電子天平：ME204型，瑞士Mettler Toledo公司；

鹽酸西布曲明標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：84485-00-7)：純度99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

甲酸：色譜純，美國(guó)Thermo公司；

甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；

保健食品(能力驗(yàn)證樣品)：中位值6.83 μg/g，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 精密稱取待測(cè)樣品1 g(精確到0.001 g )，精密加入10 mL甲醇適量，超聲10 min，冷卻，稱重，加甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，靜置，過(guò)0.22 μm濾膜。取續(xù)濾液1 mL定容至10 mL，搖勻，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，10%甲醇；1.0～1.5 min， 10%～85%甲醇；1.5～3.5 min， 85%甲醇；3.5～4.0 min，85%～10%甲醇；4.0～5.0 min，10%甲醇；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；柱溫35 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子化模式為電噴霧離子源；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正離子模式；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化溫度320 ℃；離子對(duì)、碰撞能量及碎裂電壓等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 西布曲明質(zhì)譜參數(shù)?Table 1 Ms parameters of sibutramine

? *表示定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度數(shù)學(xué)模型[9]：

(1)

式中：

X——樣品中西布曲明含量，μg/g；

c——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得樣品溶液中西布曲明質(zhì)量濃度，ng/mL；

V——樣品定容體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

f——稀釋倍數(shù)；

1 000——換算因子。

2.2 不確定度來(lái)源分析

由圖1可知，西布曲明測(cè)量不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制、樣品稱量、樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品測(cè)量重復(fù)性(儀器性能、人員操作、隨機(jī)誤差)等引起的不確定度[10-12]。

圖1 不確定度來(lái)源Figure 1 Sources of uncertainty

2.3 不確定度的評(píng)定

稱取1 g樣品于燒杯中，需使用兩次電子天平，則樣品稱量過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 樣品定容和稀釋過(guò)程引入的不確定度urel(V) 樣品定容和稀釋過(guò)程使用玻璃量器均為A級(jí)，根據(jù)JJG 196—2006規(guī)定的偏差要求，玻璃量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表2所示，樣品定容、稀釋過(guò)程使用10 mL容量瓶?jī)纱巍? mL移液管一次，則樣品定容和稀釋過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 玻璃量器引入的不確定度Table 2 Uncertainty of glass conainer

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液配制過(guò)程引入的不確定度urel(Cs)

(5) 稀釋過(guò)程引入的不確定度：用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋配制成濃度為24.32，48.65，72.97，97.29，121.61 ng/mL的西布曲明標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)，與儀器測(cè)定峰面積引入的不確定度相比，逐級(jí)稀釋引入的不確定度可忽略不計(jì)。

因此，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度urel(S) 取2.2.3(5)中5種濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別測(cè)定3次，測(cè)得峰面積如表3所示。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程為A=32 657C-57 643。

表3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液峰面積Table 3 Peak area of standard solutions

樣品重復(fù)測(cè)定6次，峰面積代入線性回歸方程計(jì)算可得樣品溶液中西布曲明濃度分別為70.936，71.597，70.269，69.255，70.574，69.494 ng/mL，平均濃度c樣=70.35 ng/mL，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線過(guò)程所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：

SA——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)得峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

Sc——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度殘差的平方和；

n——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測(cè)定次數(shù)，此處取15；

P——樣品溶液測(cè)定次數(shù)，此處取6。

因此，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合過(guò)程所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.5 重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度urel(R) 樣品重復(fù)測(cè)定6次所得西布曲明含量見(jiàn)表4。重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度屬于A類，應(yīng)用貝塞爾法評(píng)定。此不確定度結(jié)果包含人員操作、儀器性能、樣品均勻性、隨機(jī)誤差等引入的不確定度。

表4 保健食品中西布曲明重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

Table 4 Repeatability test results of sibutramine in health foods (n =6)

序號(hào)含量序號(hào)含量17.09457.05727.16066.94937.02746.926平均值7.040

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中西布曲明不確定度分量匯總?cè)绫?所示。

表5 不確定度分量測(cè)量結(jié)果Table 5 Results of uncertainty components

保健食品中西布曲明含量為7.04 μg/g，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(X)=0.098 6 μg/g。

取k=2(置信概率95%)，則測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為：U=2u(x)=0.197 g/kg。

2.5 不確定度結(jié)果

根據(jù)BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的測(cè)定》測(cè)定，保健食品中西布曲明含量為：(7.04±0.197) μg/g，k=2。

3 結(jié)論

研究對(duì)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中西布曲明含量的不確定度進(jìn)行了量化分析。結(jié)果表明，依據(jù)BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的測(cè)定》測(cè)定西布曲明含量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度最大，而樣品稱量引入的不確定最小；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制和樣品定容過(guò)程中溫度對(duì)玻璃量具的影響很大。因此，在日常檢測(cè)過(guò)程中，應(yīng)特別注意通過(guò)儀器性能的維護(hù)保養(yǎng)、選取精度高的玻璃量具、加強(qiáng)對(duì)試驗(yàn)溫度的控制、規(guī)范人員操作等多種方式保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。