乳酸菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)與胃腸道的相互作用

丁詩瑤 - 雷文平 - 劉成國 -戴智勇 - 汪鎮(zhèn)南 - 周 輝

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128; 2. 澳優(yōu)乳業(yè)〔中國〕有限公司， 湖南 長沙 410200; 3. 湖南沙博安科技有限公司, 湖南 長沙 410200)

胃腸道(Gastrointestinal tract，GIT)是人體與環(huán)境接觸的最大表面，承擔(dān)著人體消化吸收的重要工作，同時腸道也是最大的免疫器官，在維持人體正常的免疫防御功能中發(fā)揮重要作用。GIT中寄居著10倍于體細(xì)胞的微生物，包括共生的優(yōu)勢菌群，共棲的條件致病菌與攝入的病原菌[1]。腸道微生物與宿主相互依存、共同進(jìn)化，其相互作用對人類健康至關(guān)重要[2]。相互作用可以是特異性和非特異性的，特異的相互作用包括微生物上的受體對特定位點(diǎn)或配體的識別，而非特異性相互作用則由細(xì)菌細(xì)胞壁的整體物理化學(xué)特性決定[3]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，具有許多生理功能，如增強(qiáng)免疫力；促進(jìn)營養(yǎng)吸收、提高營養(yǎng)利用率；調(diào)節(jié)和維持腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡；延緩衰老、抗氧化；降低血糖、血壓、膽固醇等[4]。乳酸菌在通過胃腸道的過程中會針對各種不利的環(huán)境壓力(如酸、膽鹽、氧化、滲透和饑餓)調(diào)節(jié)自身的生存策略，一部分菌株能夠耐受這些壓力，以順利通過胃部，在小腸中成為最優(yōu)勢菌[5]，但其在糞便中只占0.01%～0.60%。研究[6]表明，不同的乳酸菌菌株的特性差別較大，故而一株菌的結(jié)果不能適用于其他菌株。乳酸菌定植于胃腸道是發(fā)揮其生理功能的先決條件，而細(xì)胞表面成分會影響乳酸菌的粘附能力。文章擬從乳酸菌的表面成分出發(fā)，綜述這些成分影響其與人體胃腸道的相互作用，為深入了解乳酸菌生理功能的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)

乳酸菌的細(xì)胞膜主要由包裹著一些蛋白的磷脂雙分子層組成，細(xì)胞壁是以多層肽聚糖為骨架，多種蛋白質(zhì)、胞外多糖和磷壁酸通過不同機(jī)制嵌入其中。某些乳酸菌在肽聚糖外還附著一層蛋白質(zhì)副晶體層，被稱為S層蛋白。這些成分或多或少會影響乳酸菌的生理功能以及與宿主的相互作用。

1.1 肽聚糖

肽聚糖(PG)是由若干單體連接而成的網(wǎng)狀大分子復(fù)合體，單體由雙糖和肽鏈組成。雙糖包括N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)，通過β-1,4糖苷鍵交替連接。β-1,4糖苷鍵是溶菌酶的隨機(jī)切割位點(diǎn)，但N-脫乙?；梢员Ｗo(hù)細(xì)菌免受溶菌酶的侵害[7]。肽鏈部分是由4個氨基酸分子通過肽橋連接而成的四肽側(cè)鏈，肽鏈與MurNAc相連，其中肽橋的構(gòu)造變化較多，在不同的細(xì)菌中具有差異性，因此肽聚糖具有多樣性[8]。肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的最大組成成分，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以很好地維持細(xì)胞的完整性，同時限制大分子的進(jìn)出。

1.2 磷壁酸

磷壁酸(TA)是由甘油或核糖醇?xì)埢ㄟ^磷酸二鍵連接的弱酸性聚合物，根據(jù)其在細(xì)胞壁中的固定方式可分為脂磷壁酸(LTA)和壁磷壁酸(WTA)，壁磷壁酸與肽聚糖中的MurNAc共價連接[9]，脂磷壁酸與細(xì)胞膜中的糖脂相連。在大部分革蘭氏陽性細(xì)菌中，LTA與WTA并存，但在某些細(xì)菌物種中，如干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，可能僅存在LTA[10]。磷壁酸占細(xì)胞壁干重的50%，其結(jié)構(gòu)和數(shù)量隨環(huán)境變化和生長階段的不同而改變[11]。

1.3 細(xì)胞壁多糖

細(xì)胞表面除PG和TA外，還包含一些多糖，分為3種：釋放至細(xì)胞外的胞外多糖(EPS)，與細(xì)胞壁中的PG緊密結(jié)合且能形成屏障的莢膜多糖(CPS)，以及與細(xì)胞壁松散結(jié)合的壁多糖(WPS)。其中EPS應(yīng)用較多，其可以是由同種單糖組合而成的單多糖，如葡聚糖和果聚糖；也可以是由不同單糖組合而成的雜多糖。胞外多糖親水性能優(yōu)異，能在細(xì)胞周圍形成一層保護(hù)，使細(xì)胞在干燥、極端溫度、高滲透壓條件下生存，胞外多糖還可以促進(jìn)生物膜形成與細(xì)胞識別，抑制被有害菌吞噬等生理作用[12]。

1.4 表層蛋白

乳酸菌的表層蛋白又稱S層蛋白，是細(xì)胞包膜的最外層結(jié)構(gòu)，占細(xì)胞壁蛋白的10%～15%，通常由分子量為40～170 kDa的單一蛋白質(zhì)或糖蛋白組成，不同乳酸菌的S層蛋白總體組成相似[13]。結(jié)構(gòu)上，細(xì)菌S層蛋白是多孔的蛋白質(zhì)網(wǎng)，厚度為5～10 nm，孔隙率約為70%，蛋白質(zhì)或糖蛋白亞基的平面裝配體呈傾斜(p1，p2)、正方形(p4)或六邊形(p3，p6)對稱的格子排列[14]。乳酸桿菌的S層蛋白具備獨(dú)有的特性：呈堿性，等電點(diǎn)為9.35～10.40[15]。S層蛋白能促進(jìn)細(xì)胞表面識別，維持細(xì)胞形狀，并起到保護(hù)層和分子篩的作用[16]。

1.5 菌毛

菌毛為纖細(xì)的蛋白結(jié)構(gòu)，由多肽亞基共價組裝而成，一端延伸至細(xì)胞外，另一端在細(xì)胞壁中固定于PG層上，固定方式包括通過β鏈插入與亞基相互作用的非共價連接，或通過分選酶鍵共價連接[17]。菌毛在細(xì)菌粘附、侵襲、聚集、生物膜形成和免疫調(diào)節(jié)中都能發(fā)揮作用。

2 乳酸菌對腸胃道的適應(yīng)性

2.1 耐酸、耐膽鹽

乳酸菌入口后，必須以活菌形式通過胃部，才有在GIT定植的可能。胃中的pH波動較大，一般為3.0左右，乳酸菌若要順利通過胃部，須具有一定的耐酸能力。乳酸菌的主要耐酸機(jī)制有谷氨酸脫羧酶(GAD)系統(tǒng)、質(zhì)子泵和產(chǎn)生堿性化合物等。某些乳桿菌運(yùn)用GAD系統(tǒng)，使其能在酸性環(huán)境中生存，GAD可催化谷氨酸脫羧生成γ-氨基丁酸(GABA)，GABA是一種生物活性化合物，可在人體中充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)。在這個過程中，谷氨酸的獲取和GABA的排出是由某種逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的，其與谷氨酸的脫羧基一起產(chǎn)生質(zhì)子動勢，由于去除了氫離子，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)pH升高；同時谷氨酸鹽變成了更強(qiáng)堿性的化合物GABA，細(xì)胞外pH略有增加[18]。另一些乳酸菌如植物乳桿菌可改變丙酮酸代謝，增加堿性化合物如賴氨酸、二乙酰及乙酰丙酮的合成，以在酸性環(huán)境中生存[19]。此外，一些乳酸菌可利用F-ATPase作為質(zhì)子泵來維持細(xì)胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)-ATPase是一種多聚酶，在乳酸菌細(xì)胞內(nèi)通過多種方式合成ATP并生成質(zhì)子動勢。在這些反應(yīng)中，物質(zhì)在細(xì)胞中的進(jìn)出離不開細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的參與調(diào)控，一些決定性物質(zhì)如F-ATPase就存在于細(xì)胞膜上。有學(xué)者[20]提出，LTA和WTA可在酸性條件下維持細(xì)胞的完整性。酸性條件下，細(xì)胞包膜作為保護(hù)細(xì)菌的第一道屏障，其成分發(fā)生變化也會引起細(xì)胞表面性質(zhì)的改變，再結(jié)合其他系統(tǒng)抵抗酸脅迫的機(jī)制，共同應(yīng)對酸性條件下細(xì)胞的存活和正常生理功能。

乳酸菌順利通過胃部后會在小腸前段經(jīng)歷膽汁脅迫，膽汁酸在肝臟中以膽固醇為前體合成，與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合后成為膽汁進(jìn)入腸道，在腸道中遇上乳酸菌可能會被其表達(dá)的膽鹽水解酶(BSH)水解。在膽鹽脅迫條件下，細(xì)胞包膜有助于維持細(xì)胞的完整性，膽汁被BSH水解的產(chǎn)物已被證明可以提高羅伊式乳桿菌細(xì)胞包膜中不飽和脂肪酸的含量，并增加膜的柔韌性和強(qiáng)度[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，在嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)基中添加膽鹽時，可以提取到高濃度的S層蛋白，表明S層蛋白可能與乳酸菌耐受膽鹽有關(guān)。

2.2 抗氧化、滲透

維持細(xì)胞形狀和抵抗細(xì)胞內(nèi)滲透壓是細(xì)胞壁的主要功能之一。乳酸菌應(yīng)對滲透脅迫一種方式是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氨基酸的濃度，除常見的脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸外，由細(xì)胞包膜相關(guān)蛋白酶產(chǎn)生的二肽和三肽也可以用來調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓[23]。此外，乳酸菌從環(huán)境中獲取滲透保護(hù)液，獲取的過程由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)，這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)胞膜中脂質(zhì)的相互作用決定其對滲透壓的反應(yīng)活性[24]。

氧氣本身不會損壞細(xì)胞，但是在代謝途徑的運(yùn)行過程中，氧氣會部分還原為水，從而導(dǎo)致合成超氧陰離子自由基、羥基自由基和H2O2，對細(xì)胞造成氧化脅迫。在乳酸菌中，抗氧化的活性物質(zhì)主要存在于胞外分泌物中[25]。有關(guān)植物乳桿菌、格氏乳桿菌等乳酸菌的EPS具有良好的抗氧化活性已被確立，其特異性對DPPH自由基、超氧化物、羥基自由基等活性氧成分起作用[26]。瑞士乳桿菌細(xì)胞膜的脂肪酸組成可以減少氧化應(yīng)激給細(xì)胞帶來的傷害，因?yàn)橄难鯕獾闹舅崛ワ柡兔赶到y(tǒng)活性增強(qiáng)，可以減少細(xì)胞內(nèi)的自由基損傷[27]。

2.3 耐饑餓

乳酸菌在生長過程中需要不斷消耗營養(yǎng)物質(zhì)，但在GIT中，乳酸菌會時常處于極端條件下，除了營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，其他脅迫也可能導(dǎo)致細(xì)菌無法正常攝取自身所需的營養(yǎng)，使得乳酸菌細(xì)胞生長受到限制。一些微生物在營養(yǎng)缺乏時，會產(chǎn)生孢子進(jìn)入休眠狀態(tài)，而乳酸菌不能產(chǎn)生孢子，但不同乳酸菌已進(jìn)化出不同的應(yīng)對饑餓脅迫的生長策略。饑餓脅迫的研究通常會限制單一營養(yǎng)物質(zhì)的攝入，碳源的控制導(dǎo)致細(xì)胞能量不足，氮源的減少限制蛋白質(zhì)的合成，磷酸鹽的缺乏影響能量供給和DNA的合成[28]。在碳源饑餓脅迫條件下，保加利亞乳桿菌對其他脅迫的抵抗會被誘發(fā)和增加[29]。另外氨基酸代謝，如精氨酸的分解，也會維持細(xì)胞在饑餓脅迫下對能量的需求。

3 乳酸菌與胃腸道的相互作用

人體GIT在一定情況下構(gòu)成了抵御細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲的第一道防線，這些微生物進(jìn)入GIT后會充當(dāng)病原體影響到人體健康，除GIT上皮細(xì)胞可對其作出反應(yīng)外，共生的乳酸菌也可以通過自身的某些機(jī)制與上皮細(xì)胞相互作用，共同抵御病原體侵襲，維持GIT穩(wěn)態(tài)。

3.1 粘附

乳酸菌粘附GIT黏膜的能力可較大程度地決定其在腸道定植時間的長短，直接影響乳酸菌對腸道病原菌的競爭及調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)。目前揭示的乳酸菌粘附機(jī)制主要有以下幾種：首先是黏液結(jié)合蛋白，例如羅伊氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌的MuB以及植物乳桿菌WCFS1的凝集素樣甘露糖特異性黏附素(Msa)，Mub與細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖層形成共價結(jié)合的黏附蛋白，作用于腸上皮細(xì)胞分泌的黏液蛋白[30]。胞外多糖與細(xì)胞粘附可能呈負(fù)相關(guān)，研究[31]表明EPS通過覆蓋特定的結(jié)合位點(diǎn)降低細(xì)菌的結(jié)合能力，同時，分子量是影響不同產(chǎn)EPS乳酸菌細(xì)胞粘附能力的關(guān)鍵因素。菌毛也具有增強(qiáng)細(xì)胞粘附能力的特性，目前在鼠李糖乳桿菌GG(LGG)中研究較多，LGG的菌毛由3個亞基組成，分別是SpaA、SpaB和SpaC，其中，SpaA是菌毛的主要纖維部分，而位于菌毛尖端的SpaC是給予 LGG 的高粘附能力的黏液結(jié)合蛋白[32]。S層蛋白也是細(xì)菌的黏附素之一。S層蛋白能夠與具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的顆粒和材料相互作用，從而有利于整個細(xì)胞粘附于固體表面[13]。在嗜酸乳桿菌中，46 kDa的SlpA是其S層的主要蛋白質(zhì)，其失活會大大降低細(xì)菌對Caco-2細(xì)胞的粘附，除SlpA 外，刪除嗜酸乳桿菌NCFM中的FbpA蛋白基因會減少細(xì)菌對Caco-2細(xì)胞76%的粘附，并且FpbA同源物廣泛存在于乳酸桿菌基因組中[33]。也有證據(jù)[34]表明，LTA可以在乳酸菌粘附人腸道上皮細(xì)胞中起中介作用。粘附過程中，乳酸菌的表面結(jié)構(gòu)是與腸道上皮組織直接作用的部分，表面結(jié)構(gòu)的改變和成分的增減，會直接影響乳酸菌的表面性質(zhì)，從而改變細(xì)菌對黏膜的粘附能力。

3.2 維持上皮屏障功能

腸道上皮在人體內(nèi)環(huán)境和共生細(xì)菌之間形成一種屏障功能，與腸道有益菌株共同隔絕、限制病原體接觸內(nèi)層細(xì)胞，維護(hù)GIT穩(wěn)態(tài)，保障宿主不受病原菌的侵襲。腸上皮由不同類型的細(xì)胞組成，如腸上皮細(xì)胞、Paneth細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)膜細(xì)胞和微折疊細(xì)胞。研究[35]表明，腸杯狀細(xì)胞的一種分泌肽基因TFF3可以由乳酸菌調(diào)節(jié)，參與黏膜的愈合和再生；植物乳酸桿菌、羅伊氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和嗜熱鏈球菌等幾種乳酸菌菌株對其表達(dá)具有顯著增強(qiáng)作用，表明這些促進(jìn)TFF3的LAB菌株具有促進(jìn)腸黏膜恢復(fù)和愈合的潛力，有助于維持黏液屏障的完整性。除黏液外，乳酸菌也會影響小腸上皮其他部分，通過對HT-29細(xì)胞的研究[36]表明，約氏乳桿菌菌和嗜酸乳桿菌LTA的脂質(zhì)部分能抑制大腸桿菌及其脂多糖誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-8，而IL-8是趨化因子，是血管生成的有效啟動子。腸道上皮的面積雖大，但結(jié)合位點(diǎn)有限，一些高粘附乳酸菌通過占據(jù)腸上皮的粘附結(jié)合位點(diǎn)，阻止病原菌在腸道上皮定植，從而維持腸道上皮健康。

3.3 免疫調(diào)節(jié)

乳酸菌可以通過與GIT黏膜的相互作用來調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，腸道上皮細(xì)胞與微生物抗原和免疫細(xì)胞建立雙向通信，積極參與黏膜防御反應(yīng)的啟動、調(diào)控和消退。上皮細(xì)胞會表達(dá)先天性和獲得性免疫受體參與黏膜免疫，先天性受體保證病原體相關(guān)分子模式(PAMP)被病原體識別受體(PRR)識別，其中Toll樣受體(TLR)和核苷酸結(jié)合寡聚域(NOD)樣受體(NLR)研究最為廣泛。腸上皮細(xì)胞主要通過免疫球蛋白(Ig)受體表達(dá)和促進(jìn)局部Ig類別轉(zhuǎn)換來參與適應(yīng)性免疫[37]。鼠李糖乳桿菌純化的EPS 能降低促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-12的水平[38]。在干酪乳桿菌Shirota中，部分細(xì)胞壁多糖(WPS)編碼基因簇的缺失導(dǎo)致與細(xì)菌細(xì)胞表面相關(guān)的高分子量多糖減少，同時熱滅活的突變株誘導(dǎo)TNF-α、IL-12、IL-10和IL-6的產(chǎn)生[39]。EPS可以激活巨噬細(xì)胞[40]。細(xì)胞壁中的LTA也能刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還能激活免疫應(yīng)答的補(bǔ)體系統(tǒng)，影響其巨噬細(xì)胞參數(shù)，包括TNF-α和亞硝酸鹽的分泌[7]。LTA和WTA還能與巨噬細(xì)胞清除劑受體結(jié)合，有助于免疫信號傳導(dǎo)。嗜酸乳桿菌的S層蛋白能與樹突細(xì)胞上的主要受體相互作用，調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫功能[13]。而短乳桿菌D6的S層蛋白也能輕微誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞中TNF-α的產(chǎn)生[41]。此外，鼠李糖乳桿菌GG的巖藻糖基化和甘露糖基化SpaCBA菌毛與人樹突細(xì)胞上的C型凝集素受體 DC-SIGN相互作用，從而調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[42]。

4 結(jié)語

乳酸菌的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)是一個動態(tài)結(jié)構(gòu)，在不同培養(yǎng)條件及環(huán)境因素下表面結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)一個變化的過程，這種變化在細(xì)菌的生理和功能方面起著至關(guān)重要的作用。大量的研究表明，乳酸菌細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)有助于乳酸菌細(xì)胞適應(yīng)GIT中的極端環(huán)境，更好地定植于腸道，并且乳酸菌與腸道上皮相互作用，為宿主的免疫提供積極的影響。后續(xù)需進(jìn)一步分離純化乳酸菌表面結(jié)構(gòu)組分，利用體外試驗(yàn)探究表面結(jié)構(gòu)對細(xì)胞模型的調(diào)節(jié)機(jī)制和通路，以便于更好地篩選出具有良好生理特性的乳酸菌。