基于LPS誘導(dǎo)RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型的榴蓮殼多酚抗炎作用及其分子機(jī)制

劉文強(qiáng) - 張懿玲 - 熊 華 朱雪梅 - 孫 永

(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 333047；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)， 江西 南昌 330004；3. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034)

炎癥是機(jī)體受到損傷或有害刺激后產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)[1]，與許多疾病的發(fā)展聯(lián)系密切，包括肝硬化、癌癥、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等慢性疾病[2-3]。許多化學(xué)合成藥物已被用于預(yù)防或治療炎癥，如非甾體抗炎藥物(NSAID)，但這些藥物通常有副作用，如肝毒性、腎病、消化性潰瘍、腹瀉、嘔吐，并對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生傷害。研究[4-6]表明，水果中的一些功能性成分能夠抑制或緩解機(jī)體炎癥，且無毒副作用。而水果中豐富的多酚類化合物，因其具有優(yōu)良的抗氧化活性，能夠清除生物體內(nèi)大量的活性氧自由基，從而預(yù)防疾病的發(fā)生[7-8]。

榴蓮(DuriozibethinusMurr.)是東南亞最受歡迎的熱帶水果之一，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-10]和獨(dú)特的口感風(fēng)味，由于其外觀類似于亞洲國(guó)王的荊棘而被稱為“熱帶水果之王”[10-12]。榴蓮果肉和果殼都含有豐富的生物活性化合物，如花青素、類胡蘿卜素、多酚、黃酮等[13-15]。Kanthimathi等[16]研究表明榴蓮富含多酚和黃酮化合物，且對(duì)一氧化氮誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞增殖具有保護(hù)作用。馮健英等[17]發(fā)現(xiàn)從榴蓮中分離出的酚類物質(zhì)具有顯著的NO抑制活性。此外，榴蓮內(nèi)皮提取物也具有抗炎活性，能顯著抑制LPS(脂多糖)誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞所產(chǎn)生的 NO和炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的釋放[18]。目前的研究多集中于榴蓮果肉、內(nèi)皮，而關(guān)于榴蓮殼的研究相對(duì)較少。Na等[9, 14]發(fā)現(xiàn)榴蓮殼提取物對(duì) DPPH和ABTS自由基具有較高的清除率，且與多酚含量有關(guān)。Ho等[19]發(fā)現(xiàn)榴蓮殼提取物具有抗糖尿病、降血脂、抗增殖活性和抗菌活性。但有關(guān)榴蓮殼多酚的抗炎作用及其分子機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。試驗(yàn)擬通過測(cè)定榴蓮殼提取物的總酚、總黃酮含量和抗氧化活性，并基于LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，探究榴蓮殼多酚的抗炎作用及其分子機(jī)制，旨在為其綜合利用和開發(fā)新型功能性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

ABTS試劑盒、FRAP試劑盒、DCFH-DA：中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所；

四甲基偶氮唑鹽(MTT)、氨卡青霉素/鏈霉素、 Trolox、二甲基亞砜(DMSO)、 RNA提取試劑盒：美國(guó) Sigma 公司；

丙酮酸鈉、DAEM完全培養(yǎng)基：美國(guó) Gibco 公司；

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7：中國(guó)科學(xué)院(上海)細(xì)胞庫；

蛋白Marker：全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)：CB 800 H型，蘇州凈化設(shè)備工程有限公司；

酶標(biāo)儀：MK3型，美國(guó) Thermo儀器有限公司；

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：CP-ST200A型，長(zhǎng)錦科技有限公司；

熒光定量PCR儀：CFX96型，美國(guó)BIO-RAD公司；

化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：ChemiDoc XRS型，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 榴蓮殼提取物的制備 取干凈的榴蓮殼洗凈，分離為榴蓮內(nèi)殼(白色內(nèi)果殼，也稱榴蓮皮)和榴蓮?fù)鈿?黃色外果殼)，冷凍干燥，超微粉碎，過60目篩。稱取榴蓮殼粉末20 g，按料液比1∶30 (g/mL)加入80%甲醇，40 ℃、超聲功率200 W超聲20 min，收集上清液，重復(fù)3次。上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得粗提物[榴蓮內(nèi)殼提取物(DPE)和榴蓮?fù)鈿ぬ崛∥?DSE)]。粗提物過Oasis?HLB 6cc (200 mg)純化柱后冷凍干燥，于-80 ℃冷凍備用。

1.3.2 總多酚、總黃酮含量測(cè)量 參照Sun等[20]的方法。

1.3.3 體外抗氧化活力測(cè)定

(1) DPPH自由基清除能力：參照Sun等[20]的方法。

(2) ABTS自由基清除能力：參照試劑盒說明書。

(3) Fe3+還原/抗氧化能力(FRAP)：參照試劑盒說明書。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7在含有10% FBS胎牛血清、1%雙抗(鏈霉素100 mg/mL、青霉素100 U/mL)和90% DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，按體積比1∶3的稀釋比對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.5 細(xì)胞活力測(cè)試 在96孔板中加入8×103個(gè)/孔對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW 264.7細(xì)胞，37 ℃，5% CO2條件下孵育過夜。加入不同濃度的DPE (0～500 μg/mL) 和DSE (0～500 μg/mL) 處理24 h，每孔中加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h后丟棄上層培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO溶解甲醛染料，避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于492 nm測(cè)定處吸光度。

1.3.6 榴蓮殼提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 在96孔板中加入8×103個(gè)/孔對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW 264.7細(xì)胞，37 ℃，5% CO2條件下孵育過夜。加入不同濃度的DPE (10，25，50 μg/mL) 和DSE (10，50，100 μg/mL) 處理2 h，加入終濃度為1 μg/mL的脂多糖(LPS)溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，收集上清液，參照一氧化氮(NO)試劑盒說明書，在96孔板中加入50 μL上清液后，加入50 μL Griess A，震蕩1 min，加入Griess B繼續(xù)反應(yīng)10 min，于540 nm處測(cè)定吸光度值，用NaNO2建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中亞硝酸鈉濃度，從而推算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量。

1.3.7 榴蓮殼提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞 ROS的影響 參照1.2.6對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，培養(yǎng)結(jié)束后，在黑暗條件下加入終濃度為100 μmol/L的2’, 7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光試劑，避光反應(yīng)30 min后，以激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng) 525 nm 的條件，用熒光酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 榴蓮殼提取物對(duì)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10分泌量的影響 按1.3.6對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，參照酶聯(lián)免疫吸附劑(ELISA)試劑盒說明書對(duì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的分泌量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各種炎癥因子的含量。

1.3.9 實(shí)時(shí)定量PCR 在6孔板中加入5×105個(gè)/孔對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW 264.7細(xì)胞，37 ℃，5% CO2條件下孵育過夜。加入不同濃度的DPE(10，25，50 μg/mL)和DSE(10，50，100 μg/mL)處理2 h，加入終濃度為1 μg/mL的LPS溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，去上清液，冰浴條件下收集細(xì)胞。用RNA提取試劑盒提取總RNA，分裝后置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。引物信息如?所示，使用CFX96 RT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

表1 基因的引物表Table 1 Related information for the primers

1.3.10 免疫印跡分析 在6孔板中加入5×105個(gè)/孔對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7細(xì)胞，37 ℃，5% CO2條件下孵育過夜。加入不同濃度的DPE (50 μg/mL)和DSE (50 μg/mL)處理2 h，加入終濃度為1 μg/mL的LPS溶液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后， 4 ℃、2 000 r/min離心5 min，去上清液，冰浴條件下收集細(xì)胞。向收集的細(xì)胞內(nèi)分別加入50 μL的RIPA細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，收集上清液，使用BCA蛋白試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。參照Miao等[1]的方法，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)測(cè)量iNOS、COX-2、IκB-α、p-IκB-α、p-p65、p65、GAPDH蛋白條帶，以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)條帶進(jìn)行量化。

1.3.11 統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果以(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行ANOVA因素。*表示與正常組(NC)相比存在顯著性差異(P<0.05)，**表示與正常組(NC)相比存在極顯著性差異(P<0.01)；#表示與模型組(LPS)相比存在顯著性差異(P<0.05)，##表示與模型組(LPS)相比存在極顯著性差異(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚、總黃酮和體外抗氧化活性

由表2可知，DPE的總酚、總黃酮含量分別為(135.52±4.25) mg GAE/g·DW，(56.79±0.73) mg CAE/g·DW，而DSE的總酚、總黃酮含量分別為(101.06±3.36) mg GAE/g·DW，(12.91±0.03) mg CAE/g·DW。結(jié)果表明，榴蓮的內(nèi)皮和外殼都含有豐富的酚類成分。Cui等[21]發(fā)現(xiàn)槲皮素能抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子的產(chǎn)生，Limtrakul等[22]發(fā)現(xiàn)原花青素可以抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥模型中的NO、IL-6、COX-2和iNOS的產(chǎn)生。此外，榴蓮內(nèi)皮提取物在LPS(脂多糖)誘導(dǎo)的小鼠RAW 264.7細(xì)胞模型中能顯著抑制NO的產(chǎn)生，同時(shí)抑制炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，從而展現(xiàn)出顯著的抗炎活性[18]。

由表2還可知，榴蓮殼內(nèi)皮和外殼均表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和Fe3+金屬離子螯合能力，說明榴蓮殼提取物具有顯著的抗氧化活性，且可能與其多酚含量有關(guān)[23-24]。因此，榴蓮殼可以作為抗氧化劑的優(yōu)良來源，用以預(yù)防機(jī)體的氧化損傷。此外，氧化應(yīng)激與機(jī)體炎癥密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的自由基離子(NO、ROS)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激[25-26]。

2.2 細(xì)胞活力分析

由圖1可知，DPE、DSE分別在10～50，10～100 μg/mL濃度下對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖沒有明顯抑制效果。因此，選擇DPE (10，25，50 μg/mL) 和DSE (10，50，100 μg/mL) 作為后續(xù)試驗(yàn)的濃度梯度。

表2 榴蓮殼提取物的總酚、總黃酮含量和抗氧化活性Table 2 Main antioxidant components and antioxidant activities in durian extract

圖1 榴蓮殼提取物對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞活力的影響Figure 1 Effect of the durian hull extract on cellviability in RAW 264.7 macrophages

2.3 榴蓮殼提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO和ROS的影響

由圖2可知，模型組的NO和ROS釋放量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比，各濃度DPE和DSE處理均能顯著降低NO和ROS釋放量(P<0.01)，且呈濃度依賴性。據(jù)報(bào)道[16]，榴蓮殼提取物能顯著降低細(xì)胞內(nèi)NO含量，且與其所含的多酚類化合物有關(guān)。

2.4 榴蓮殼提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α 、IL-1β 和IL-6的影響

由圖3可知，各濃度DPE和DSE處理后 IL-1β表達(dá)量分別為85.01～93.27，84.47～88.81 pg/mL，而IL-6的表達(dá)量分別為198.13～240.71，173.65～237.30 pg/mL。與模型組相比，DPE和DSE處理對(duì)IL-1β和IL-6的表達(dá)均具有顯著的抑制作用；當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，DPE和DSE處理對(duì)TNF-α才表現(xiàn)出明顯的抑制效果。據(jù)報(bào)道[27]，榴蓮殼提取物處理對(duì)IL-6和IL-1β的抑制效果比TNF-α更敏感，與試驗(yàn)結(jié)果相符。各濃度DPE和DSE處理對(duì)TNF-αmRNA表達(dá)的抑制率分別為38.87%～49.01%，34.25%～48.89%；對(duì)IL-1βmRNA表達(dá)的抑制率分別為59.24%～77.53%，54.78%～70.96%；對(duì)IL-6 mRNA表達(dá)的抑制率分別為51.62%～67.34%，50.17%～58.14%。結(jié)果表明，DPE和DSE處理對(duì)TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達(dá)具有很強(qiáng)的抑制作用，可能與其所含的多酚類化合物有關(guān)。綜上，DPE和DSE處理對(duì)細(xì)胞炎癥因子均有抑制作用(P<0.01)，表明榴蓮殼提取物能在蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。

2.5 榴蓮殼提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞iNOS和COX-2的影響

由圖4可知，模型組顯著提高了iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)量(P<0.01)。當(dāng)處理濃度為50 μg/mL時(shí)，DSE對(duì)iNOS和COX-2 mRNA的抑制率分別為57.25%，32.98%，DPE對(duì)iNOS和COX-2 mRNA的抑制率分別為53.81%，30.40%。與模型組相比，DPE和DSE處理對(duì)iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)均表現(xiàn)出明顯的抑制效果(P<0.01)。與模型組相比，當(dāng)處理濃度為50 μg/mL時(shí)，DSE對(duì)iNOS和COX-2蛋白的抑制率分別為18.99%，24.34%，而DPE對(duì)iNOS和COX-2蛋白的抑制率分別為11.11%，16.50%。綜上，DSE和DPE在基因和蛋白水平上均對(duì)iNOS 和COX-2的表達(dá)有顯著的抑制效果(P<0.01)。據(jù)報(bào)道[28]，iNOS 和COX-2的表達(dá)與NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。

2.6 榴蓮殼提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路的影響

由圖5可知，隨著LPS的刺激，模型組的IκB-α快速磷酸化，導(dǎo)致p-IκB-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。當(dāng)處理濃度為50 μg/mL時(shí)，DPE和DSE處理可顯著抑制IκB-α的磷酸化。LPS處理誘導(dǎo)p65的磷酸化水平顯著上升(P<0.01)，而DPE和DSE處理可顯著抑制其磷酸化水平。結(jié)果表明，DPE和DSE處理能降低IκB-α和p65的磷酸化水平，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活與表達(dá)，為其抗炎活性內(nèi)在的分子機(jī)制。

NC： 空白對(duì)照組；LPS： 1 μg/mL LPS處理組；DPE: 不同濃度DPE處理組；DSE: 不同濃度DSE處理組圖2 榴蓮殼提取物對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞表達(dá)的影響Figure 2 Effect of the durian hull extract on NO production and ROS expression in RAW 264.7 macrophages

NC： 空白對(duì)照組；LPS： 1 μg/mL LPS處理組；DPE: 不同濃度DPE處理組；DSE: 不同濃度DSE處理組圖3 榴蓮殼提取物對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子表達(dá)的影響Figure 3 Effect of the durian hull extract on the inflammatory factors expression in RAW 264.7 macrophages

NC： 空白對(duì)照組；LPS： 1 μg/mL LPS處理組；DPE: 不同濃度DPE處理組；DSE: 不同濃度DSE處理組圖4 榴蓮殼提取物對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of the durian hull extract on mRNA and protein expression in RAW 264.7 macrophages

NC： 空白對(duì)照組；LPS： 1 μg/mL LPS處理組；DPE: 50 μg/mL DPE處理組；DSE: 50 μg/mL DSE處理組圖5 榴蓮殼提取物對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響Figure 5 Effect of durian shell extract of NF-κB signaling pathway in RAW 264.7 macrophages

3 結(jié)論

基于體外化學(xué)和細(xì)胞炎癥模型，探究了榴蓮殼提取物的總酚、總黃酮含量、抗氧化和抗炎癥活性及其內(nèi)在的分子機(jī)制。結(jié)果表明，榴蓮殼提取物含有豐富的多酚類物質(zhì)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化能力，且能有效抑制NO和ROS的生成，發(fā)揮抗氧化作用，從而減少機(jī)體的氧化損傷。榴蓮殼提取物能在蛋白和基因兩個(gè)層次上顯著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、COX-2等炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮抗炎活性，而其內(nèi)在的分子機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白IκB-α和p65的降解和磷酸化。試驗(yàn)僅初步探討了榴蓮殼提取物的體外抗炎活性及其分子機(jī)制，而有關(guān)其多酚類成分的結(jié)構(gòu)表征，其在體內(nèi)外的吸收代謝規(guī)律及體內(nèi)抗炎機(jī)制值得深入研究。