基于核酸序列依賴性擴增技術(shù)的玉米轉(zhuǎn)基因成分Bar的鑒定

欒鑫超， 張冰琦， 孫笠原， 于麗莉， 侯殿雅， 徐亞維

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院， 吉林 吉林 132101)

隨著轉(zhuǎn)基因玉米的擴大種植，對轉(zhuǎn)基因玉米安全性問題的爭議也越來越大，轉(zhuǎn)基因作物檢測的重視程度越來越高[1,2]。國際食品規(guī)定委員會制定了國際轉(zhuǎn)基因食品的安全準則并且出臺了相關(guān)政策，對轉(zhuǎn)基因成分進行標識，因此，急需一種快速檢測方法滿足玉米產(chǎn)品在種植及貿(mào)易中的監(jiān)控需要。

Bar基因是從鏈霉菌中提取得到的，現(xiàn)已被證實具有良好抗草丁膦(PPT)除草劑的性能。由于其非選擇性、廣譜、無殘留的優(yōu)點被廣泛用于植物轉(zhuǎn)基因的選擇標記，Bar基因也常被作為檢測轉(zhuǎn)基因的靶標元件?，F(xiàn)有檢測方法中，核酸法因其準確快速日益受關(guān)注，如聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)、實時熒光定量PCR和基因芯片等。熒光定量PCR技術(shù)是轉(zhuǎn)基因成分檢測的“金標準”，應(yīng)用最為廣泛。然而熒光定量PCR技術(shù)需高端的儀器、整體反應(yīng)對污染物和抑制劑敏感、以及操作要求較高等，都難以滿足非實驗環(huán)境下現(xiàn)場檢測。基因芯片技術(shù)成本高、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜。檢測外源基因的表達產(chǎn)物常因加工過程中產(chǎn)品喪失抗原性導(dǎo)致無法檢測[3]。核酸法因其準確快速日益受關(guān)注，如聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)、實時熒光定量PCR和基因芯片等；但因需要昂貴的PCR儀及專業(yè)化的操作人員未能得到普及；基因芯片技術(shù)成本高、數(shù)據(jù)分析復(fù)雜。因此，現(xiàn)階段急需一種簡單、快速且高效的診斷方法。核酸序列依賴性擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技術(shù)是一項以RNA為模板的恒溫擴增技術(shù)，并且只具有一對特異性引物，可在體外恒溫下連續(xù)擴增并能實時監(jiān)測擴增情況。該技術(shù)可實現(xiàn)41 ℃、2 h反應(yīng)條件下將模板擴增約1012倍，不需PCR核酸擴增儀和專業(yè)的技術(shù)人員，具有較高的靈敏度及特異性，更易于推廣[4]。

本研究根據(jù)玉米轉(zhuǎn)基因成分Bar的mRNA序列設(shè)計了特異引物和探針，將高效的NASBA和簡便的酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)結(jié)合，從而研發(fā)出高效的NASBA檢測轉(zhuǎn)基因成分Bar的快速檢測試劑盒，在短時間內(nèi)對玉米轉(zhuǎn)基因成分Bar進行高靈敏度篩查，其靈敏度達到5 fg，因其具有快速簡便等優(yōu)點，適合用于檢驗部門及現(xiàn)場檢測，也可用于其它轉(zhuǎn)Bar基因的產(chǎn)品檢測。

1 材料試劑及儀器

1.1 材 料

非轉(zhuǎn)基因玉米取樣于當?shù)靥镩g玉米地；抗草丁膦轉(zhuǎn)基因玉米由東北師范大學(xué)惠贈；轉(zhuǎn)Badh抗旱基因和轉(zhuǎn)Cry抗蟲基因玉米由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。

1.2 主要試劑

T 7 RNA聚合酶、SupeScript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶，購自Invitrogen公司；溶菌酶、Trizol，購自上海生工生物工程股份有限公司；轉(zhuǎn)Bar基因玉米的引物和探針，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 主要儀器

恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-X 100型，哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司)；紫外可見分光光度計(BioSpec-nano，日本島津公司)；酶標儀(680型，美國Bio-Rad公司)。

2 方 法

2.1 特異性引物及探針的設(shè)計

根據(jù)轉(zhuǎn)Bar基因的mRNA序列，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計針對檢測Bar的特異引物和探針，人工合成結(jié)果如下：Bar-F：5′-GATGCAAGGTCGCATATGAG-GCCAAATGTTGAACGATCTGCAGG-3′；Bar-R：5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG-GCACCATCGTCAACCACTACATCG-3′(下劃線為T 7啟動子序列)Bar-P：5′-DIG-AAGTCCAGCTGCCAGAAA-3′(檢測探針，與核酸擴增子序列互補)；生物素化捕獲探針(biotin-ATGCAAGGTCGCATATGAGT)。

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米總RNA的制備

取0.1 g轉(zhuǎn)Bar基因玉米去莖黃化苗液氮冷凍研磨，轉(zhuǎn)入離心管中并加入1 mL RNA裂解液，加入600μL三氯甲烷，4 ℃，12 000 r·min-1離心10～15 min。然后取上清液向其中加入冰異丙醇(比例為1∶1)，離心10～15 min，取沉淀。取一定量預(yù)冷的75%乙醇漂洗3次，風(fēng)干后加50μL DEPC處理的TE溶解[5]。紫外分光光度計測定OD值和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.3 NASBA反應(yīng)體系及反應(yīng)程序

NASBA擴增反應(yīng)液的制備：加入10μL反應(yīng)液、0.5μL總RNA模板及ddH2O補足14μL，65 ℃，反應(yīng)2 min以破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，41 ℃冷卻2 min，再向擴增管中加入5μL酶反應(yīng)液?；旌暇鶆?，41 ℃繼續(xù)反應(yīng)90 min，冰浴2 min終止反應(yīng)，取相同體積的ddH2O做陰性對照[6]。

2.4 NASBA擴增產(chǎn)物ELISA檢測

將0.1 mL、0.012 5 mg·mL-1的鏈霉親和素酶標板包被液加至96孔酶標板中，室溫過夜；再加入等體積的由0.05 mmol·L-1碳酸鹽緩沖液(pH=8.6)及1% BSA Mixed混合而成的封閉液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱持續(xù)反應(yīng)2 h；用PBST Buffer沖洗4～6次，放入4 ℃冰箱中保存[7]。雜交反應(yīng)：將5μL NASBA產(chǎn)物、43μL雜交Buffer和2μL探針Mixed加入到上述酶標板中，上下翻轉(zhuǎn)混勻，41 ℃持續(xù)30 min，TBST Buffer輕柔沖洗4～6次，再加入100 mL AKP標記的帶有Digoxin抗體抗性(1∶5 000稀釋)，室溫持續(xù)30～50 min，TBST Buffer沖洗3～5次。再加入100μL pNPP，遮光(不低于10 min)下顯色反應(yīng)，迅速加入0.1 mL Na2CO3終止，并用酶標儀測定OD405值，當OD值≥0.27時為陽性，OD值<0.27時為陰性[8-10]。

2.5 Bar-NASBA檢測試劑盒的特異性驗證

對轉(zhuǎn)Bar基因玉米葉片、轉(zhuǎn)Badh抗旱基因玉米、轉(zhuǎn)Cry抗蟲基因玉米、普通玉米進行總RNA的提取，然后各取0.5μL RNA模板與10μL NASBA反應(yīng)液混合后，置于65 ℃條件下反應(yīng)2 min后，再將溫度降至41 ℃冷卻2 min；然后迅速向反應(yīng)液中加入5μL E-Mix輕彈混勻，再向其中加入15μL ddH2O，保持41 ℃條件下持續(xù)反應(yīng)90 min，冰浴終止，將產(chǎn)物進行ELISA檢測[5]。

2.6 Bar-NASBA檢測試劑盒的靈敏性驗證

對轉(zhuǎn)Bar基因玉米進行總RNA提取，將初始濃度為600 ng·μL-1的RNA濃度梯度稀釋為60 ng·μL-1、6 ng·μL-1、600 pg·μL-1、60 pg·μL-1、6 pg·μL-1、600 fg·μL-1、60 fg·μL-1、6 fg·μL-1，然后取0.5μL各個濃度模板并與10μL NASBA反應(yīng)液混合，在65 ℃條件下持續(xù)2 min，再將溫度降至41 ℃冷卻2 min；立即加入5μL E-Mix，充分混勻，ddH2O補足20μL，41 ℃持續(xù)90 min，冰浴終止反應(yīng)，ELISA檢測NASBA的擴增產(chǎn)物[6]。

2.7 Bar-NASBA檢測試劑盒樣本檢測

分別提取非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)Bar基因玉米葉片、玉米莖和玉米根總RNA，方法同2.2。并用NASBA擴增反應(yīng)程序和ELISA檢測方法進行檢測，方法同2.3和2.4。

2.8 Bar-NASBA檢測試劑盒穩(wěn)定性和保存期研究

為了對Bar-NASBA試劑盒的最佳保存溫度及有效期進行研究，本實驗將Bar-NASBA試劑盒置于4 ℃、室溫(25 ℃)和37 ℃ 3種溫度條件下(重復(fù)15次試驗)，并對其性能進行樣品特異性試驗及結(jié)果分析。

3 鑒定結(jié)果與分析

3.1 Bar-NASBA檢測試劑盒特異性驗證分析

利用建立的NASBA方法分別對轉(zhuǎn)Bar基因玉米RNA、轉(zhuǎn)Badh抗旱基因玉米RNA，轉(zhuǎn)Cry抗蟲基因玉米RNA、非轉(zhuǎn)基因玉米RNA進行擴增產(chǎn)物的電泳檢測。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)Bar基因玉米出現(xiàn)目的條帶，大小為519 bp，與預(yù)期結(jié)果相符，其余泳道均未出現(xiàn)擴增信號且與陰性對照保持一致，電泳結(jié)果表明該體系可以特異性的鑒別轉(zhuǎn)Bar基因成分(圖1)。

注：M為DL-2 000 Marker；1為轉(zhuǎn)Bar基因玉米葉片；2為轉(zhuǎn)Badh基因玉米；3為轉(zhuǎn)Cry基因玉米；4為非轉(zhuǎn)基因玉米；5為陰性對照。

3.2 Bar-NASBA檢測試劑盒靈敏性驗證分析

為探索檢測體系的最低檢出限，實驗將原濃度為600 ng·μL-1轉(zhuǎn)Bar基因的玉米的RNA做連續(xù)的梯度稀釋，濃度梯度范圍見表1：從1×10-1ng·μL-1至 1×10-8ng·μL-1。對稀釋后的RNA樣品進行NASBA反應(yīng)，NASBA反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果證明，模板濃度稀釋至10-8ng·μL-1時仍能檢出為陽性，說明NASBA在檢出Bar基因的靈敏度可達1.0×10-6ng·μL-1級別，根據(jù)電泳結(jié)果中9號泳道的陰性對照無擴增條帶，可以說明反應(yīng)體系的靈敏度是真實值，而不是由于擴增污染造成的。

表1Bar-NASBA檢測試劑盒靈敏度試驗

檢測濃度/(ng·μL-1)OD450值檢出信號1×10-11.023+1×10-20.945+1×10-30.824+1×10-40.772+1×10-50.703+1×10-60.516+1×10-70.280+1×10-80.278+對照0.213-

注：“+”代表有檢出信號，“-”代表無信號。

電泳結(jié)果也表明，檢測濃度可達到1×10-8ng·μL-1，濃度為1×10-9ng·μL-1時顯示為陰性(結(jié)果未給出)，由此可見，該反應(yīng)體系具有較高的靈敏性可達fg級別，且陰性對照無擴增信號(圖2)。

注：M為DL-2 000 Marker；1為1×10-1ng·μL-1；2為1×10-2ng·μL-1；3為1×10-3ng·μL-1；4為1×10-4ng·μL-1；5為1×10-5ng·μL-1；6為1×10-6ng·μL-1；7為1×10-7ng·μL-1；8為1×10-8ng·μL-1；9為陰性對照。

3.3 Bar-NASBA檢測試劑盒樣本檢測結(jié)果

采用Bar-NASBA試劑盒分別對普通玉米與轉(zhuǎn)Bar玉米取莖葉片、玉米莖和玉米根總RNA檢測，結(jié)果：轉(zhuǎn)Bar基因玉米相關(guān)樣品均顯陽性，表明試劑盒應(yīng)用于轉(zhuǎn)Bar基因的玉米各組織檢測具有較高靈敏度和特異性(圖3)。

注：M為DL-2 000 Marker；1為轉(zhuǎn)Bar玉米去莖葉片；2為轉(zhuǎn)Bar基因玉米莖；3為轉(zhuǎn)Bar基因玉米根；4為普通玉米葉片；5為普通玉米莖；6為普通玉米根；7為陰性對照。

3.4 Bar-NASBA檢測試劑盒的穩(wěn)定性和保存期結(jié)果

由表2可以看出，該試劑盒可在4 ℃下存放1年仍保持較高的敏感性和特異性，在室溫(25 ℃)條件下存放半年后則失去其穩(wěn)定性，而在37 ℃條件下僅可存放1個月。

4 結(jié) 論

本研究將NASBA聯(lián)合ELISA方法應(yīng)用于玉米中Bar基因的檢測，通過優(yōu)化引物和探針使其靈敏度可達到6 fg，是目前常規(guī)電泳檢測法靈敏度的100倍，是RT-PCR消耗成本的1/10，且較常規(guī)PCR法操作更簡單，NASBA法更適合于檢測轉(zhuǎn)Bar基因的轉(zhuǎn)基因玉米樣品。轉(zhuǎn)Bar基因玉米NASBA診斷試劑盒，具有特異性高、靈敏度強且操作方法簡單、快速等優(yōu)勢，可以被廣泛的應(yīng)用于檢驗部門，尤其適合基層部門和采樣現(xiàn)場對Bar轉(zhuǎn)基因成分的早期鑒定。將極大的減少飼料用轉(zhuǎn)基因玉米的比例，切斷通過養(yǎng)殖業(yè)將轉(zhuǎn)基因成分帶入人類食物鏈，同時減少市場上轉(zhuǎn)基因玉米流通的比例[9]。

表2Bar-NASBA檢測試劑盒保存在不同溫度下的性能分析

保存時間/d 4℃室溫(25℃)37℃ 敏感性特異性敏感性特異性 敏感性特異性015/1515/1515/1515/1515/1515/153015/1515/1515/1515/1515/1515/156015/1515/1515/1515/15—15/159015/1515/1515/1515/15——12015/1515/1515/1515/15——18015/1515/1515/1515/15——27015/1515/15————36015/1515/15————540—————