基于清風(fēng)藤屬植物DNA條形碼的葉綠體序列篩選

嚴(yán)福林， 溫 迪， 王 波， 徐文芬， 孫慶文， 魏升華

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 貴陽 550025)

清風(fēng)藤屬(SabiaColebr.)在我國約有16種、5亞種、2變種，主要分布于我國西南部和東南部，以貴州、云南、廣西等西南地區(qū)分布較為廣泛，種類較多。研究表明，我國西南地區(qū)可能是清風(fēng)藤屬植物的分布中心與起源中心[1-4]。據(jù)調(diào)查，清風(fēng)藤屬植物多為藥用，以小花清風(fēng)藤尤甚，藥用較為廣泛，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，具有清熱利膽汁、祛風(fēng)止痛等功效，常用于治療肝炎、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等疾病，為貴州苗族、布依族等少數(shù)民族常用藥[5-7]，以小花清風(fēng)藤為主要原料的龍華清肝沖劑、花梔清肝顆粒、膽炎康膠囊等成方制劑與諸多茶飲等產(chǎn)品均具有較好的產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)與市場前景。諸多研究表明，清風(fēng)藤屬多種植物主要含有黃酮類、生物堿類及三萜類成分[8-10]，具有顯著的抗乙肝病毒、保肝、降酶、抗炎等作用[11-13]。此外，清風(fēng)藤屬植物還具有較好的生態(tài)保護(hù)和園藝觀賞價值，開發(fā)利用前景廣闊。

前期的研究發(fā)現(xiàn)，清風(fēng)藤屬植物花期較短，花瓣易脫落，果實較少，標(biāo)本往往缺乏重要的鑒定器官，給該屬植物和藥材的鑒別帶來了諸多挑戰(zhàn)。目前，該屬植物的鑒別仍然依靠經(jīng)驗豐富的專家鑒定，相關(guān)研究較少[14-16]。因此，探求一種全新的既準(zhǔn)確簡便又行之有效的方法是鑒別該屬植物迫切需要解決的問題。

DNA條形碼技術(shù)具有準(zhǔn)確性高，受到發(fā)育階段和生長環(huán)境的影響小、樣品用量小、快速簡便等優(yōu)點，是近年植物系統(tǒng)與鑒定學(xué)研究的熱點，為小花清風(fēng)藤的鑒定提供了一種行之有效的新思路[17,18]。被子植物葉綠體基因為母系遺傳，具有遺傳保守，變異適中等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于植物的親緣關(guān)系、系統(tǒng)演化、分類鑒定等研究[19]。matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列為國際生命條形碼聯(lián)盟(CBOL)推薦的部分重要的候選序列[20]。本研究選取葉綠體基因matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列，對清風(fēng)藤屬9個物種共48個樣品進(jìn)行DNA條形碼技術(shù)可行性分析，以篩選適合清風(fēng)藤屬鑒別的DNA序列，為清風(fēng)藤屬植物資源的鑒定、保護(hù)與合理開發(fā)利用提供參考。

1 實驗材料

本研究采集到貴州省、云南省、重慶市、臺灣省4個地區(qū)9種清風(fēng)藤屬植物，共計48份樣品。樣品對應(yīng)標(biāo)本均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定，憑證標(biāo)本存于貴州省生藥重點實驗室標(biāo)本室，材料信息詳見表1。

表1 試驗材料信息

種名編號樣品數(shù)采集地點采集時間(年-月-日)小花清風(fēng)藤(S. parviflora)XP1普安縣龍吟鎮(zhèn)2015-10-03XZ5鎮(zhèn)寧縣黃果樹鎮(zhèn)2014-10-06XW5望謨縣種植2016-11-07XX2興義市馬嶺河峽谷2014-10-15四川清風(fēng)藤(S. schumanniana)SS5貴陽市水田鎮(zhèn)2015-07-24云南清風(fēng)藤(S. yunnanensis)YQ5大理市蒼山清碧溪2015-05-17尖葉清風(fēng)藤(S. swinhoei)JZ7貴州省正安縣2015-08-20平伐清風(fēng)藤(S. dielsii)PD5貴州省大方縣2015-07-01鄂西清風(fēng)藤(S. campanulata) subsp. ritchieaeED3獨山縣兔場鎮(zhèn)2015-08-03灰背清風(fēng)藤(S. discolor)HZ7紫云縣猴場鎮(zhèn)2014-09-20阿里山清風(fēng)藤(S. transarisanensia)AT1中國臺灣阿里山2016-04-21簇花清風(fēng)藤(S. fasciculata)DS2獨山縣紫林山2016-08-07

2 實驗方法

2.1 樣品DNA的提取與擴(kuò)增

取硅膠干燥的樣品葉片約20 mg，根據(jù)試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)操作手冊提取樣品總DNA樣本。用于擴(kuò)增的引物(matK、psbK-psbI、psbA-trnH)由上海生工生物工程股份有限公司(上海生工)設(shè)計合成?？侱NA均采用50μL擴(kuò)增(PCR)體系，引物正反序列各2μL、樣品總DNA 2μL、2×Taq PCR MasterMix 24μL、加ddH2O補(bǔ)足50μL。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶單一且清晰的PCR產(chǎn)物送上海生工純化并測序。引物與PCR程序詳情見表2。

表2 引物以及擴(kuò)增程序

條形碼序列引物名稱堿基序列(5'-3')擴(kuò)增程序matKKIM-3FKIM-1RCGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAGACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC94℃,4min;94℃,30s;51℃,40s;72℃,1min;35cycles;72℃,7minpsbK-psbIpsbKpsbITTAGCCTTTGTTTGGCAAGAGAGTTTGAGAGTAAGCAT94℃,4min;94℃,30s;51℃,40s;72℃,1min;35cycles;72℃,7minpsbA-trnHpsbAtrnHGTTATGCATGAACGTAATGCTCCGCGCATGGTGGATTTCACAATCC94℃,5min;94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min;30cycles;72℃,7min

2.2 數(shù)據(jù)分析

測序峰圖使用Codon Code Aligner v 8.0.2軟件(Codon Code Corp，Barnstable，MA，USA，http://www.codoncode.com)進(jìn)行校對拼接，去除引物區(qū)和低質(zhì)量序列。采用MEGA v 5.0[21]軟件進(jìn)行多序列比對，統(tǒng)計分析各序列的堿基組成(GC含量、變異位點、保守位點和信息位點)，基于Kimura 2 Parameter(K-2-P)模型計算種內(nèi)、種間遺傳距離并加以分析，通過繪制各候選片段的Barcodinggap圖，評價各候選序列的種內(nèi)和種間的變異情況[22]。利用SPSS v 22.0(SPSS version 22.0, IBM Corp., USA)中的Wilcoxon秩和檢驗對單一序列的種內(nèi)、種間變異進(jìn)行評價；選用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，相似比對搜索法考察鑒定效率。

3 實驗結(jié)果

3.1 序列特征分析

3條葉綠體基因序列在48份清風(fēng)藤屬植物PCR擴(kuò)增成功率均為100%，序列測序成功率：psbA-trnH與psbK-psbI序列為100%，matK序列為88.10%。matK、psbK-psbI、psbA-trnH序列經(jīng)多序列比對后有效長度分別為820 bp、421 bp、478 bp，GC含量分別為36.5%、36.5%、29.7%，保守位點數(shù)分別為805、404、414個，變異位點數(shù)量分別為14、5、46個，信息位點數(shù)分別為13、4、32個。

3.2 種內(nèi)、種間變異分析

遺傳距離分析結(jié)果顯示，matK序列僅有鄂西清風(fēng)藤的種內(nèi)遺傳距離為0，種內(nèi)遺傳距離小于種間遺傳距離的有：灰背清風(fēng)藤、鄂西清風(fēng)藤與小花清風(fēng)藤，其余種類種內(nèi)遺傳距離大于其種間遺傳距離。psbK-psbI序列小花清風(fēng)藤、平伐清風(fēng)藤、灰背清風(fēng)藤、鄂西清風(fēng)藤種內(nèi)遺傳距離為0；四川清風(fēng)藤與云南清風(fēng)藤種內(nèi)遺傳距離大于其種間遺傳距離。psbA-trnH序列平伐清風(fēng)藤、鄂西清風(fēng)藤種內(nèi)遺傳距離為0，僅有四川清風(fēng)藤種內(nèi)遺傳距離大于其種間遺傳距離。種間和種內(nèi)遺傳距離統(tǒng)計結(jié)果顯示，psbA-trnH的種間遺傳距離最大為0.036 1±0.022 5，psbK-psbI序列種間變最小為0.005 1±0.003 2；種內(nèi)變異大小順序為：psbA-trnH>psbK-psbI>matK?？傮w看，只有psbA-trnH序列種內(nèi)最大變異小于種間最小變異。綜合每條候選序列的種內(nèi)和種間的遺傳距離變異情況，psbA-trnH序列在清風(fēng)藤屬植物中的變異程度較高(表3～表6)。

表3 各候選序列種內(nèi)、種間差異比較

變異類型matKpsbK-psbIpsbA-trnH種內(nèi)變異0.0021±0.00310.0029±0.00210.0126±0.0172平均種內(nèi)變異0.0012±0.00210.0009±0.00130.0068±0.0086種內(nèi)最大變異0.0029±0.00450.0027±0.00390.0022±0.0276種間變異0.0058±0.00390.0051±0.00320.0361±0.0225平均種間變異0.0047±0.00210.0043±0.00180.0309±0.0118種間最小變異0.0008±0.00130.0009±0.00140.0035±0.0052

表4 清風(fēng)藤屬matK序列種內(nèi)和種間平均遺傳距離

物種名稱小花清風(fēng)藤尖葉清風(fēng)藤四川清風(fēng)藤云南清風(fēng)藤平伐清風(fēng)藤灰背清風(fēng)藤鄂西清風(fēng)藤簇花清風(fēng)藤小花清風(fēng)藤0.0010±0.0008尖葉清風(fēng)藤0.0096±0.00270.0074±0.0020四川清風(fēng)藤0.0051±0.00220.0067±0.00190.0025±0.0011云南清風(fēng)藤0.0036±0.00190.0071±0.00210.0017±0.00070.0006±0.0004平伐清風(fēng)藤0.0086±0.00300.0099±0.00280.0057±0.00200.0050±0.00210.0021±0.0007灰背清風(fēng)藤0.0087±0.00310.0103±0.00290.0058±0.00220.0050±0.00220.0012±0.00040.0004±0.0001鄂西清風(fēng)藤0.0033±0.00190.0069±0.00060.0014±0.00060.0003±0.00020.0052±0.00220.0053±0.00240.0000簇花清風(fēng)藤0.0171±0.00150.0042±0.00260.0031±0.00210.0004±0.00100.0024±0.00120.0011±0.00060.0021±0.00110.0000阿里山清風(fēng)藤0.0034±0.00200.0069±0.00060.0014±0.00060.0003±0.00020.0054±0.00230.0054±0.00240.0011±0.00030.0011±0.0003

注：阿里山清風(fēng)藤只有1份樣品。下同。

表5 清風(fēng)藤屬psbK-psbI序列種內(nèi)和種間平均遺傳距離

物種名稱小花清風(fēng)藤尖葉清風(fēng)藤四川清風(fēng)藤云南清風(fēng)藤平伐清風(fēng)藤灰背清風(fēng)藤鄂西清風(fēng)藤小花清風(fēng)藤0.0203±0.0053尖葉清風(fēng)藤0.0360±0.00710.0139±0.0040四川清風(fēng)藤0.0300±0.00640.0557±0.01050.0185±0.0035云南清風(fēng)藤0.0317±0.00650.0500±0.00920.0140±0.00250.0078±0.0022平伐清風(fēng)藤0.0399±0.00830.0619±0.01150.0275±0.00750.0333±0.00780.0000灰背清風(fēng)藤0.0406±0.00840.0627±0.01160.0280±0.00760.0338±0.00790.0004±0.00040.0008±0.0005鄂西清風(fēng)藤0.0279±0.00650.0548±0.01060.0042±0.00120.0104±0.00200.0246±0.00780.0251±0.00860.0000阿里山清風(fēng)藤0.0353±0.00750.0616±0.01110.0116±0.00430.0175±0.00450.0313±0.00780.0323±0.00880.0073±0.0041

表6 清風(fēng)藤屬psbA-trnH序列種內(nèi)和種間平均遺傳距離

物種名稱小花清風(fēng)藤尖葉清風(fēng)藤四川清風(fēng)藤云南清風(fēng)藤平伐清風(fēng)藤灰背清風(fēng)藤鄂西清風(fēng)藤簇花清風(fēng)藤小花清風(fēng)藤0.0000尖葉清風(fēng)藤0.0027±0.00200.0022±0.0015四川清風(fēng)藤0.0036±0.00270.0061±0.00330.0015±0.0012云南清風(fēng)藤0.0033±0.00270.0060±0.00340.0015±0.00100.0009±0.0009平伐清風(fēng)藤0.0054±0.00370.0040±0.00280.0087±0.00450.0088±0.00470.0000灰背清風(fēng)藤0.0054±0.00380.0041±0.00280.0088±0.00460.0089±0.00480.00000.0000鄂西清風(fēng)藤0.0027±0.00260.0053±0.00330.0010±0.00080.0006±0.00060.0081±0.00460.0082±0.00470.0000簇花清風(fēng)藤0.0031±0.00230.0037±0.02100.0059±0.00220.0062±0.00330.0056±0.00610.0091±0.00450.0102±0.00720.0002±0.0001阿里山清風(fēng)藤0.0053±0.00370.0080±0.00420.0036±0.00270.0033±0.00270.0107±0.00520.0109±0.00530.0026±0.00250.0056±0.0011

3.3 候選序列的鑒定效率分析

共有樣本兩兩序列之間遺傳距離的Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果(表7)表明，3條序列種間變異較明顯，均具有統(tǒng)計學(xué)意義，種間鑒定效率順序為：psbK-psbI

3.4 不同序列barcoding gap分析

結(jié)果顯示，3條序列均未形成明顯的“barcoding gap”，psbA-trnH雖然種間、種內(nèi)遺傳距離值存在一定差異，但二者遺傳距離混在一起，沒有形成明顯的間隔，難以區(qū)分。matK和psbK-psbI序列的種間、種內(nèi)遺傳距離值均較小，barcoding gap均集中于0.015以下，未形成barcoding gap，詳見圖1。

表7 兩兩序列種間差異Wilcoxon秩和檢驗

W+W-Relative Rank,N.PvalueResultmatKpsbK-psbIW+=1442,W-=1103,n=2656,p≤0matK>psbK-psbImatKpsbA-trnHW+=227,W-=2512,n=2839,p≤0matK

圖1 3條序列barcoding gap圖

3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

3條候選序列在清風(fēng)藤屬植物的鄰接樹構(gòu)建結(jié)果顯示，matK序列將小花清風(fēng)藤、簇花清風(fēng)藤、尖葉清風(fēng)藤3種分別以85%、91%、66%的自展支持率，各自聚成一支，其余6種未能得到較好區(qū)分，灰背清風(fēng)藤和平伐清風(fēng)藤聚在一起，云南清風(fēng)藤和四川清風(fēng)藤以及鄂西清風(fēng)藤獨立散列一支(圖2 A)。psbK-psbI序列小花清風(fēng)藤散列在大支的一端；灰背清風(fēng)藤和平伐清風(fēng)藤聚在一支，尖葉清風(fēng)藤和簇花清風(fēng)藤聚在一支，云南清風(fēng)藤4個樣品能聚在一支自展支持率為63%，其他清風(fēng)藤屬物種獨立散列在另外一支上，沒有很好區(qū)分(圖2 B)。psbA-trnH序列小花清風(fēng)藤沒有聚為一支，簇花清風(fēng)藤以98%的自展支持率聚在尖葉清風(fēng)藤的小支上，灰背清風(fēng)藤和平伐清風(fēng)藤聚在一起，其他清風(fēng)藤屬物種聚在一支上，未能區(qū)分開(圖2 C)。從3條序列的系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果看，matK序列能夠區(qū)分部分物種，而psbK-psbI和psbA-trnH聚類結(jié)果不理想(圖2)。

注：A為matK；B為psbK-psbI；C為psbA-trnH；Bootstrap 1 000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%。

4 討 論

本研究選取3條葉綠體基因序列對清風(fēng)藤屬植物進(jìn)行DNA條形碼測序分析。結(jié)果顯示，擴(kuò)增成功率均為100%，psbA-trnH、psbK-psbI序列測序成功率均到達(dá)100%，matK測序成功率較低，88.10%，顯示3條序列在清風(fēng)藤屬植物中的通用性較好。3個葉綠體基因序列中，matK序列最長，psbA-trnH序列GC含量最低，但變異位點數(shù)量與信息位點數(shù)最多。清風(fēng)藤屬植物遺傳距離分析結(jié)果顯示，種間變異順序為：psbA-trnH>matK>psbK-psbI；種內(nèi)變異大小順序為：psbA-trnH>psbK-psbI>matK。僅有psbA-trnH序列種內(nèi)最大變異小于種間最小變異。從3條序列的NJ樹聚類結(jié)果看，3條序列均能夠區(qū)分部分物種，matK各種間的聚類結(jié)果較好。

綜上，psbA-trnH、psbK-psbI、matK序列在清風(fēng)藤屬植物中種內(nèi)遺傳變異較大，2種間分化程度較低，變異位點仍然不足，在大部分物種中的鑒別能力較弱，不能實現(xiàn)有效鑒定。因此，均不適合單獨作為清風(fēng)藤屬植物的DNA條形碼序列。在后續(xù)的研究中，建議將matK作為清風(fēng)藤屬植物DNA條形碼輔助序列，結(jié)合ITS、ITS 2等核基因序列，多序列聯(lián)合分析，進(jìn)一步對清風(fēng)藤屬植物的分類鑒定與系統(tǒng)演化進(jìn)行探討，為清風(fēng)藤屬系統(tǒng)分類、種質(zhì)資源的保護(hù)與可持續(xù)開發(fā)利用提供更為科學(xué)合理的理論依據(jù)和參考。