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    高效液相色譜結(jié)合DA方法對3種蟲草的分類研究*

    2020-06-13 06:28:38于興軍許明光李東興
    中國食用菌 2020年4期
    關(guān)鍵詞:鳥苷柞蠶冬蟲夏草

    于興軍,許明光,李東興,吳 杰

    (1.北華大學(xué) 林學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.吉林省樺甸市樺樹林場,吉林 吉林 132414;3.北京首誠農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,北京 102402;4.北京航天農(nóng)業(yè)生物科技有限公司,北京102447)

    冬蟲夏草(Ophiocordyceps sinensis) 隸屬于線中草科(Ophiocordicipitaceae)為冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體[1],是我國傳統(tǒng)名貴中藥,始載于《本草從新》,謂其能保肺,益腎止血,化痰止勞嗽[2]。現(xiàn)代藥理和臨床研究結(jié)果表明,冬蟲夏草具有強心、降血脂、降低膽固醇、調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤等多種藥理活性,對高血壓、冠心病、慢性肝炎、慢性腎炎、支氣管炎以及食道癌、肝癌、自身免疫性疾病等均有較好療效[3]。野生冬蟲夏草因其獨特的生長環(huán)境和近年來的過量采集,使得其產(chǎn)量降低、價格昂貴。據(jù)報道,蛹蟲草(Cordyceps militaris) 與冬蟲夏草的化學(xué)成分與藥理作用相似[4-5],因而人工培育蛹蟲草在近年來被廣泛研究。目前人工培養(yǎng)的蛹蟲草主要有柞蠶蛹蟲草和蛹蟲草子實體2種類型。柞蠶蛹蟲草是人工將蛹蟲草菌接種到活的柞蠶蛹上培養(yǎng)而成,是蛹蟲草子座與菌核兩部分組成的復(fù)合體[6];蛹蟲草子實體是將蛹蟲草菌接種到代料培養(yǎng)基上而培養(yǎng)出的真菌子實體[7]。

    據(jù)報道,蟲草中的主要活性成分為核苷類物質(zhì)[8],包括蟲草素(3’-脫氧腺苷)、腺苷、尿苷、鳥苷、胸苷等,具有廣泛的生理活性,是蟲草品質(zhì)的主要參考指標(biāo)[9-10]。但目前有關(guān)冬蟲夏草及人工蟲草品質(zhì)控制和監(jiān)管的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方法尚未建立,市場上的各類蟲草及其制品的品質(zhì)參差不齊,甚至有不良廠家在各類蟲草制品中以次充好、以假亂真。因此,通過對冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實體利用高效液相色譜對比分析其活性成分差異,結(jié)合判別分析法建立區(qū)分冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實體的方法,為蟲草的品質(zhì)控制及蟲草資源的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。文獻檢索顯示檢測蟲草中主要核苷類活性物質(zhì)的方法以高效液相色譜法最為普遍[11],但未見有用該方法對比分析3種蟲草的蟲草素、腺苷、尿苷、鳥苷、胸苷的報道。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品來源

    12個柞蠶蛹蟲草樣品分別來自于10個蛹蟲草生產(chǎn)廠家,其中吉林2個(YC1~YC2)、遼寧3個(YC3~YC5)、山東 1個 (YC6)、上海 1個 (YC7)、杭州1個(YC8),北京2個廠家各提供2個批次共4個樣品 (YC9~YC12)。

    8個蛹蟲草子實體樣品分別來自于8個蛹蟲草子實體生產(chǎn)廠家,其中遼寧2個(ZST1~ZST2)、內(nèi)蒙 2個 (ZST3~ZST4)、河北 2個 (ZST5~ZST6)、山東1個(ZST7)、廣東1個(ZST8)。

    4個冬蟲夏草樣品來自于青海省玉樹市稱多縣和西藏的巴青縣、索縣的農(nóng)戶(DCXC1~DCXC4)。

    1.1.2 試劑

    蟲草素,純度≥99.0%,購自北京百靈威科技有限公司;腺苷、胸苷、鳥苷、尿苷,純度≥99.0%,購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;甲醇,色譜純,購自北京百靈威科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Mliil-Q型超純水儀,美國MILLI-PORE公司;KQ-500DE超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司;TDL-5-A高速離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;高效液相色譜儀,配DAD檢測器,美國安捷倫科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品準(zhǔn)備

    分別將經(jīng)過預(yù)冷凍的蟲草樣品放入冷凍干燥機內(nèi)處理12 h,取出后粉碎并過60目篩,然后精確稱取過篩后的樣品0.50 g,置于50 mL離心管中,加入20%甲醇25 mL,于30℃、80 kHz條件下超聲提取30 min,提取結(jié)束后將離心管置于20℃、5 000 r·min-1的離心機中離心10 min,吸取上清液2 mL,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后得到樣品溶液,備用。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    分別準(zhǔn)確稱取蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g,置于10 mL容量瓶中,用20%甲醇溶解后定容,搖勻,作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。吸取適量上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液,分別用20%甲醇準(zhǔn)確稀釋成 2.00 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、75.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液[12]。

    1.3.3 色譜分析條件

    色譜柱 (Agilent C18,250.0 mm × 4.6 mm,5.0 μm);流速 1.0 mL·min-1;檢測波長 260 nm;進樣體積20 μL;柱溫30℃。流動相A為超純水,流動相B為甲醇。梯度洗脫順序:0(5%B) →5 min(5%B) →15 min (20%B) →25 min (35%B) →30 min(35%B)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    定性分析:將蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷的混合標(biāo)準(zhǔn)液進行HPLC分析。通過將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜保留時間的比對,確定蟲草樣品中的主要活性成分。并選取3類蟲草HPLC圖譜的共有峰作為蟲草的特征指紋峰。

    定量分析:依據(jù)外標(biāo)法計算3種蟲草中蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷的含量。SPSS軟件DA判別分析計算,首先選取21個樣品(3個冬蟲夏草、11個柞蠶蛹蟲草和7個蛹蟲草子實體) 的13個共有特征指紋峰數(shù)據(jù)作為判別分析樣本集建立判別模型,然后依據(jù)該模型對隨機3個預(yù)留樣品(1個冬蟲夏草、1個柞蠶蛹蟲草和1個蛹蟲草子實體)進行DA預(yù)測判斷試驗,以驗證該方法的準(zhǔn)確性?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 流動相及梯度洗脫程序的優(yōu)化

    冬蟲夏草及柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實體所含化學(xué)成分復(fù)雜,且各種類型的化合物的極性差別較大[13]。進行等梯度甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng),以及不同梯度的甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)洗脫,結(jié)果表明選擇水(A)-甲醇(B)為流動相,洗脫程序為0(5%B) → 5 min (5%B) → 15 min (20%B) → 25 min(35%B) →30 min(35%B) 時,在30 min可以使色譜峰全部洗出,且分離較好,故選擇該流動相系統(tǒng)及洗脫方式作為色譜條件。

    2.2 蟲草樣品的活性成分

    冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實體中主要活性成分含量見表1。

    表1 3種蟲草中主要活性成分含量Tab.1 Contents of main active components in three kinds of Cordyceps spp.

    表1結(jié)果表明,柞蠶蛹蟲草中核苷類含量蟲草素>腺苷>鳥苷>胸苷,尿苷含量低于其檢測限值;蛹蟲草子實體中核苷類含量蟲草素>腺苷>胸苷,尿苷和鳥苷含量均低于其檢測限值;冬蟲夏草只含有一定量的尿苷、鳥苷和腺苷,不含蟲草素??梢钥闯?,柞蠶蛹蟲草中的核苷類成分組成及總含量均優(yōu)于冬蟲夏草和蛹蟲草子實體,并且其中腺苷和蟲草素是3種蟲草中含量較高的核苷類成分,而無論是按腺苷還是按蟲草素含量排序,順序均為柞蠶蛹蟲草>蛹蟲草子實體>冬蟲夏草。

    2.3 蟲草指紋圖譜分析

    選取各個蟲草樣品HPLC圖譜中的13個共有峰作為3種蟲草的特征指紋峰,詳見表2。

    隨機選取 3個預(yù)留樣品 (DCXC1、YC5和ZST7),其余21個樣品作為DA分析樣本庫,進行DA典型判別分析計算,得到3種蟲草的DA判別分析模型,結(jié)果見圖2。

    由圖2可以看出,不同類別的蟲草所含的活性物質(zhì)構(gòu)成和含量有所差異,因此根據(jù)這種差異,可以將相同類別的蟲草樣品顯著地聚在一起,而將不同類別的蟲草區(qū)分開。此外,冬蟲夏草與其他兩類蟲草區(qū)分明顯,這可能是因為冬蟲夏草的活性成分構(gòu)成及含量與柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實體均有較大差異。

    2.4 模型驗證

    用2.3建立的判別模型對預(yù)留的隨機選取的3個蟲草樣品(冬蟲夏草DCXC1、柞蠶蛹蟲草YC5和蛹蟲草子實體ZST7)進行DA預(yù)測判斷,結(jié)果見圖3,其交叉驗證結(jié)果見表3。

    表2 3種蟲草24個樣品的特征峰值Tab.2 Characteristic peaks of 24 samples in three kinds of Cordyceps spp.

    由圖3可以看出,預(yù)留的隨機選取的3個蟲草樣品判別分析結(jié)果分別都落在對應(yīng)的本類別的判定區(qū)域中。從表3交叉驗證結(jié)果可以看出,該DA判別分析模型具有良好的分類性能和較高的預(yù)測精度,說明該方法可以有效的進行這三種蟲草的預(yù)測判別。

    3 結(jié)論

    通過高效液相色譜法分析冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實體中的主要核苷類活性成分和13個共有特征峰,并依據(jù)特征峰值,利用SPSS軟件對其進行DA判別分析。結(jié)果表明,該方法能有效地將這三類蟲草區(qū)分在不同區(qū)域,形成各自的聚集區(qū),區(qū)分效果良好,并且對于預(yù)留的隨機抽取的冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和蛹蟲草子實體樣品的預(yù)測判別準(zhǔn)確性較高,該方法可以作為3種蟲草及其制品的鑒別和質(zhì)量監(jiān)測的有效方法。

    表3 3個蟲草樣品判別結(jié)果Tab.3 Discriminating results of three Cordyceps spp.samples

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