克氏原螯蝦螺原體病原的發(fā)現(xiàn)及診斷研究

童心雨

摘? 要：作為一種原核微生物，螺原體個(gè)體微小、形態(tài)多為螺旋狀且不含細(xì)胞壁，大多存在于植物、昆蟲(chóng)中。近些年發(fā)現(xiàn)一種新型螺原體，會(huì)造成中華絨螯蟹的“顫抖病”，且對(duì)其他水生甲殼動(dòng)物都表現(xiàn)出廣泛的侵染性，如克氏原螯蝦。于此，尋找一種反應(yīng)靈敏的定量方法防治中華絨螯蟹“顫抖病”成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。明確螺原體在克氏原螯蝦體內(nèi)的增殖規(guī)律，能夠完善水生甲殼動(dòng)物螺原體疾病的監(jiān)管，也將有助于其他淡水甲殼類動(dòng)物螺原體流行病學(xué)的研究。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦;螺原體;增殖規(guī)律

中圖分類號(hào)：S945.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2020）17-0083-02

Abstract： As a prokaryotic microorganism， spiroplasma is small， spiral in shape and does not contain cell wall， and mostly exists in plants and insects. In recent years， a new type of spiroplasma has been found， which can cause "trembling disease" of Chinese mitten crab and show extensive infection to other aquatic crustaceans， such as Procambarus clarkii. Therefore， to find a sensitive quantitative method to control tremor disease of Eriocheir sinensis has become the current research focus. Understanding the proliferation rule of spiroplasma in Procambarus clarkii can improve the supervision of spiroplasma diseases in aquatic crustaceans and will also contribute to the epidemiological study of spiroplasma in other freshwater crustaceans.

Keywords： procambarus clarkii; spiroplasma; proliferation rule

1 克氏原螯蝦的發(fā)展現(xiàn)狀

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），俗稱小龍蝦，在分類上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda），甲殼綱（Crustacea），十足目（Decapoda），螯蝦科（Cambaridae），原螯蝦屬（Procambarus）。原產(chǎn)于墨西哥東北部和北美中南部[1]，后由日本引進(jìn)，20世紀(jì)30年代正式傳入我國(guó)。作為一個(gè)抗逆性極強(qiáng)的水生物種，自然環(huán)境下，克氏原螯蝦能夠適應(yīng)10℃乃至30℃的溫度條件，甚至可以忍受零下或高溫;它們通常棲息于淡水水域之中，也能適應(yīng)微鹽水域。正是由于這種極強(qiáng)的生命力、寬泛的適應(yīng)力和旺盛的繁殖力，克氏原螯蝦在世界各地?cái)U(kuò)散，而且一旦被引入，便會(huì)成為當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境里的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)種群。

極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值同樣促使克氏原螯蝦擴(kuò)散。由于其體型大過(guò)許多淡水蝦類，肉質(zhì)也較為肥美，克氏原螯蝦占據(jù)著世界性淡水經(jīng)濟(jì)蝦類的巨頭地位。同時(shí)，它作為一種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)資源物，經(jīng)濟(jì)效益極高、產(chǎn)業(yè)化前景矚目且發(fā)展迅速，近些年來(lái)，在國(guó)內(nèi)掀起了養(yǎng)殖熱潮，大量分布在我國(guó)江蘇、安徽、湖北等長(zhǎng)江中下游地區(qū)[2]，已成為最有潛力、最具特色的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。

不可忽視的是，克氏原螯蝦的雜食性和資源競(jìng)爭(zhēng)等機(jī)制正嚴(yán)重威脅著引入地的生物多樣性。我國(guó)需要合理控制小龍蝦的生產(chǎn)量，開(kāi)展相關(guān)生態(tài)危害調(diào)查研究，避免其成為危險(xiǎn)入侵物種。

2 螺原體的研究近況

作為一類特殊微生物，螺原體（Spiroplasma）個(gè)體極小、不含細(xì)胞壁、形態(tài)多變（尤其在指數(shù)生長(zhǎng)期呈典型的螺旋絲狀）且具有運(yùn)動(dòng)性，它能通過(guò)220nm的微孔濾膜，是能在人工培養(yǎng)基中培養(yǎng)的最小的單細(xì)胞原核微生物。

2.1 螺原體的分類

螺原體在分類上隸屬柔膜體綱（Mollicutes）、蟲(chóng)原體目（Entomoplasmatales）、螺原體科（Spiroplasmataceae）、螺原體屬（Spiroplasma）。直到上世紀(jì)70年代，人們發(fā)現(xiàn)它是引起植物、昆蟲(chóng)某些病害的禍?zhǔn)祝Ｊ氐囊詾槁菰w只寄生在植物、昆蟲(chóng)兩大類之中。之后，科學(xué)家們陸續(xù)從水生甲殼類動(dòng)物體內(nèi)也分離得到螺原體類微生物。在植物中，螺原體會(huì)引起玉米矮縮?。╟orn stunt）等病癥，在蜜蜂體內(nèi)可導(dǎo)致爬蜂病、五月病等，在水生甲殼動(dòng)物體內(nèi)則會(huì)引起蝦蟹的“顫抖病”（tremor disease）。可見(jiàn)，大多數(shù)螺原體表現(xiàn)出嚴(yán)重的致病性，對(duì)各種養(yǎng)殖業(yè)均造成惡劣影響。

國(guó)際原核生物分類委員會(huì)在2004年曾提出螺原體多相分類（polyphasic taxonomy）的概念，通過(guò)表型（形態(tài)特征、生理學(xué)特征，生物化學(xué)特性）、基因型（GC含量、rDNA序列同源性、指紋圖譜分析等）及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)等信息，確定分離物和已鑒定菌株之間的關(guān)系，達(dá)到區(qū)分親緣關(guān)系較近菌株的目的。螺原體依據(jù)血清學(xué)特性被分為43個(gè)血清組，其中包含15個(gè)血清亞組，共確立了50個(gè)以上的螺原體物種。然而，目前以血清學(xué)分析為基礎(chǔ)的螺原體分類仍存在一些爭(zhēng)議。

自從蝦蟹螺原體被發(fā)現(xiàn)，其分布范圍以及宿主范圍便由陸地?cái)U(kuò)大到了水域。同時(shí)，螺原體對(duì)水生甲殼動(dòng)物表現(xiàn)出的侵染性也引起了大家的關(guān)注。

2.2 螺原體生物學(xué)特性

（1）螺原體在形態(tài)結(jié)構(gòu)上，沒(méi)有細(xì)胞壁，呈螺旋形態(tài)。缺少細(xì)胞壁是螺原體區(qū)別于其他原核生物最重要的一點(diǎn)，而其獨(dú)特的三明治狀單位膜，使其具有螺旋形、可濾過(guò)性、可塑性甚至對(duì)某些干擾細(xì)胞壁形成的抗生素類藥物產(chǎn)生天然抵抗性。這些獨(dú)特性都使螺原體成為當(dāng)前生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

（2）在基因組組成上，螺原體的基因組是環(huán)狀雙鏈

DNA，但比絕大多數(shù)的原核生物要小;且堿基組成GC含量很低。通常作為終止密碼子的UGA在螺原體中編碼色氨酸，因此只有通過(guò)突變才能正常表達(dá)出目的蛋白。

（3）在代謝水平上，因?yàn)橄鄬?duì)較小的基因組，螺原體只能編碼出較少的蛋白質(zhì)，同時(shí)缺少能量代謝中必須的眾多基因，無(wú)論是合成生物方面還是代謝水平，自然十分低緩。故螺原體難以適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境，倘若實(shí)驗(yàn)室要純培養(yǎng)螺原體，配置的培養(yǎng)基應(yīng)加入固醇類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

3 蝦蟹內(nèi)螺原體的診斷方法

3.1 光鏡快速診斷法

光鏡快速診斷法針對(duì)螺原體進(jìn)入血淋巴細(xì)胞后形成包涵體的特性，無(wú)需染色，直接觀察血涂片便可快速準(zhǔn)確找到受病原體感染的血細(xì)胞。這種簡(jiǎn)易快速的蝦蟹活體血淋巴光鏡檢測(cè)方法，只需抽取微量血液即可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)健康和感染的蝦蟹活體。光鏡法也為之后的分子生物學(xué)和免疫學(xué)等其他方法奠定了檢驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)法

采用Chelex-100試劑對(duì)底泥進(jìn)行提取，將純培養(yǎng)的病原菌和待檢測(cè)組織中的模板DNA（寄主肌肉、內(nèi)臟組織、血液等）分離，該方法甚至能檢測(cè)出底泥里的微量病原菌。將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原菌分離稀釋成特定的不同濃度梯度，使用同種方法擴(kuò)增后再次檢測(cè)，通過(guò)比較檢測(cè)樣品和已知濃度的純培養(yǎng)物PCR產(chǎn)物條帶亮度，運(yùn)用軟件將條帶明暗差異轉(zhuǎn)換成數(shù)字差異，能夠分析出樣品中螺原體的濃度相對(duì)含量。該方法較之常規(guī)PCR手段，既靈敏快速又簡(jiǎn)單廉價(jià)，能夠大批量檢測(cè)蝦蟹螺原體感染，進(jìn)一步判斷患病蝦蟹的受感染程度。

3.3 螺原體的微生物學(xué)培養(yǎng)及電鏡檢測(cè)法

由于螺原體能夠生長(zhǎng)在M1D或R2特殊培養(yǎng)基中，碾壓磨碎患病蝦蟹組織后，濾過(guò)220nm的微孔濾膜，再接種到含有酚紅的培養(yǎng)基中，3到5天后后若培養(yǎng)基從粉紅色變?yōu)殚冱S色，則表明這些患病蝦蟹體內(nèi)存在螺原體病原。電鏡負(fù)染觀察培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，能夠找到螺原體呈典型螺旋結(jié)構(gòu)，從而準(zhǔn)確診斷螺原體病原。

3.4 ELISA檢測(cè)法及快速診斷試劑盒法

螺原體侵染蝦蟹體內(nèi)血淋巴后即擴(kuò)散，此時(shí)采集微量血淋巴，通過(guò)傳統(tǒng)間接ELISA方法進(jìn)行有效檢測(cè)。一種新型ELISA檢測(cè)試劑盒靈敏度達(dá)0.573μg/mL，無(wú)論批內(nèi)變異系數(shù)還是批間變異系數(shù)均低于10%，因此具備良好的穩(wěn)定性。2到3小時(shí)內(nèi)即可有效測(cè)出侵染“顫抖病”蝦蟹體內(nèi)的病原，提前診斷出螺原體的侵染情況。

4 克氏原螯蝦體內(nèi)的螺原體病原監(jiān)測(cè)

由于螺原體疾病的爆發(fā)，小龍蝦產(chǎn)業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。以往認(rèn)知中，螺原體疾病普遍存在于植物和昆蟲(chóng)之中，2004年首次發(fā)現(xiàn)它也是中華絨螯蟹“顫抖病”的病原體。除此之外，這種病原體在克氏原螯蝦、羅氏蝦和海水南美白對(duì)蝦等其他甲殼類水生生物體內(nèi)也表現(xiàn)出明顯的擴(kuò)散性。從患病小龍蝦體內(nèi)分離出不同的螺原體，染色后發(fā)現(xiàn)與其他淡水甲殼綱動(dòng)物（蟹螺原體、草蝦螺原體）體內(nèi)的螺原體是相同的物種，從此被正式命名為Spiroplasma eriocheiri。診斷法和流行病學(xué)調(diào)查法在螺原體疾病的控制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如何高效的控制住螺原體疾病已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)甲殼綱動(dòng)物可持續(xù)生產(chǎn)的重中之重。

目前在甲殼綱動(dòng)物螺原體的監(jiān)控、檢測(cè)和診斷方面主要有臨床癥狀法、直射光顯微鏡法、組織病理學(xué)、原位雜交和常規(guī)PCR技術(shù)。然而，這些所有的實(shí)驗(yàn)方法都沒(méi)有辦法量化受感染組織的病原體。如何測(cè)定出病原體的增殖已然是甲殼動(dòng)物疾病監(jiān)控中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，特別是在無(wú)病癥個(gè)體的病原體檢測(cè)方面，以便特定的無(wú)病原部分的生長(zhǎng)，并做到小龍蝦兩地運(yùn)輸?shù)谋O(jiān)控。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被廣泛運(yùn)用，其中最常用的兩種檢測(cè)方法是Taqman探針?lè)ê蚐YBR Green染色法。越來(lái)越多的研究人員偏向使用更簡(jiǎn)單廉價(jià)的SYBR Green染色法來(lái)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR研究。

5 結(jié)束語(yǔ)

小龍蝦作為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)巨頭，近幾年來(lái)遭受著螺原體“顫抖病”的威脅，不僅在經(jīng)濟(jì)上形成了嚴(yán)重?fù)p失，也阻礙了以克氏原螯蝦為代表的的水生甲殼類動(dòng)物的可持續(xù)生產(chǎn)。因此迫切需要控制住該類螺原體疾病。在全球范圍內(nèi)，通過(guò)積極開(kāi)展該病原在生物學(xué)特性及致病機(jī)理方面的研究，建立一個(gè)能夠快速診斷并進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的綜合防治技術(shù)，也將有助于進(jìn)一步在其他淡水甲殼類動(dòng)物中進(jìn)行螺原體流行病學(xué)的研究。

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