糖尿病小鼠腎組織中細胞焦亡發(fā)生的現(xiàn)象研究*

周興艷，李華，柳茜，羅欣月，陳燁，朱春玲，嚴瑞

(貴州醫(yī)科大學附院 腎臟內(nèi)科，貴州 貴陽 550004)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最嚴重的微血管并發(fā)癥，也是導致終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥是促進DN進展的重要危險因素[2-3]。細胞焦亡，是一種可由半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)介導的炎性程序性溶解性細胞死亡，而Gasdermin家族成員GSDMD是引起細胞焦亡發(fā)生的最終執(zhí)行者，細胞焦亡的發(fā)生與炎癥反應密切相關(guān)[4-5]。本研究以DM小鼠為研究對象，觀察Caspase-1及細胞焦亡關(guān)鍵蛋白GSDMD及其mRNA表達變化，為探索糖尿病腎病細胞焦亡和炎癥反應的機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

SPF級C57BL/6J小鼠(雄性)，體質(zhì)量(18±1.2)g【斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0002】；鏈脲佐菌素(STZ，美國，Sigma公司)、血糖儀及血糖試紙(上海魚躍生物技術(shù)有限公司)、預染Marker(Thermo Scientific公司)、rabbit-anti-β-actin(博奧森生物技術(shù)有限公司)、rabbit-anti-caspase-1(Proteintech公司)、rabbit-anti-GSDMD(Abcam公司)、HRP標記的山羊抗兔IgG(普美生物技術(shù)有限公司)。BCA蛋白濃度測定試劑盒、HE及Masson染色試劑盒(北京索萊寶公司)，總 RNA提取試劑盒(天根生化科技公司)、引物合成 (Thermo Scientific公司)、Real Time-PCR試劑盒(Takara公司)以及生化指標由成都里來生物技術(shù)有限公司提供技術(shù)支持。

1.2 方法

1.2.1分組及DM小鼠模型復制 將6～8周齡的C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組(NC組)和糖尿病小鼠模型組(DM組)，每組6只。將DM組小鼠禁食(不禁飲)3～4 h，以1%鏈脲佐菌素(STZ)按55 mg/kg劑量(檸檬酸鈉緩沖液配制)腹腔注射，正常組小鼠以等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，連續(xù)注射5 d，造模結(jié)束72 h后測定DM組小鼠空腹尾靜脈末梢血糖均>16.7 mmol/L，造模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)16周。

1.2.2生化指標測定及腎臟組織觀察 將NC組和DM組飼養(yǎng)16周后乙醚麻醉處死，眼球取血離心后取上清檢測血糖及血肌酐；經(jīng)小鼠左心室予4 ℃預冷的0.9%生理鹽水灌洗腎臟，取一側(cè)腎臟組織存于1.5 mL離心管中凍存-80 ℃冰箱備用，另一側(cè)腎臟組織立即放入4%多聚甲醛中固定、制成3 μm厚的石蠟切片,行HE和Masson染色進行病理學觀察，并拍攝圖片。

1.2.3檢測Caspase-1、GSDMD蛋白表達 Western blot法檢測Caspase-1、GSDMD的蛋白表達，取小鼠腎皮質(zhì)部分加入組織蛋白裂解液后組織勻漿，離心后取上清，按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度；各組蛋白上清加入5×蛋白上樣緩沖液加熱變性后加至SDS-PAGE凝膠中，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉后，分別用對應一抗β-actin(1 ∶6 000)、Caspase-1(1 ∶1 000)、GSDMD(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)，室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜3次，應用ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影拍照，重復3次以上，進行統(tǒng)計分析。

1.2.4檢測Caspase-1、GSDMDmRNA的表達 Real Time-PCR法檢測Caspase-1、GSDMD的mRNA表達。應用Trizol法提取小鼠腎組織的總RNA并測定其濃度，步驟參照試劑盒說明書；選取20 μL作為反轉(zhuǎn)錄的反應體系合成模板cDNA，應用Thermo Scientific公司提供的PCR引物，采用SYBR premix Ex TaqII進行熒光定量PCR。目的基因引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Tab.1 The sequences of the primers in real time PCR

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 生化指標測定

與NC組比較，DM組小鼠血糖水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；且在DM組小鼠腎功能指標血肌酐水平較NC組增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示造模成功，見表2。

表2 兩組小鼠血糖、血肌酐水平Tab.2 Levels of blood glucose and plasma creatinine in the two

注：與NC組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05。

2.2 小鼠腎組織變化

光鏡下，HE染色可見NC組小鼠腎小球形態(tài)完整，結(jié)構(gòu)清晰，腎小管未見明顯擴張、變性及壞死，基底膜完整；DM組小鼠見腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增生，部分腎小管上皮細胞完整性被破壞，可見細胞腫脹、空泡變性(圖1A)。Masson染色下顯示，NC組小鼠腎小球基底與系膜區(qū)未見膠原沉積，腎小管間質(zhì)區(qū)未見膠原增多；DM組小鼠腎組織中可見部分腎小管管腔擴張，腎小管基底膜增厚，腎小球內(nèi)可見大量被染成藍紫色條索狀的膠原纖維沉積(圖1B)。

注：A為HE染色，B為Masson染色。圖1 NC組和DM組小鼠腎組織變化(HE和Masson染色)Fig.1 Histological changes of kidney tissues mouse in two groups (HE and Masson)

2.3 腎組織中Caspase-1和GSDMD的蛋白表達

與NC組相比，DM組小鼠腎臟組織中Caspase-1及GSDMD蛋白表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。圖2 NC和DM組小鼠腎組織中Caspase-1及GSDMD蛋白的表達(Western blot)Fig.2 The protein expression of Caspase-1 and GSDMD in kidney tissues of normal controls and diabetic groups(Western blot)

2.4 腎組織中Caspase-1和GSDMDmRNA表達

與NC組相比，DM組小鼠腎臟組織中Caspase-1和GSDMDmRNA的表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,n=6)，見圖3。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。圖3 腎組織中Caspase-1和GSDMD mRNA表達(Real Time PCR)Fig.3 The mRNA expression of Caspase-1 and GSDMD in kidney tissues in two groups(Real Time PCR)

3 討論

DN逐漸成為我國終末期腎臟病患者的主要病因之一，其防治機制的研究一直以來備受關(guān)注[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠在STZ誘導下發(fā)生血糖增高，長時間高血糖狀態(tài)，DM小鼠逐漸出現(xiàn)腎臟損傷，其病理表現(xiàn)為小鼠腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增生及膠原纖維沉積，部分腎小管上皮細胞完整性被破壞，可見細胞腫脹、空泡變性，這與既往研究結(jié)果類似[6]，可見持續(xù)高血糖狀態(tài)是引起DN發(fā)生的因素之一。而近年研究表明，慢性炎癥逐漸成為促進DN進展的主要因素之一，并發(fā)現(xiàn)抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)/Caspase-1/白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)通路可改善糖尿病腎損傷，這可能是一種預防DN進展的潛在治療策略[7]，但目前針對糖尿病腎病炎癥反應的發(fā)生機制尚未完全闡明，故對其發(fā)生的防治缺乏相對有效的治療手段。因此，探索DN炎癥反應的發(fā)生機制，將為DN的防治研究提供作用靶點奠定一定的實驗基礎。

細胞焦亡是由炎性Caspases如人同源性和鼠同源性Caspase-1、人同源性Caspase-4 及 Caspase-5或鼠同源性Caspase-11激活的炎性程序性細胞死亡方式，而具有“膜孔形成效應”的Gasdermin家族成員GSDMD是引起細胞焦亡發(fā)生的底物蛋白[4-5]。而細胞焦亡的發(fā)生形式可分為經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑兩種類型：由炎癥小體激活的人同源性和鼠同源性Caspase-1介導的細胞死亡為經(jīng)典途徑細胞焦亡，由人同源性Caspase-4、Caspase-5或鼠同源性Caspase-11直接介導的細胞死亡稱為非經(jīng)典途徑細胞焦亡[8]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡的發(fā)生涉及細胞膜破裂、細胞質(zhì)內(nèi)容物如炎癥細胞因子的釋放，進而引起細胞周圍炎癥級聯(lián)反應，作為炎性Caspases的底物蛋白GSDMD是引起這一過程發(fā)生的必需基因[8-10]。目前針對DN細胞焦亡和炎癥反應的機制研究尚不完全清楚。目前針對細胞焦亡是否能作為DN炎癥反應防治的突破點也鮮有研究報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，在DM小鼠腎組織中活性Caspase-1的蛋白及mRNA表達增高，這一結(jié)果與既往研究結(jié)果類似：活性Caspase-1是促炎性細胞因子分泌、細胞焦亡、炎癥介導免疫所必需的，Caspase-1蛋白前體(protein precursor-caspase-1,Pro-caspase-1)是炎癥小體的重要組成部分，由炎癥小體激活Pro-caspase-1進一步裂解產(chǎn)生的活性Caspase-1可分解促炎性細胞因子如IL--1β和IL--18的蛋白前體，產(chǎn)生并控制成熟炎癥細胞因子的分泌和介導一種稱為細胞焦亡的炎性細胞死亡[11]。Shahzad等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病小鼠(db/db小鼠)模型及高糖誘導的足細胞中，檢測到Caspase-1的表達高于凋亡標記物(Caspase-3、Caspase-7、PARP1)的表達水平，Caspase-1依賴性炎癥小體激活可促進DN發(fā)生發(fā)展，小分子靶向Caspase-1或炎癥小體活化可能是DN的一種可行的治療途徑。高糖誘導大鼠腎小球系膜細胞可發(fā)生細胞增殖、氧化應激和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積，且發(fā)現(xiàn)Caspase-1的表達水平增高，紅景天苷(salidroside,SAL)是玫瑰紅景天中的主要成分，對DN有保護作用，可抑制硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)的表達，從而可抑制Caspase-1參與的NLRP3炎癥小體活化，進而抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖、氧化應激和減輕ECM沉積[13]。而腎小管間質(zhì)炎癥在DN的進展中起關(guān)鍵作用，Optineurin(OPTN)的表達減少可促進DN病程進展；過表達OPTN的鼠腎小管上皮細胞中NLRP3表達明顯降低，且抑制Caspase-1和IL-1β的裂解以及炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放，顯著增加了腎小管上皮細胞中微管相關(guān)蛋白1A / 1B-輕鏈3-II和線粒體外膜20的轉(zhuǎn)位酶的共配作用，進而表明OPTN通過增強線粒體吞噬作用，抑制Caspase-1活化，減輕腎小管間質(zhì)炎癥反應[14]。姜黃素作為一種有效的抗纖維化劑，可抑制DN小鼠腎組織和高糖誘導的HK-2細胞中膠原IV、纖連蛋白、Caspase-1和NLRP3的表達，減輕腎小球肥大、腎小球系膜基質(zhì)增生，降低蛋白尿的排泄[15]。A1腺苷受體(A1 adenosine receptor,A1AR)通過抑制DN中與細胞焦亡相關(guān)的Caspase-1 / IL-18信號傳導，在近端腎小管巨蛋白丟失相關(guān)蛋白尿中起保護作用[16]。以上研究表明，活性Caspase-1介導的炎癥反應和細胞焦亡可促進DN的發(fā)生發(fā)展。

同時，本次研究中發(fā)現(xiàn)DM小鼠腎組織中GSDMD蛋白及mRNA表達增高。已有研究報道，細胞焦亡不僅可發(fā)生在固有免疫細胞中，而且在腎臟實質(zhì)細胞中也可出現(xiàn)，與腫瘤、免疫反應和炎癥反應密切相關(guān)[17-19]。既往研究顯示，GSDMD是細胞焦亡和分泌促炎性細胞因子的關(guān)鍵蛋白[20]。在髓系細胞或巨噬細胞中抑制GSDMD活性可抑制細胞焦亡及促炎性細胞因子的釋放[21-22]。高糖誘導的腎小球內(nèi)皮細胞中Caspase-1和GSDMD的表達增高，丁酸鈉可通過Caspase-1/GSDMD途徑抑制細胞焦亡和促炎性因子的釋放[23]。有研究報道，lncRNA可通過改變miRNA的表達來改善DN，lncRNA-GAS5過表達通過下調(diào)miR-452-5p的表達來抑制HG誘導的腎小管上皮細胞的炎癥反應、氧化應激和細胞焦亡[24]。結(jié)合既往研究結(jié)果，提示GSDMD介導的細胞焦亡可促進高葡萄糖狀態(tài)下腎臟實質(zhì)細胞的損傷，但細胞焦亡在DN中的發(fā)生機制仍未完全闡明。

綜上，推測DM小鼠腎組織中可能發(fā)生活性Caspase-1介導關(guān)鍵蛋白GSDMD激活引起的細胞焦亡。本次研究為DN病細胞焦亡和炎癥反應的發(fā)生機制研究提供初步實驗依據(jù)，而細胞焦亡在DN實質(zhì)細胞中的具體發(fā)生機制及調(diào)控機制需要進一步實驗進行探索，對指導DN的防治具有一定意義。