α-硫辛酸對缺血再灌注誘導的PC12細胞應激性凋亡抑制作用的研究*

謝鵬, 任真奎, 呂菊, 胡玉梅, 吳昌學*, 禹文峰*

(1.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗科，貴州 興義 562400)

缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的主要病因，研究表明，缺血再灌注導致的細胞損傷可能是由于缺血和再灌注階段引起的神經(jīng)炎癥、氧化應激、過度自噬激活、細胞能量耗竭和氨基酸興奮性中毒等原因造成的[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是機體內(nèi)重要的細胞器，負責細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等的生物合成、折疊修飾以及運輸?shù)萚3]，蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的合成和正確折疊對細胞的存活以及蛋白質(zhì)發(fā)揮正確功能是至關(guān)重要的。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)被打破時，會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，也稱折疊蛋白反應，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)的作用進而促進細胞的生存[4]。研究表明，缺血再灌注會觸發(fā)機體細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，但持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應會誘導細胞凋亡[5-6]。因此，以缺血再灌注導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激為腦卒中的治療靶點的研究受到越來越多的關(guān)注。α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)是一個短鏈脂肪酸，是機體內(nèi)諸多重要酶的輔助因子，也是萬能的抗氧化劑，參與了很多細胞內(nèi)的重要代謝過程[7-8]。有研究報道，α-LA在MCAO大鼠模型上通過mTOR信號通路降低大腦的缺血再灌注損傷[9]，在人的肝移植研究中發(fā)現(xiàn)α-LA可以改善肝移植的再灌注后綜合征[10]?？梢姡?LA在缺血再灌注損傷中發(fā)揮著有效的保護作用，其深入的分子機制理論需要更多的證據(jù)支持。因此，本研究利用體外氧糖剝奪/再灌注(OGD/R)的大鼠腎上腺嗜鉻神經(jīng)瘤細胞(PC12細胞)模型，探討缺血再灌注誘導細胞損傷的分子機制以及α-LA對缺血再灌注細胞模型的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

PC12細胞系購買自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰酶消化液購至美國Gibco公司，1×磷酸鹽緩沖液(1×PBS)購至以色列Biological Industries，蛋白酶抑制劑(PMSF)、兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、兔抗裂解型胱天蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)和抗兔二抗購至美國CST，環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)購至Absion，兔抗B淋巴細胞瘤-2相關(guān)X (Bax)購至美國Abcam，細胞活性檢測試劑盒-8(CCK-8試劑盒)購至日本同仁，ECL-Plus化學發(fā)光液和PVDF膜購買至美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1PC12細胞培養(yǎng)及缺血再灌注模型建立 高分化的PC12細胞用1%雙抗+10%FBS +89%DMEM培養(yǎng)基配方進行培養(yǎng)，長至80%～90%密度時進行傳代培養(yǎng)。以每孔2×105的細胞密度接種在六孔板內(nèi)，當細胞密度達到70%時進行缺血再灌注模型建立。合適密度的細胞吸棄原培養(yǎng)基，預冷PBS洗細胞兩遍后加無糖培養(yǎng)基(不含血清)2 mL，置于三氣培養(yǎng)箱(37 ℃，1%O2+94%N2+5%CO2)進行OGD處理，OGD 4 h后棄原培養(yǎng)基，PBS洗細胞兩遍加高糖培養(yǎng)基(不含血清)2m L置于正常培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)行復氧糖處理以模擬再灌注，再灌注不同時間段(0、6、12、18和24 h)后進行后續(xù)干預處理。

1.2.2實驗分組及干預處理 實驗分為正常組(Control)、OGD 4 h組(OGD4)、OGD 4 h后復氧不同時間段4組(OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18、OGD4+R24)、α-硫辛酸給藥OGD/R組(OGD/R+α-LA)。Control組細胞在完全培養(yǎng)基、正常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，OGD/R組細胞按上述方法進行培養(yǎng)處理，OGD/R+α-LA組細胞先OGD處理后在復氧時給予不同濃度(0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mmol/L)α-LA共同處理細胞24 h。

1.2.3CCK-8試劑盒檢測細胞的存活率 生長至合適密度的細胞，將細胞以每孔5×103的密度接種至96孔板，長到50%～60%密度時，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔分別加入無糖DMEM培養(yǎng)基100 μL，置于三氣培養(yǎng)箱(1%O2+5%CO2+95%N2)中培養(yǎng)4 h模擬缺血缺氧處理。缺氧處理后用高糖無血清培養(yǎng)基配置含不同濃度(0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mmol/L) α-LA的培養(yǎng)基置于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h行復氧處理。復氧24 h后，每孔加入CCK-8 10 μL工作液反應1 h，以空白孔調(diào)零，每組六個復孔，酶標測定儀測定450 nm波長下的吸光度值(OD)。細胞存活率=(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.2.4檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡相關(guān)分子GRP78、CHOP、Bax及Cleaved-caspase3表達 各組細胞分別接種于六孔板內(nèi)，長到合適密度后經(jīng)過干預處理，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗細胞兩遍，盡量吸棄PBS后按每孔120 μL的量加裂解液(RIPA)置于冰上，裂解細胞5 min后，用細胞刮刀收集細胞至1.5 mL干凈離心管中，置于冰上繼續(xù)裂解20 min后，12 000 r/min離心收集上清至新的干凈1.5 mL離心管，BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，5×SDS buffer，100 ℃，5～10 min變性蛋白后，按每孔30 μg等量上樣30 mA恒流電泳分離蛋白，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜120 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉室溫封閉膜1.5 h，PBST洗膜5 min后孵育一抗，4 ℃搖床過夜；次日，1×TBST每10 min洗膜3次,室溫孵育二抗2 h，TBST每10 min洗膜3次，ECL-Plus發(fā)光液于GeneGnome XRQ曝光，β-actin作為內(nèi)參，ImageJ軟件進行蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PC12細胞GRP78、CHOP、Bax和Cleaved-caspase3蛋白的表達

與Control組比較，OGD4、OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18、OGD4+R24組細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)的分子GRP78和CHOP表達逐漸升高(P<0.05)，其中GOGD4+R24升高最明顯(P<0.05)；同時相關(guān)的凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3表達也逐漸升高(P<0.05)，在OGD4+R24組升高最高(P<0.05)。見圖1。

注：A為蛋白免疫印跡法條帶；B為各蛋白相對表達量統(tǒng)計柱狀圖； (1)與control組比較，P<0.05。圖1 各組PC12細胞GRP78、CHOP、Bax和Cleaved-caspase3蛋白的表達Fig.1 Expression levels of GRP78, CHOP, Bax and Cleaved-caspase 3 in the different groups

2.2 α-LA 對OGD/R處理后PC12細胞存活率的影響

與Control組比較，OGD4+R24組PC12細胞存活率降低(P<0.05)。與OGD4+R24組比較，OGD/R+α-LA組除0.01 mmol/L α-LA濃度外，其余濃度α-LA 下的PC12細胞存活率均升高(P<0.05)；當α-LA 濃度為0.50 mmol/L時PC12細胞存活率最高(P<0.05)。當α-LA濃度為10.00 mmol/L時，PC12細胞的存活率較OGD4+R24組明顯降低(P<0.05)，表明α-LA在此工作濃度下對PC12具有較強的毒性。見圖2。

注： (1)與control組比較，P<0.05；(2)與OGD4+R24組比較，P<0.05。圖2 各組PC12細胞的存活率Fig.2 Comparison of cell survival rates in the different groups

2.3 α-LA 對OGD/R處理后PC12細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved-caspase3表達的影響

與Control組比較，OGD4+R24組的細胞凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3的表達明顯升高(P<0.05)；與OGD4+R24組比較，OGD/R+α-LA(0.5 mmol/L)組凋亡分子Bax和Cleaved-caspase3的表達明顯降低(P<0.05)。見圖3。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對表達量統(tǒng)計柱狀圖；(1)與control組比較P<0.05；(2)與OGD4+R24組比較，P<0.05。圖3 α-LA對缺血再灌注后PC12細胞凋亡蛋白Bax和Cleaved-caspase3表達的影響Fig.3 The effect of α-LA on OGD/R-mediated expression levels of Bax and Cleaved-caspase 3

2.4 α-LA降低缺血再灌注誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)分子GRP78和CHOP表達

與Control組比較，OGD4+R24組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子GRP78和CHOP的表達明顯升高(P<0.05)；OGD/R+α-LA(0.5 mmol/L)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)分子GRP78和CHOP的表達明顯減少(P<0.05)。見圖4。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對表達量統(tǒng)計柱狀圖；(1)與control組比較，P<0.05；(2)與OGD4+R24組比較，P<0.05。圖4 α-LA對缺血再灌注后PC12細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達的影響Fig.4 The effect of α-LA on the expression levels of OGD4/R-mediated GRP78 and CHOP

3 討論

心腦血管疾病嚴重威脅人類生命安全，影響人類生活質(zhì)量，其中腦卒中是全球排名第二的死亡原因。腦血管破裂及阻塞所導致缺血再灌注損傷是腦卒中發(fā)病的主要原因。缺血再灌注損傷復雜的病理分子機制為腦卒中的預防及治療帶來了困難，研究缺血再灌注損傷的分子機制及開發(fā)有效的藥物干預治療靶點具有重要意義。OGD/R模型是體外模擬缺血再灌注損傷的經(jīng)典模型，是缺血再灌注損傷分子機制研究、藥物藥效、藥理及藥動學的經(jīng)典研究模型。PC12細胞因其神經(jīng)元和腫瘤無限增殖傳代的特性，故而成為體外研究缺血再灌注損傷分子機制及藥物藥效學研究的重要載體。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是生物有機體細胞內(nèi)重要的細胞器，其主要的功能是合成蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)修飾折疊加工、脂質(zhì)的生物合成等[11-13]。其自然進化而來的適應系統(tǒng)—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應，對維持細胞的正常存活以及發(fā)揮正常生物學功能是至關(guān)重要的[14-15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應參與許多的生理病理過程[16-17]。有研究證實，缺血再灌注誘導的鈣離子升高、ROS釋放、能量耗竭等病理過程都會促發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應[18-20]。過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應會加劇缺血再灌注損傷對神經(jīng)細胞、心肌細胞以及腎細胞等損害作用[21-22]。因此，尋找有效的藥物干預內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應可能是腦卒中、心肌梗死等疾病的有效治療策略。

α-LA是萬能的抗氧化劑。諸多研究證實，α-LA在糖尿病、糖尿病并發(fā)類神經(jīng)疾病中發(fā)揮著積極保護的作用[23- 24]。本課題組前期的研究結(jié)果顯示，α-LA能有效降低6-OHDA誘導的PC12細胞活性下降[25]。為探討其對缺血再灌注損傷作用的保護機制，本研究進行了相關(guān)的實驗研究。

本研究運用高度誘導分化的PC12細胞OGD 4 h再灌注不同時間段觀察缺血再灌注對PC12細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡的影響。有趣的是，實驗發(fā)現(xiàn)與正常組比較，缺血再灌注的不同時間段誘導了PC12細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡水平的同步持續(xù)升高。表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)的分子GRP78和CHOP的表達逐步增加，凋亡相關(guān)分子Bax和Cleaved-caspase3的表達相應增加，凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激表達升高最為顯著的是OGD4+R24組。據(jù)此，推斷缺血再灌注誘導了PC12細胞發(fā)生應激性的細胞凋亡。為了探討α-LA對PC12細胞缺血再灌注損傷的保護作用，通過CCK-8細胞活性試劑盒篩選得到了α-LA發(fā)揮保護作用的最適有效工作濃度為0.50 mmol/L，并以此濃度在再灌注階段共同作用于PC12并分析了其相關(guān)的凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子(Bax、Cleaved-caspase3、GRP78和CHOP)的表達量變化。值得欣喜的是，實驗發(fā)現(xiàn)α-LA可以有效降低缺血再灌注誘導的相關(guān)凋亡分子的升高，其表現(xiàn)為裂解型的caspase3和促凋亡蛋白Bax的表達減少。為了進進一步探討其發(fā)揮將降凋亡作用的機制，在同樣的處理模型上，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)的分子GRP78和CHOP的表達變化，發(fā)現(xiàn)α-LA可以顯著減少OGD/R組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的表達。

綜上所述，缺血再灌注誘導了PC12細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激性的凋亡，α-LA可以減少缺血再灌注誘導的細胞損傷，其可能的機制是α-LA通過減少缺血再灌注誘導的過度激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平進而發(fā)揮保護細胞免于缺血再灌注誘導的細胞損傷。本研究為缺血再灌注損傷的分子機制提供了一定的理論證據(jù)，為α-LA的臨床用藥或藥效學提供了理論指導。