豬瘟病毒E2蛋白A-D抗原表位區(qū)的原核表達(dá)與蛋白純化

潘小慧 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV；or Hog cholera virus，HCV）引起的一種熱性、高致死性和高度接觸性傳染疾病[1]。該病僅對(duì)豬有易感性，不同品種、年齡和性別的豬只均可感染[2]。豬瘟病毒屬于黃病毒科（Flaviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），是單股正鏈RNA病毒?；蚪M全長(zhǎng)12.3 kb，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C和囊膜糖蛋白Erns、E1、E2）和8種非結(jié)構(gòu) 蛋 白 （Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）。其中 E2蛋白是CSFV誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，是研究新型基因工程疫苗和血清學(xué)檢測(cè)方法的首選靶蛋白[3-6]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)E2蛋白在113-145和338-360位氨基酸處存在兩個(gè)主要跨膜區(qū)[7]，因此，對(duì)E2全基因進(jìn)行體外表達(dá)可能存在困難。同時(shí)，早期研究表明E2蛋白存在A、B、C、D四個(gè)抗原區(qū)，4個(gè)抗原區(qū)均位于E2蛋白N端氨基酸殘基第690-866位[8]，而C端氨基酸殘基第866-1007位的部分基本上不參與這些表位的形成。因此，氨基酸殘基第690-866位的部分是E2蛋白最具有抗原性的部分[9]。

本研究擴(kuò)增了E2蛋白A-D抗原表位區(qū) （第690-866氨基酸位點(diǎn)）的基因片段（以下將其對(duì)應(yīng)表達(dá)的蛋白簡(jiǎn)稱(chēng)為E2AD蛋白），克隆到pET-28a表達(dá)載體中，并對(duì)E2AD蛋白的原核高效表達(dá)方法進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)目的蛋白純化條件進(jìn)行探索，最后通過(guò)Western blot試驗(yàn)證明重組蛋白E2AD具有良好的反應(yīng)原性，可為豬瘟病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制提供抗原支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒種和質(zhì)粒 豬瘟細(xì)胞毒株由本公司提供；大腸桿菌DH5α受體菌購(gòu)于天根生化科技 （北京）有限公司；大腸桿菌Transetta（DE3）表達(dá)菌購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-28a原核表達(dá)載體由福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院健康工程與技術(shù)研究所保存。

1.1.2 主要試劑 tacoTMDNA/RNA Extraction Kit購(gòu)自金瑞鴻捷（廈門(mén)）生物科技有限公司；AMV反轉(zhuǎn)錄 酶 、HPRI、Random primer、DL1000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、dNTPs （2.5 mmol/L）、PrimeSTAR Max Polymerase、T4 DNA Ligase、EcoRI、BamHI和HindIII限制性?xún)?nèi)切酶、卡那霉素、IPTG和A-garose購(gòu)自寶生物工程 （大連）有限公司；蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Megan(美基生物)；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、冰醋酸、甲醇、甘油等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白凝膠試劑盒購(gòu)于博士德生物工程有限公司；His融合蛋白純化柱 （5 mL預(yù)裝柱）購(gòu)于上海七海復(fù)泰生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購(gòu)自上海碧云天生物生物技術(shù)有限公司；豬瘟病毒陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；羊抗豬IgG-HRP是KPL公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 E2AD基因引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中公布的豬瘟E2基因序列 （登錄號(hào)：AF531433.1），利用Oligo 7.0在E2基因核酸序列的2442-2972（氨基酸位置為690-866）區(qū)域設(shè)計(jì)引物。引物序列為E2AD-F：5'-CGGGATCCCGGCTAGCCTGCAAG GAAG-3'；E2AD-R：5'-GTCAAGCTTT TATAAATCTTCATTTTCCACTGTGG-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為546 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 豬瘟病毒RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 按tacoTMDNA/RNA Extraction Kit儀器說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞液中的豬瘟病毒RNA，所得RNA參照AMV反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.3 E2AD基因的擴(kuò)增 以1.2.2中獲得的cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反 應(yīng) 體 系 50 μL：PrimeSTAR Max Premix （2 × ）25 μL，上、下游引物（20 μmol/mL）各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 23 μL。 PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變 性 10 s，58 ℃退火 5 s，72 ℃ 延伸5 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)分析。

1.2.4 E2AD蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 將PCR產(chǎn)物參照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行回收純化。純化后的E2AD片段和pET-28a空載體分別經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，37℃酶切2 h。酶切產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠跑膠分離目的片段，切膠回收載體和片段后使用T4 DNA Ligase進(jìn)行16℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞涂板，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證引物為pET-28a載體通用引物。挑取驗(yàn)證為陽(yáng)性的單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）培養(yǎng)12~16 h，參照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取陽(yáng)性質(zhì)粒后，使用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送至測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET-28a-E2AD。

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物鑒定 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞涂板，挑取陽(yáng)性單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基 （含50 μg/mL卡那霉素）中37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜。次日按照1%轉(zhuǎn)接量接種于新的5 mL LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.4~0.6時(shí)加入終濃度 分 別 為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的 IPTG，37℃、200 r/min下誘導(dǎo)，并在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后2、3、4、5 h分別取樣1 mL菌液。將誘導(dǎo)前后的菌液以12 000 r/min離心10 min，棄上清，取沉淀利用20 μL PBS液進(jìn)行重懸后加入等量的 2×Loading Buffer，混勻后在沸水中煮15 min。待冷卻后分別取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色液脫色后檢查特異性目的蛋白條帶約為25 kDa。

1.2.6 E2AD蛋白的大量表達(dá)與純化 按照1.2.5中優(yōu)化的誘導(dǎo)方法對(duì)pET-28a-E2AD進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集菌體。然后用PBS吹打清洗菌體2遍，離心收菌。在收集后的菌體中加入30 mL PBS重懸菌體，吹打均勻后收集進(jìn)入50 mL離心管中，冰浴30 min后300 W超聲波裂解15 min直到菌液變澄清。取1 mL超聲液離心，取上清和沉淀分別制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定E2AD蛋白是包涵體表達(dá)。將剩下的超聲液-20℃保存過(guò)夜。次日，冷水浴緩慢溶解超聲液后4℃、12 000 r/min離心 10 min，棄上清，取沉淀；加入2 M尿素洗滌沉淀2遍，再次離心溶液、收集沉淀，加入8 M尿素溶液溶解后離心，取上清，棄沉淀。參照His融合蛋白純化柱（5 mL預(yù)裝柱）說(shuō)明書(shū)純化上清，獲得粗提純蛋白溶液，然后利用透析袋梯度純化方法進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性后，收集E2AD融合蛋白于-20℃保存。

1.2.7 免疫印跡法鑒定重組蛋白E2AD 將純化的重組蛋白E2AD進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用Bio-Rad點(diǎn)轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行免疫印跡，一抗為豬瘟病毒陽(yáng)性血清，二抗為羊抗豬IgG-HRP。

1.2.8 E2AD蛋白濃度的測(cè)定 參照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明書(shū)對(duì)E2AD蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 E2AD基因的擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄的豬瘟cDNA為模板，E2AD-F和E2AD-R為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物大小約546 bp，與預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果相符（見(jiàn)圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增E2AD基因片段

2.2 pET-28a-E2AD表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 純化后的E2AD基因片段與pET-28a空載體雙酶切進(jìn)行凝膠驗(yàn)證，回收目的片段連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞后，通過(guò)PCR驗(yàn)證得到陽(yáng)性克隆菌落的條帶大小約834 bp（見(jiàn)圖2）。對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切、雙酶切驗(yàn)證（見(jiàn)圖3）；驗(yàn)證正確后送至測(cè)序公司測(cè)序，比對(duì)顯示，pET-28a-E2AD中E2AD基因序列正確。

圖2 pET-28a-E2AD菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 pET-28a-E2AD酶切驗(yàn)證結(jié)果

2.3 E2AD蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.3.1 IPTG濃度的確定 將pET-28a-E2AD表達(dá)菌搖至 OD600為 0.4～0.6時(shí)加入 IPTG誘導(dǎo) 4 h，SDS-PAGE電泳顯示，在25 kDa處出現(xiàn)目的蛋白條帶，且IPTG濃度為0.2 mmol/L時(shí)目的蛋白表達(dá)量最多，隨著IPTG濃度的增大，蛋白表達(dá)量逐漸降低或者沒(méi)有增加的趨勢(shì)，因此，確定IPTG最佳誘導(dǎo)濃度為 0.2 mmol/L（見(jiàn)圖 4）。

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間的確定 將pET-28a-E2AD表達(dá)菌用濃度為0.2 mmol/L的IPTG分別誘導(dǎo)2 h、3 h、4 h和5 h，取誘導(dǎo)前后菌液制樣經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)4 h和5 h時(shí)蛋白表達(dá)量最多，因此，確定IPTG誘導(dǎo)時(shí)間為4 h即可（見(jiàn)圖5）。

圖4 pET-28a-E2AD的IPTG誘導(dǎo)濃度的確定

圖5 pET-28a-E2AD的IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的確定

2.4 E2AD蛋白的純化 大量表達(dá)E2AD蛋白后使用Ni-NTA蛋白純化柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，前3管洗脫液中的純化效果較好（見(jiàn)圖6）。

圖6 E2AD蛋白純化

2.5 E2AD蛋白的免疫印跡分析 用豬瘟陽(yáng)性血清為一抗、羊抗豬IgG-HRP為二抗對(duì)重組蛋白E2AD進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果表明，在25 kDa處出現(xiàn)反應(yīng)條帶（見(jiàn)圖7），說(shuō)明蛋白具有活性。

圖7 E2AD蛋白的Western blot鑒定

2.6 蛋白濃度測(cè)定 經(jīng)檢測(cè)，純化的蛋白濃度為0.2 g/L。

3 討 論

豬瘟對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重，是世界糧農(nóng)組織和各國(guó)政府嚴(yán)密監(jiān)控和檢疫的主要傳染病之一。目前免疫學(xué)檢測(cè)和核酸檢測(cè)是疫病檢測(cè)的主要檢測(cè)方法，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）以其操作簡(jiǎn)便、敏感性高、適于大規(guī)模樣品檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)成為檢測(cè)抗體的主要免疫學(xué)方法，也是監(jiān)測(cè)豬群抗體水平的主要技術(shù)手段。用于ELISA的包被抗原主要是全病毒和重組蛋白，由于CSFV在體外細(xì)胞上不產(chǎn)生病變，增殖能力差，對(duì)培養(yǎng)條件要求高[10]，從而導(dǎo)致以病毒培養(yǎng)液作為包被抗原的ELISA結(jié)果不是十分穩(wěn)定。因此，許多研究者相繼研發(fā)出以重組蛋白E0或E2作為包被抗原的CSF抗體檢測(cè)試劑盒[11-13]。豬瘟病毒的12種蛋白中，E2蛋白是CSFV粒子表面一種包膜糖蛋白，是病毒吸附、進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋 白[14-15]。E2糖蛋白是一種免疫優(yōu)勢(shì)蛋白，能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性中和抗體，一直是研究的熱點(diǎn)。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，研究學(xué)者對(duì)E2全蛋白的抗原結(jié)構(gòu)的研究更加深入。研究發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒E2糖蛋白氨基端存在A、B、C、D四個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域，其中D/A區(qū)是豬瘟病毒基因組中高度保守的區(qū)域，B/C區(qū)位于決定病毒株抗原特異性的區(qū)域[16]。因此，本研究選擇E2糖蛋白的A-D抗原表位區(qū)而非E2全蛋白進(jìn)行克隆表達(dá)，不僅減少了表達(dá)蛋白的分子量，便于蛋白的表達(dá)和純化，而且以E2主要抗原區(qū)為包被抗原能增加抗體檢測(cè)的特異性。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以其周期短、效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)成為工業(yè)生產(chǎn)中比較理想的表達(dá)方式。影響外源基因在其中高效表達(dá)的因素主要有表達(dá)載體、宿主細(xì)胞的選擇和表達(dá)條件（誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑IPTG的濃度等）[17]。本研究使用帶有His標(biāo)簽的pET-28a載體表達(dá)融合蛋白，有利于目的蛋白的分離純化；同時(shí)選用經(jīng)過(guò)基因改造的大腸桿菌Transetta（DE3）作為表達(dá)宿主菌，補(bǔ)充了菌體中缺乏的6種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，以期達(dá)到提高外源真核基因E2AD表達(dá)水平的目的。在表達(dá)條件的優(yōu)化上，本研究首先使用不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)并非IPTG的誘導(dǎo)濃度越高蛋白的表達(dá)量就越多，過(guò)高濃度的IPTG對(duì)菌體生長(zhǎng)還會(huì)有抑制作用。同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行梯度試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)4 h與5 h差異不大。所以，試驗(yàn)最后確定IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠高效表達(dá)重組蛋白，但是重組蛋白通常以包涵體形式存在。本研究中E2AD蛋白也是主要以包涵體形式表達(dá)的，因此包涵體的變性、純化和復(fù)性是使重組蛋白具有生物學(xué)活性的關(guān)鍵步驟。包涵體的處理一般包括菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、純化以及復(fù)性。本試驗(yàn)對(duì)菌體的破碎條件進(jìn)行了探索，經(jīng)過(guò)多次對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在200 W超聲5 s、停8 s條件下，超聲破碎99次后將超聲后液體放入-20℃再進(jìn)行凍融裂解效果比較理想。經(jīng)破碎和凍融后的包涵體中除了目的蛋白外，還有核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白、脂質(zhì)和脂多糖等雜質(zhì)[18]，這些可能對(duì)目的蛋白的純化造成干擾。通常人們使用中等濃度的變性劑如TritonX-100或者尿素等緩沖液洗滌包涵體幾次來(lái)除去雜質(zhì)。由于試驗(yàn)中使用8 M尿素作為變性劑，為了不引入新的離子，本試驗(yàn)使用2 M尿素洗滌包涵體2遍，然后再使用8 M尿素完全溶解后上柱洗脫，最終獲得了較多的目的蛋白。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)E2基因主要抗原區(qū)的原核表達(dá)載體pET-28a-E2AD，并通過(guò)對(duì)表達(dá)條件和包涵體純化條件的探索，最終獲得純度高、具有活性的重組蛋白E2AD，為后續(xù)豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。