三株未知菌的鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)

陳 建 派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500

豬瘟疫苗生產(chǎn)的原料就是大兔，所以對(duì)挑選原料兔有嚴(yán)格的規(guī)定。在生產(chǎn)豬瘟疫苗時(shí)，也有明確規(guī)定，采取的脾臟和淋巴必須保證無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染 （參照中華人民共和國(guó)獸藥典3306、3307和3308）。抗生素是治療大兔疾病不可缺少的藥物，但是抗生素的濫用很容易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性。近年來(lái)，為了促進(jìn)大兔的生長(zhǎng)發(fā)育，抗生素作為飼料添加劑已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，抗生素在預(yù)防和治療細(xì)菌性感染上效果明顯，但大兔不是所有的抗生素都能使用的。生產(chǎn)實(shí)踐證明，在養(yǎng)兔生產(chǎn)中濫用抗生素是不可取的?？股乜梢云茐耐妹つc內(nèi)正常的微生物菌落，影響消化，甚至可導(dǎo)致疾病。原因是抗生素有個(gè)致命的問(wèn)題，就是抗生素通常會(huì)將腸道內(nèi)的有益菌一起“通殺”，這不但會(huì)破環(huán)腸道內(nèi)菌群的平衡、使有害菌伺機(jī)大量繁殖而產(chǎn)生致命毒素外，還有可能令正常的菌群數(shù)量減少或消失，這可能比任何疾病都來(lái)得嚴(yán)重，因?yàn)橥弥饕且蕾嚸つc中微生物（有益菌）的分解來(lái)消化食物，也就是說(shuō)，吃進(jìn)去的食物先由腸道中種類繁多的微生物（有益菌）分解之后，大兔才可吸收，殺死了這部分細(xì)菌，無(wú)異于直接殺死兔子。在疫情發(fā)生時(shí)，不僅需要而且應(yīng)該及時(shí)使用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療，這都是無(wú)可非議的。在實(shí)際生產(chǎn)中，很多養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)濫用抗生素的情況非常普遍，不僅沒(méi)有起到防病治病的作用，反而導(dǎo)致了各種問(wèn)題的發(fā)生，如死胎、流產(chǎn)、中毒、營(yíng)養(yǎng)不良等。

某兔場(chǎng)大兔出現(xiàn)腹瀉、身體消瘦，死亡率很高。分別采集腹瀉的、身體消瘦的大兔及不給小兔喂乳（且腹瀉）的母兔脾臟和淋巴樣品進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，檢出3株未知細(xì)菌，樣品編號(hào)分別為P1102、L1103和L1104。為了鑒定3株未知菌，采用平板培養(yǎng)法、液體培養(yǎng)法、PCR鑒定法和藥物敏感性試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌菌種鑒定及耐藥試驗(yàn)。結(jié)果判定樣品P1102為葡萄球菌，L1103與L1104為大腸桿菌，現(xiàn)報(bào)道如下。

表1 采樣及檢驗(yàn)情況

表2 引物序列

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源 在無(wú)菌條件下分別采集腹瀉的、身體消瘦的大兔及不給小兔喂乳（且腹瀉）的母兔脾臟和淋巴樣品，搗碎，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，見(jiàn)表1。取其中長(zhǎng)有未知細(xì)菌的血斜樣品P1102、長(zhǎng)有未知細(xì)菌的硫乙醇樣品L1103和L1104（均源自2018年4月某兔場(chǎng)）作進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、LB培養(yǎng)基、藥敏紙片，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2×EasyTaqTM PCR SuperMix、DL2000 DNA Marker，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物 參考Weisburg W G等[1]文獻(xiàn)報(bào)道的未知細(xì)菌的16S擴(kuò)增引物序列（見(jiàn)表2），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 細(xì)菌分離及純化培養(yǎng) 分別挑取樣品P1102號(hào)血斜內(nèi)菌落，吸取少量L1103與L1104液體接于TSA平板、劃線，置37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h，次日，挑取單菌落繼續(xù)接于TSA平板、劃線，置37℃恒溫箱培養(yǎng)12 h。分別挑選樣品均勻一致的數(shù)個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.5 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為50 μL：分別加入2×EasyTaqTM PCR SuperMix 250 μL，菌液 1 μL，兩對(duì) 引 物 （FD1+RD1）與 （FD1+RP2）各 1 μL，ddH2O 24 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。以雙蒸水為空白對(duì)照，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。將陽(yáng)性樣品送鉑尚生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)按常規(guī)K-B法進(jìn)行[2]，挑取分離培養(yǎng)的單個(gè)典型菌落于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)16 h，取適當(dāng)稀釋菌液均勻涂布在瓊脂平板上，平板置室溫下干燥3～5 min，用無(wú)菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，置37℃恒溫箱內(nèi)8～12 h后觀察結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照CLSIM100-S20[3]。

2 結(jié) 果

圖1 3株菌平板培養(yǎng)菌落形態(tài)

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果 從分離菌落的形態(tài)上可以發(fā)現(xiàn)，P1102的菌落為白色原點(diǎn)；L1103與L1104的菌落形態(tài)比較接近，都為半透明狀（見(jiàn)圖1）。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 用FD1+RD1對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以看到P1102、L1103、L1104都出現(xiàn)約1 500 bp的條帶。采用FD1+RP2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，未出現(xiàn)陽(yáng)性條帶（見(jiàn)圖2-圖3）。

圖2 FD1+RD1 PCR結(jié)果

2.3 測(cè)序比對(duì)結(jié)果 經(jīng)過(guò)測(cè)序，將樣品P1102、L1103和L1104的序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果P1102與登錄號(hào)為MG460585（葡萄球菌CAU 1472株）的序列同源性為100%；L1103與登錄號(hào)為CP009104（大腸桿菌菌RM 9387株）的序列同源性為100%；L1104與登錄號(hào)為CP023349（大腸桿菌菌Ecol 2264株）的序列同源性為100%[4-8]。判定樣品P1102為葡萄球菌，L1003與L1004為大腸桿菌[9]。

圖3 FD1+RP2 PCR結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4、表3。

P1102株敏感的藥物有11種：阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、諾氟沙星、青霉素、利福平、多西環(huán)素、新霉素、左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；中介的藥物有3種：丁胺卡那、環(huán)丙沙星和大觀霉素；耐受的藥物有9種：多粘菌素B、復(fù)方新諾明、紅霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素和四環(huán)素。

圖4 藥敏紙片平板抑菌情況

L1103株敏感的藥物有3種：左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；中介的藥物有2種：多粘菌素B和大觀霉素；耐受的藥物有18種：阿莫西林、氨芐西林、丁胺卡那、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、諾氟沙星、青霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、鏈霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、四環(huán)素和新霉素。

L1104株敏感的藥物有6種：多粘菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；中介的藥物有2種：丁胺卡那和大觀霉素；耐受的藥物有15種：阿莫西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、青霉素、紅霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、鏈霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、四環(huán)素和新霉素[10-11]。

表3 3株分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

本次試驗(yàn)鑒定了一株葡萄球菌（P1102）、兩株大腸桿菌（L1103和L1104），3株分離菌均呈現(xiàn)多重耐藥性。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，抗生素的濫用現(xiàn)象越來(lái)越普遍，造成細(xì)菌耐藥性也越來(lái)越強(qiáng)。結(jié)果是使用常規(guī)藥物無(wú)法控制病情，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。從藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌P1102對(duì)阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考等11種藥物敏感，對(duì)多粘菌素B、復(fù)方新諾明、紅霉素等9種藥物耐受。分離菌L1103僅對(duì)左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星3種藥物敏感，對(duì)阿莫西林、氨芐西林、丁胺卡那等18種藥物耐受。分離菌L1104敏感的藥物有6種，分別為多粘菌素B、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢挫林和氧氟沙星；耐受的藥物多達(dá)15種，分別為阿莫西林、氨芐西林、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、青霉素、紅霉素、克林霉素、林可霉素、卡那霉素、利福平、鏈霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、四環(huán)素和新霉素。

取樣的母兔未患乳房炎，但小兔出現(xiàn)腹瀉，母兔脾臟搗碎后檢測(cè)含有葡萄球菌。小兔腹瀉、不給小兔喂乳，通常是由于母兔患有乳房炎，但抗生素的濫用可能導(dǎo)致母兔沒(méi)有患乳房炎但小兔喝奶后直接引起腹瀉。由此可見(jiàn)，抗生素的規(guī)范使用必須得到重視，懷疑發(fā)生細(xì)菌性感染時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和國(guó)家相關(guān)規(guī)定合理用藥。