2012-2018年福建省豬病毒性腹瀉流行情況

曾憲煜 陳秋勇 王隆柏 車勇良 陳如敬 吳學(xué)敏 王晨燕 劉玉濤 周倫江＊

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福州 350013；2.長汀縣動物疫病預(yù)防控制中心，福建長汀 366300）

豬腹瀉是一種常見的豬腸道疾病，致病機(jī)理復(fù)雜，可通過細(xì)菌、病毒和寄生蟲等方式感染，其中豬病毒性腹瀉因其感染速度快、范圍廣，對養(yǎng)豬行業(yè)的危害尤為嚴(yán)重。引起豬病毒性腹瀉的病毒種類較多，其中豬流行性腹瀉病毒 （Porcine Epidemic Diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和豬輪狀病毒（Porcine rotavirus，PoRV）是引起豬病毒性腹瀉的主要病原[1-2]。1971年P(guān)EDV在英國最早被發(fā)現(xiàn)，發(fā)病仔豬腹瀉、嘔吐和脫水；1973年首次在我國上海報道發(fā)生，隨后在吉林、江西、河北、山東、湖南、廣東和福建等地均檢測到了該病的發(fā)生[3-5]。與此同時TGEV和PoRV開始在國內(nèi)陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)和報道，由于臨床癥狀相似，發(fā)病豬群食欲不振、消瘦、嘔吐和排水樣糞便，很難通過臨床方法區(qū)分，目前主要的檢測方式是通過抗原PCR檢測和免疫血清學(xué)檢測抗體。為進(jìn)一步了解福建省豬病毒性腹瀉的流行情況，本研究通過2012-2018年對采自福建省179家豬場2 003份發(fā)生腹瀉的病料進(jìn)行PEDV、TGEV和PoRV病原學(xué)檢測，研究分析PEDV、TGEV和PoRV在豬群中的感染和流行規(guī)律，為豬病毒性腹瀉的防控提供科學(xué)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和參考意義。

1 材料與方法

1.1 組織樣品 收集來自福建省2012-2018年179家豬場疑似PEDV、TGEV和PoRV的2003份腹瀉病料，主要包括病變腸道及其內(nèi)容物。

1.2 主要試驗(yàn)儀器及試劑 DNA/RNA提取試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒、2×Super Taq PCR Mix Genstar和DNA Marker-2000購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，Random Primer、5×RT Buffer、dNTPs、RNase Inhibitor和Reverse Tra Ace等試劑購自東洋紡 （上海）生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 參考Genbank中PEDV（GenBank：KJ645708）、TGEV （GenBank：AF209745） 和 PoRV（GenBank：KU886318.1）參考序列，設(shè)計(jì)特異性引物（見表1），由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物序列和片段大小

1.4 核酸提取 采用購自北京全式金生物技術(shù)有限公司的病毒RNA/DNA提取試劑盒，參照說明書，提取組織樣品中的總DNA/RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?.5 RT-PCR 采用購自東洋紡(上海)生物科技有限公司的RT-PCR擴(kuò)增試劑盒，按照試劑盒說明書配制反應(yīng)體系 （見表2），反應(yīng)條件：30℃、10 min，40℃、20 min，99℃、5 min，反應(yīng)結(jié)束后在4℃保存。

表2 RT反應(yīng)體系

按照試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系 （見表3），反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，一個循環(huán)；94℃變性50 s，退火（溫度分別為PEDV 53℃，TGEV 51℃，PoRV 51 ℃）50 s，72 ℃、1 min，40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后在4℃保存?zhèn)溆?。取擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結(jié)果。

表3 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 病原方面分析 采用RT-PCR方法對來自福建省179家豬場的2 003份疑似豬病毒性腹瀉病料進(jìn)行檢測，其中PEDV、TGEV和PoRV擴(kuò)增目的條帶大小分別為 595 bp、739 bp和 309 bp（見圖 1）。檢測結(jié)果顯示（見表4）：收集的2 003份腹瀉病料中PEDV 陽性率為 72.74%（1 457/2 003）；TGEV 陽性率為 7.89%（158/2 003）；PoRV 陽性率為 2.4%（48/2 003）。表明福建省豬場引起豬病毒性腹瀉的主要病原為PEDV，陽性率最高，其次是TGEV，最后是PoRV。其中PEDV 2016年陽性率較高，為77.19%（247/320）；TGEV 2012年陽性率最高，為 20.27%（60/296）；PoRV 2012 年陽性率最高， 為 5.41%（16/296）。PEDV在2012-2018年期間陽性率均最高，TGEV陽性率次之，且呈逐年遞減趨勢；PoRV陽性率在2012年最高，且在2013-2018年期間有所降低，陽性率趨近于2%（見圖2）。

圖1 PEDV、TGEV和PoRV樣品檢測電泳圖

表4 豬腹瀉病料RT-PCR檢測結(jié)果

圖22012 -2018年P(guān)EDV、TGEV和PoRV陽性率

2.2 發(fā)病季節(jié)分析 檢測結(jié)果顯示（見表5），一年中在冬春季節(jié)發(fā)病最為嚴(yán)重，PEDV發(fā)病率最高，冬季為 67.19%（979/1 457）， 春 季 為 23.47%（342/1 457）；TGEV 發(fā)病率，冬季為 70.25%（111/158），春季為22.78%（36/158）；PoRV發(fā)病率，冬季為64.58%（31/48），春季為 29.17%（14/48）。 結(jié)果顯示，豬病毒性腹瀉在冬春兩季暴發(fā)嚴(yán)重，發(fā)病率高，這可能與冬季氣候寒冷、春季氣候變化大、忽冷忽熱有關(guān)。

2.3 發(fā)病日齡分析 不同日齡豬群均可感染PEDV、TGEV 和 PoRV，7 d內(nèi)仔豬和 7～25 d哺乳仔豬的發(fā)病率較高 （見表6），分別為PEDV 51.54%（751/1 457） 和 32.53%（474/1 457）、TGEV 55.06%（87/158） 和 34.81%（55/158）、PoRV 62.50%（30/48）和29.17%（14/48）。結(jié)果表明，仔豬在出生25 d內(nèi)易受病毒感染引起腹瀉，到了保育期后，PEDV、TGEV和PoRV發(fā)病率均有明顯下降。

表5 PEDV、TGEV和PoRV在不同季節(jié)的發(fā)病率

3 討 論

豬病毒性腹瀉是豬場常見的疫病之一，被感染的豬群嚴(yán)重嘔吐、腹瀉、脫水，導(dǎo)致死亡，對養(yǎng)豬行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過RT-PCR檢測方法對收集的省內(nèi)179家豬場2 003份疑似豬病毒性腹瀉病料進(jìn)行病原學(xué)檢測。結(jié)果表明：PEDV的陽性率最高，為 72.74%（1 457/2 003），TGEV 的陽性率為7.89%（158/2 003），PoRV 的 陽 性 率 為 2.40%（48/2 003），主要集中在冬春季節(jié)。近年來，朱子健等、劉鄧等、王淞等、趙志敏、張佩華等、王偉等、周玲等、薛翼鵬等、廖勤豐等、陳杰、倪建強(qiáng)等對國內(nèi)各地豬病毒性腹瀉流行情況進(jìn)行調(diào)查[2，6-15]，發(fā)現(xiàn)PEDV發(fā)病率最高，TGEV和PoRV發(fā)病率均較低，冬春季節(jié)多發(fā)，本次調(diào)查研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。從發(fā)病日齡分析，PEDV、TGEV和PoRV發(fā)病率主要集中在25日齡內(nèi)仔豬，其中7日齡內(nèi)發(fā)病最嚴(yán)重。王瑞等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從發(fā)病豬場母豬乳水中可以檢出豬病毒性腹瀉病原[16]，說明仔豬可通過母乳感染豬病毒性腹瀉病原，同時，新生仔豬抵抗力較低，缺乏相應(yīng)抗體，易受母豬乳水或者環(huán)境中PEDV、TGEV和PoRV感染威脅，應(yīng)加強(qiáng)免疫防護(hù)措施。本研究通過分析福建省豬病毒性腹瀉流行情況，為我省豬病毒性腹瀉防控提供科學(xué)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和參考意義。

表6 PEDV、TGEV和PoRV在豬不同日齡發(fā)病情況