光棘球海膽seali基因克隆及表達(dá)特性分析

王 錦 張 健 劉炳正 張偉杰 常亞青 孫志惠

(大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大連 116023)

PIWI (P-element induced wimpy testis)作為一種調(diào)控蛋白, 在干細(xì)胞維持、生殖細(xì)胞發(fā)育及體細(xì)胞基因調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[1]。PIWI蛋白最早在果蠅(Drosophilidae)生殖干細(xì)胞中被鑒定, 是Argonaute蛋白家族的一個(gè)亞家族, 具有PIWI和PAZ兩個(gè)進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域[2]。PIWI亞家族蛋白廣泛存在于多種物種。在果蠅中,piwi在卵巢、精巢和體細(xì)胞中均有表達(dá), 缺失piwi, 原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell, PGC)的自我更新能力將受到影響, 體細(xì)胞中過表達(dá)piwi導(dǎo)致生殖細(xì)胞數(shù)量增加[3,4]。在斑馬魚(Danio rerio)中,piwi(ziwi)基因在生殖細(xì)胞中特異表達(dá), 且在卵巢和精巢中都有表達(dá),與生殖細(xì)胞維持和斑馬魚的性別決定有關(guān)[5,6]。在小鼠(Mus musculus)中,Piwi在精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中特異表達(dá), 是精子發(fā)生所必需的, 而小鼠的另一Piwi同源基因Mili在卵母細(xì)胞中也有表達(dá)[7,8]。

在紫色球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)中, 已鑒定出兩種Piwi同源蛋白, Seawi和Piwi like 1(也有稱Seali), 其中Piwi的表達(dá)模式與Vasa非常相似, 均在早期胚胎中呈泛表達(dá)狀態(tài)[9,10]。紫色球海膽seawi基因在胚泡形成過程中募集, 隨后在囊胚期的植物板處局部富集, 原腸期時(shí)遷移至腸系膜頂端, 最后合并到棱柱幼蟲的兩個(gè)體腔袋中并于左側(cè)富集, 由此推測(cè)seawi基因可能在紫色球海膽生殖細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[11]。在成體紫色球海膽中,seawi于成熟卵巢的卵母細(xì)胞均勻分布; 在綠海膽(Lytechinus variegatus)和紅海膽(Mesocentrotus franciscanus)中,seawi在各組織中均有表達(dá)[9,10]。在海膽中, 針對(duì)piwi相關(guān)的研究多集中在胚胎發(fā)育時(shí)期, 成體水平的相關(guān)研究較少, 而光棘球海膽中piwi相關(guān)基因的表達(dá)情況尚不清晰。

光棘球海膽(Mesocentrotus nudus), 又稱大連紫海膽, 屬棘皮動(dòng)物門, 海膽綱, 主要分布于遼東半島和黃、渤海域。其性腺營養(yǎng)豐富、品質(zhì)優(yōu)良, 是我國北方沿海主要的經(jīng)濟(jì)種類和出口海產(chǎn)品之一[12]。本研究以光棘球海膽為研究對(duì)象, 克隆獲得了光棘球海膽Mnseali基因的全長cDNA序列, 并利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了其在成體組織中的表達(dá)情況,并由胚胎發(fā)育時(shí)期持續(xù)檢測(cè)至性成熟時(shí)性腺中的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化。此外, 通過切片原位雜交技術(shù)對(duì)Mnseali基因在性腺中細(xì)胞定位進(jìn)行分析。本研究為進(jìn)一步探究Mnseali在海膽生殖細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用光棘球海膽, 捕撈于大連市黑石礁海域(121°33′47′′E, 38°51′55′′N)。實(shí)驗(yàn)前, 所用海膽在大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的循環(huán)水槽中暫養(yǎng)一周, 培養(yǎng)條件為: pH 為7.96±0.02; 海水溫度為(12.41±0.11)℃; 鹽度為(30.13±0.21)‰。每天投喂一次海帶及石莼等常見藻類植物, 每?jī)商旄鼡Q一次海水。

1.2 方法

總RNA的提取及cDNA的合成在解剖海膽后, 所取樣品立即置于液氮中速凍, 備用?？俁NA的提取參照SV Tolal RNA Isolation System(Promaga Z3100)說明書進(jìn)行。利用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量。隨后, 取1 μg卵巢組織總RNA, 參照SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 634923)建立卵巢cDNA文庫。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的合成則參照PrimeScriptTMRTreagentKit(TaKaRa634860)說明書進(jìn)行。

cDNA全長克隆在前面研究中, 我們獲得了光棘球海膽性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[13]。在本研究中,我們以人PIWI蛋白序列為比對(duì)序列, 在光棘球海膽性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中搜索到了Mnseali的基因片段。根據(jù)所得到的基因片段, 使用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)5′和3′RACE引物(表1), 參照SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 634923)說明書克隆其cDNA全長序列。PCR擴(kuò)增使用LATaq酶(TaKaRa RR02MA), PCR程序如下: 94℃預(yù)變性5min; 94℃, 30s; 62℃, 30s; 72℃, 1.15min; 30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后, 切膠純化回收DNA, 并將純化的DNA連接pMD18-TV載體, 轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,在LB培養(yǎng)基上涂布后于37℃培養(yǎng)箱中過夜。第二天挑取單菌落于裝有LB液體培養(yǎng)基的離心管中,震蕩培養(yǎng), 然后通過菌落PCR篩選陽性克隆并測(cè)序。

seali序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析利用NCBI中ORF-Finder預(yù)測(cè)Mnseali基因的開放閱讀框; 分別使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)及Ex-Pasy中的Protparam工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)MnSeali蛋白的結(jié)構(gòu)域和基本理化性質(zhì);分別采用Predict(Proteinhttps://www.predictpro tein.org/)、Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)分析MnSeali蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu); 隨后利用Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì), 并用MEGA7.0對(duì)MnSeali進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

熒光定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)分析使用Light-Cycler?96Instrument(Roche, LightCycler?96)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系如下: FastStartEssentialDNAGreenMaster 10 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL, cDNA 2 μL, H2O 6.4 μL。PCR程序如下:95℃, 10min; 95℃, 15s; 60℃, 60s; 40個(gè)循環(huán); 95℃,10s; 65℃, 60s; 97℃, 1s。以光棘球海膽ubiquitin基因作為內(nèi)參, 采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的表達(dá)情況。利用SPSS21.0軟件對(duì)所得熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素方差分析, 存在顯著性差異和存在極顯著性差異分別為P＜0.05和P＜0.01。

表1 PCR所用到的引物序列Tab. 1 Sequences of the primers used for PCR

RNA探針合成根據(jù)克隆所得到的Mnseali基因cDNA序列, 設(shè)計(jì)探針引物(表1)。隨后, 參照T7 RNA Polymerase(Roche, 10881767001)和DIG RNA labeling mix(Roche, 11277073910)說明書在體外制備RNA探針, 具體操作如下: PCR擴(kuò)增得到特異目的片段經(jīng)切膠純化回收后備用; 在微量離心管中配制總體積為10 μL的反應(yīng)體系: PCR productor DNA2.5 μL(DNA濃度為400 ng/μL, 保證DNA總量為1 μg)、DIG RNA Labeling mixor 1 μL、Transcaription buffer 1 μL、T7 RNA聚合酶1 μL、RNA酶抑制劑1 μL、RNase-free water 3.5 μL, 充分混勻后于37℃反應(yīng)2h。在反應(yīng)完成后, 加入1 μL DNA酶37℃孵育15min, 以便充分消化剩余DNA模板。隨后, 加入2.5 μL Licl和75 μL無水乙醇, 于-20℃沉淀過夜; 翌日, 4℃, 13000 r/min離心15min,之后用75%無水乙醇洗滌兩次; 最后, 用20—30 μL無RNA酶水重懸RNA。

RNA切片原位雜交RNA切片原位雜交參照實(shí)驗(yàn)室前面的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行[14], 該實(shí)驗(yàn)主要分為6個(gè)部分, 分別為: 樣品的處理,、樣品固定、 雜交、 洗脫、顯色和鏡檢。所用去離子甲酰胺購自AMRESCO(美國), 所用DiethylPyrocarbonate(DEPC)采購于Sigma-Aldrich?(上海), 所用Tween、20×SSC、PBS磷酸緩沖液粉末均采購自索萊寶公司(北京)。具體流程如下:

樣品處理: 將光棘球海膽的性腺組織經(jīng)4%DEPC處理的Perfluoroalkoxy(DEPC-PFA)4℃固定過夜; 第二天, 用DEPC-PBS搖洗三次, 每次5min;之后用30%蔗糖于4℃滲透過夜; 第三天, 使用組織包埋劑OCT(Tissue-Tek, 上海)進(jìn)行包埋, 用Leica-CM1900-1-1進(jìn)行冷凍切片; 切片后, 將玻片于37℃烘箱中烘烤1h。

樣品固定: 將烘干的玻片置于裝滿DEPC處理的PBS(DEPC-PBS)的臥式染缸中, 室溫?fù)u洗2次, 每次5min; 用4% DEPC-PFA固定載玻片上的組織樣品; 用DEPC-PBS, 室溫?fù)u洗2次, 每次5min, 洗去多余的固定液。

雜交: 在每個(gè)濕盒上放置三張濾紙, 用濕盒緩沖液(20×SSC 2.5 mL; DEPC水22.5 mL; 去離子甲酰胺25 mL)充分浸透; 每張切片加100—200 μL雜交液(探針含量1 μg/mL), 蓋上蓋玻片; 用封口膜將濕盒密封, 置于59℃烘箱雜交18—20h。

洗脫: 將玻片置于裝滿63℃預(yù)熱洗脫液(20×SSC 12.5 mL; 去離子甲酰胺125 mL; Tween 0.25 mL; DEPC水112.5 mL)的臥式染缸中, 63℃搖洗2次, 每次30min; 之后用0.2×SSC于63℃搖洗2次,每次30min; 馬來酸于室溫?fù)u洗兩次, 每次20min; 接著, 用封阻液(10%羊血清+馬來酸)室溫封阻1h; 隨后, 加抗體于4℃條件下孵育過夜。

顯色和鏡檢: 用馬來酸在室溫中搖洗三次, 每次20min; 堿性磷酸酶顯色緩沖液, 室溫?fù)u洗三次,每次5min; 隨后按照說明配置堿性磷酸酶顯色液(碧云天, C3206), 避光顯色; 顯色完成后于裝滿PBS的臥式染缸中, 室溫?fù)u洗2次, 每次5min, 并進(jìn)行甲醇梯度脫色; 脫色完成后用甘油封片, 并使用Leica DM4B進(jìn)行鏡檢拍照。

2 結(jié)果

2.1 Mnseali基因cDNA全長序列分析

本研究克隆得到Mnseali基因的cDNA全長序列(GenBank登錄號(hào): MK775490), 該序列全長3462 bp,其中3′UTR長度為416 bp, 5′UTR為180 bp, 其中3′UTR的加尾信號(hào)并非經(jīng)典的AAUAAA或AUUAAA,而是較少見的AAUACA[15,16]。開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)長度為2862 bp, 起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)分別位于181 bp處和3040 bp處, 共編碼954個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明,MnSeali蛋白具有兩個(gè)進(jìn)化上高度保守的結(jié)構(gòu)域: PAZ(Arg385-Arg50)和Piwi(Arg493-Gln936) (圖1A)。此外,Mnseali蛋白的理論分子量為107.13 kD, 理論等電點(diǎn)為9.43。MnSeali蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(alpha-helix, H)、延伸鏈(strand, E)和無規(guī)則卷曲(coil, L)占比分別約為22.14%、20.78%和57.08%,其不穩(wěn)定系數(shù)為48.26, 蛋白質(zhì)歸類為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。MnSeali蛋白質(zhì)中有酸性氨基酸殘基89個(gè), 堿性氨基酸殘基120個(gè), 其親水平均值(GRAVY)值為-0.413, 為親水性蛋白(圖1)。以已知三維結(jié)構(gòu)的沙蠶(Sipunculus nudusLinne)的Piwi蛋白(Swiss-model模板號(hào): 5 guh.1.A)為模板, 進(jìn)行同源建模, 得到MnSeali的氨基酸序列與沙蠶Piwi氨基酸序列的一致性為38.37%。MnSeali氨基酸序列中含有多個(gè)疏水區(qū)域, 共有295個(gè)疏水殘基, 其數(shù)量遠(yuǎn)小于親水殘基, 即該蛋白為親水性蛋白, 與蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。另外,MnSeali蛋白中沒有跨膜螺旋區(qū),意味著該蛋白不是膜蛋白。此外,MnSeali蛋白含有三個(gè)糖基化位點(diǎn), 分別位于Asn324-Thr326、Asn366-Ser368和Asn405-Thr408(圖1B-C)[17]。

2.2 多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

我們從NCBI下載了其他物種與Seali同源的蛋白質(zhì)序列, 使用Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示,MnSeali的蛋白質(zhì)序列與紫色球海膽seali基因編碼的蛋白質(zhì)序列相似度最高, 其一致性為92.41%, 而與紫色球海膽seawi基因編碼的蛋白質(zhì)序列相似度較低, 一致性為36.47%。與其他棘皮動(dòng)物的蛋白質(zhì)序列也展示了較高的一致性, 譬如:與仿刺參(Apostichopus japonicus)Seali的一致性為50.83%, 與海星(Asterias rubens)Piwi-1和Piwi-2的一致性分別為40.31%和54.87%。但是與脊椎動(dòng)物如斑馬魚和人的PIWI則展現(xiàn)出較低的同源性, 其一致性分別為39.12%和37.96%。但是, 其PIWI結(jié)構(gòu)域, 無論是在脊椎動(dòng)物還是在棘皮動(dòng)物中均展現(xiàn)出較為穩(wěn)定的一致性(46.22%—65.55%)?；诙嘀匦蛄斜葘?duì)結(jié)果, 利用MEGA7構(gòu)建了neighbor-joining(NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹, 如圖2所示: 光棘球海膽Seali蛋白先與同屬棘皮動(dòng)物門的紫色球海膽Seali蛋白聚類, 之后與海星的Piwi-2蛋白聚類, 再與紫色球海膽的Seawi蛋白和海星的Piwi-1蛋白聚類,說明Seali/Piwi-2蛋白和Seawi/Piwi-1蛋白應(yīng)是同屬PIWI亞家族蛋白的兩種不同基因, 其聚類結(jié)果與物種親緣關(guān)系基本一致。

2.3 Mnseali組織表達(dá)特異性分析

如圖3所示, 在光棘球海膽的性腺、腸、體腔細(xì)胞和管足四種組織中均檢測(cè)到了seali轉(zhuǎn)錄本。Mnseali在性腺中表達(dá)量最高, 且在精巢和卵巢中呈現(xiàn)差異表達(dá), 在卵巢中表達(dá)量是精巢中表達(dá)量的1.95倍, 所用海膽性腺均為生長期(Stage Ⅱ)。在其他成體組織中也有表達(dá), 其相對(duì)表達(dá)量從高到低依次為: 體腔細(xì)胞＞管足＞腸。

2.4 Mnseali在不同性腺發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

考慮到Mnseali在性腺中表達(dá)量最高, 通過持續(xù)取樣, 我們獲得了處于不同性腺發(fā)育時(shí)期的性腺樣品: 恢復(fù)期(Stage Ⅰ)、生長期(Stage Ⅱ)、成熟前期(Stage Ⅲ)和成熟期(Stage Ⅳ)。隨后利用熒光定量PCR檢測(cè)Mnseali在性腺發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。如圖4所示, 隨卵母細(xì)胞的成熟,Mnseali基因的表達(dá)量逐漸升高, 在成熟期卵巢中其表達(dá)量達(dá)到峰值。而在雄性個(gè)體中, 處于恢復(fù)期、生長期及成熟前期的精巢中Mnseali基因的表達(dá)量并無顯著變化, 而到了成熟期, 其表達(dá)量顯著上調(diào), 是恢復(fù)期表達(dá)量的2.05倍。

隨后, 我們進(jìn)一步通過RNA切片原位雜交技術(shù)分析Mnseali基因在性腺中細(xì)胞定位, 如圖5所示,在卵巢,Mnseali在不同發(fā)育時(shí)期的雌性生殖細(xì)胞中均有表達(dá)。精巢中,Mnseali在除了成熟精子外的雄性生殖細(xì)胞中均有表達(dá), 在營養(yǎng)細(xì)胞中未檢測(cè)到Mnseali陽性信號(hào), 且其表達(dá)情況與熒光定量結(jié)果相似。

圖1 MnSeali蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 1 Prediction of the MnSeali protein domain and protein tertiary structure

圖2 MnSeali系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of MnSeali

2.5 Mnseali在胚胎發(fā)育時(shí)期及早期個(gè)體發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平分析

如圖6所示,Mnseali基因?yàn)槟冈匆蜃? 在未受精卵中即檢測(cè)到了Mnseali轉(zhuǎn)錄本, 在四胞、囊胚、棱柱幼蟲、四腕、六腕及八腕幼體中可持續(xù)檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本, 且逐漸降低, 此結(jié)果與之前報(bào)道的紫色球海膽胚胎發(fā)育時(shí)期piwi基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)大致吻合。

圖3 Mnseali組織表達(dá)特異性分析(以精巢為參照)Fig. 3 Mnseali expression in adult tissues (Relative fold to testis)

圖4 Mnseali在不同性腺發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析(以恢復(fù)期為參照)Fig. 4 Dynamic expression analysis of Mnseali in different stages of gonadal (Relative fold to stage Ⅰ)

圖5 切片原位雜交分析Mnseali在不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)情況Fig. 5 SISH analyses of Mnseali transcripts at different stages of gonadal

圖6 Mnseali在胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析(以受精卵為參照)Fig. 6 Expression analysis of Mnseali in embryonic samples(Relative fold to egg)

3 討論

本研究利用同源性克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增首次獲得光棘球海膽Mnseali基因的全長cDNA序列, 該序列共編碼954個(gè)氨基酸。經(jīng)氨基酸序列多重比對(duì)分析, 不同物種間Seali氨基酸序列的差異較大, 其一致性為37.96%—92.41%。但是其PIWI結(jié)構(gòu)域在不同物種間的一致性差異并不大(46.22%—65.55%), 這與之前報(bào)道的研究結(jié)果基本一致[2]。此外,Mnseali和紫色球海膽seali基因的氨基酸序列相似度極高, 其一致性高達(dá)92.41%, 且系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明, 光棘球海膽seali基因與紫色球海膽seali基因聚為一支, 以上結(jié)果表明seali基因的進(jìn)化符合光棘球球海膽的進(jìn)化和分類地位。

在光棘球海膽中,seali不僅在性腺組織的生殖細(xì)胞中表達(dá), 還在其他成體組織, 如體腔液、管足、腸中也有表達(dá), 這種表達(dá)模式與產(chǎn)自大西洋西部的綠海膽(L. variegatus)表達(dá)情況相似[10]。在紫色球海膽中,seali也呈廣泛表達(dá)狀態(tài)[18]。但是, 在其他大多數(shù)脊椎動(dòng)物中, 如非洲爪蟾(Xenopus)、斑馬魚、小鼠中,piwi均在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)[5—8,19]。海膽中seali這種特殊的表達(dá)模式意味著seali可能在進(jìn)化的過程中發(fā)生了功能歧化, 其除海膽生殖細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮作用外, 可能還有其他尚不明確的生物學(xué)功能。

與脊椎動(dòng)物中一樣,Mnseali為母源因子, 在囊胚期以前的胚胎中均可以檢測(cè)到大量的轉(zhuǎn)錄本。隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行,Mnseali持續(xù)表達(dá)。無論是在精巢還是在卵巢中,seali均在生殖細(xì)胞中特異表達(dá),這一結(jié)果與絕大多數(shù)物種piwimRNA在生殖細(xì)胞中特異表達(dá)一致。在雌性光棘球海膽個(gè)體中, 隨著卵母細(xì)胞的成熟seali基因表達(dá)量逐步上調(diào), 這暗示著seali可能和光棘球海膽卵母細(xì)胞的成熟有關(guān)。在成熟期精巢中seali的表達(dá)量上調(diào), 推測(cè)在光棘球海膽中seali可能與精子的發(fā)生相關(guān)[21,22]。因此,Mnseali有望作為光棘球海膽生殖細(xì)胞標(biāo)記因子, 追蹤光棘球海膽生殖細(xì)胞的起源、遷移以及性腺的分化, 為海膽生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的研究提供了支撐。