骨碎補(bǔ)總黃酮對去勢大鼠骨質(zhì)疏松的防治作用

王永勝 胡菁菁 盧育南 鐘凱龍

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)異常及骨骼脆性增加并容易發(fā)生骨折為基本特征的代謝性骨病[1]。當(dāng)人體內(nèi)的成骨或破骨細(xì)胞因發(fā)生數(shù)量和功能異常變化時(shí)，骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡則會被打破[2]，引起骨組織生理代謝發(fā)生變化最終引起骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）。絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥是一種嚴(yán)重危害健康的代謝性骨病，主要?dú)w咎于人體雌激素水平的降低[3]。當(dāng)前骨質(zhì)疏松的臨床治療方法較多[4]，中藥的治療尤其突出[5]。骨碎補(bǔ)總黃酮（rhizoma drynariae total flavones，RDTF）從骨碎補(bǔ)根莖中提取獲得，已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)RDTF 對OP 防治作用及可能作用機(jī)制[6]。本實(shí)驗(yàn)在成功制備去勢誘導(dǎo)的OP 動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，觀察RDTF 對卵巢去勢誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度和組織形態(tài)學(xué)的影響。為今后進(jìn)一步其機(jī)制研究提供有力支持。

1 藥品、動(dòng)物及試劑材料與方法

1.1 一般材料

本研究起止時(shí)間為2018 年10 月—2020 年1 月，選擇3 月齡斯普拉格道利（sprague dawley，SD）大鼠50只，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，雌性大鼠，體質(zhì)量（180±16）g，購于上海克萊勒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。強(qiáng)骨膠囊（有效成分0.142 g，批號：181101，北京歧黃制藥有限公司）。包埋機(jī)（BMJ-A，常州中威電子儀器），顯微鏡（BA210T，Motic）， DXA（Norland-XR36）。

1.2 研究方法

隨機(jī)分三組：Sham 組、OP 組、RDTF 組（每組7 只）。予10%水合氯醛（CAS: 302-17-0，含量99.5%；規(guī)格：250 g；生產(chǎn)廠家：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）0.3 mL/100 g 劑量深度麻醉，手術(shù)切除OP 組和給藥組大鼠雙側(cè)卵巢，假手術(shù)（Sham-operated，Sham）組只切除腹腔中少量軟組織和脂肪。術(shù)后飼養(yǎng)3 個(gè)月后給藥干預(yù)，Sham 組和OP 組蒸餾水灌胃。RDTF 組按0.054 g/（kg·d）劑量灌胃。連續(xù)給藥3 個(gè)月。取材前禁食24 h，麻醉后手術(shù)暴露其股骨頭，用潔凈咬骨鉗將其鉗碎，用無菌eppendorf（EP）管收集并標(biāo)記。

1.3 觀察指標(biāo)

骨密度（bone mineral density，BMD）檢測，大鼠麻醉后，正位放置定位板，四肢伸展。應(yīng)用DXA 采用小動(dòng)物模式掃描，測量各組大鼠左側(cè)股骨BMD。

1.4 HE 染色

圖1 大鼠股骨BMD 掃描圖（左）；大鼠股骨組織切片（HE 染色，×100）（右）

大鼠股骨組織剪碎成約3 mm，4%多聚甲醛液（pH=7.4）4℃固定48 h。使用10%EDTA-2Na（PH =7.4）在4℃條件下脫鈣一個(gè)月，脫鈣液每周更換一次。脫鈣結(jié)束，石蠟包埋連續(xù)切片。切片的厚度約4 μm，置65℃的恒溫烘箱中烤6 h。將組織切片常規(guī)脫蠟染色制片。光鏡下觀察HE 染色情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度檢測

OP 組 大 鼠 股 骨BMD 值（0.366±0.033）mg/cm2顯 著 低 于Sham 組（0.465±0.008）mg/cm2（P ＜0.05），表明造模成功。RDTF 組骨密度（0.400±0.048）mg/cm2顯著高于OP 組。

2.2 大鼠股骨組織HE 染色

如圖1，Sham 組大鼠股骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，骨髓腔中央可見骨細(xì)胞，骨小梁粗細(xì)一致，無斷裂現(xiàn)象，骨小梁之間間隙較小且相互連接形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。OP 組大鼠，骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，骨小梁細(xì)小而松散，間距增大，骨小梁間連接點(diǎn)較少，分布稀疏且凌亂，游離末端增加，骨髓腔融合較嚴(yán)重，呈現(xiàn)出骨質(zhì)疏松典型性病理形態(tài)學(xué)改變。與OP 組相比較，骨小梁數(shù)量增多，骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠股骨組織可見增厚的骨小梁，其連接點(diǎn)也增多。

3 討論

OP 是一種易于發(fā)生骨折的全身性骨骼病，其特征為骨的微觀結(jié)構(gòu)退化、骨量減少、以及骨脆性增加、松質(zhì)骨中骨小梁數(shù)量減少體積變小[7]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎主骨”，骨碎補(bǔ)味苦入腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、養(yǎng)傷止痛之功效，臨床上廣泛應(yīng)用于腎虛腰痛、跌打骨傷[8]。骨碎補(bǔ)其主要成分有β-谷甾醇等黃酮類物質(zhì)、PYD 等[9]。

本研究使用的有效成分RDTF，運(yùn)用DXA 觀察其對OP 模型骨密度影響，結(jié)果顯示，RDTF 可顯著提高大鼠BMD。HE染色鏡下見OP 組股骨骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較不完整，骨小梁斷裂、丟失嚴(yán)重，骨小梁間連接點(diǎn)減少，游離末端變多，呈凌亂稀疏樣分布，間距擴(kuò)大，骨髓腔嚴(yán)重融合，呈典型性骨質(zhì)疏松病理形態(tài)學(xué)改變，提示造模成功。在持續(xù)給予RDTF 12 周后，該組骨小梁變厚，斷裂減少，連接點(diǎn)增多，排列趨規(guī)則，表明RDTF 可顯著改善OP[10]。目前骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物如 BGP、BALP、PTH 等廣泛應(yīng)用于臨床診療、研究中[11]，結(jié)合BMD，獲悉骨轉(zhuǎn)換動(dòng)態(tài)，在評價(jià)抗骨質(zhì)疏松的治療療效等方面具有重要作用[12]。

綜上所述，骨碎補(bǔ)總黃酮對去勢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松具有明顯的防治作用。但其相應(yīng)地作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。