薄荷McHD-Zip3基因的克隆及其調(diào)控腺毛發(fā)育的功能分析

陳澤群，亓希武，房海靈，于 盱，李 莉，梁呈元

〔江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)江蘇省植物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014〕

薄荷(MenthacanadensisLinn.)隸屬于唇形科(Lamiaceae)薄荷屬(MenthaLinn.)，為多年生草本植物，其干燥地上部分可入藥，具有疏散風(fēng)熱和清利頭目之效，可用于治療風(fēng)熱感冒、口瘡和胸脅脹悶等[1]。薄荷精油是薄荷的主要藥用成分，而腺毛是生成精油的“生物工廠”[2]。薄荷腺毛為多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可分為分泌型腺毛和非分泌型腺毛2類，前者包括頭狀腺毛和盾狀腺毛，其中盾狀腺毛是薄荷精油合成、分泌和貯存的重要場(chǎng)所[3-4]。

腺毛的生長(zhǎng)和發(fā)育受基因調(diào)控，且關(guān)于單細(xì)胞表皮毛的起始和發(fā)育研究較為深入[5-6]。從模式植物擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.〕中已鑒定獲得70多種與表皮毛相關(guān)的突變體，涉及30多個(gè)基因，其中，由3類轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的復(fù)合體MYB-bHLH-WD40對(duì)單細(xì)胞表皮毛的發(fā)育具有重要的調(diào)控作用[6]。相對(duì)于單細(xì)胞表皮毛，研究者對(duì)多細(xì)胞表皮毛的發(fā)育調(diào)控研究尚不全面，目前報(bào)道的調(diào)控基因主要包括2類：一類是以金魚草(AntirrhinummajusLinn.)MYB家族轉(zhuǎn)錄因子MIXTA為代表的同源基因[7-9]；另一類為同源異型-亮氨酸拉鏈(Homeodomain-leucine zipper，HD-Zip)家族轉(zhuǎn)錄因子基因[10-12]。

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子家族屬于Homeobox蛋白家族，是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[13]。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子由DNA-同源結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)組成，其中，DNA-同源結(jié)構(gòu)域由60個(gè)氨基酸殘基組成，主要與DNA特異性結(jié)合；亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)由35～42個(gè)氨基酸殘基組成，主要介導(dǎo)蛋白二聚體的形成[14-16]。HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)其基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系，可分為4個(gè)亞家族，即HD-Zip Ⅰ、HD-Zip Ⅱ、HD-Zip Ⅲ和HD-Zip Ⅳ，主要參與生物和非生物脅迫響應(yīng)、細(xì)胞分化、生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成等生物過程[17]。其中HD-Zip Ⅳ亞家族的基因在植物的表皮細(xì)胞中特異表達(dá)，主要參與調(diào)控表皮細(xì)胞分化、根生長(zhǎng)和毛狀體形成等[18]。在HD-Zip Ⅳ亞家族中，有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物腺毛的發(fā)育，例如：番茄(SolanumlycopersicumLinn.)的woolly基因可以調(diào)控番茄Type Ⅰ類型腺毛的起始和發(fā)育[19]；黃花蒿(ArtemisiaannuaLinn.)的AaHD1基因可以增加黃花蒿腺毛的密度，且其AaMIXTA1和AaHD8基因還能夠形成復(fù)合體，共同調(diào)控腺毛的發(fā)生和發(fā)育[12，20]；黃瓜(CucumissativusLinn.)的CsGL3基因?qū)象w多細(xì)胞腺毛的發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用[21]。

作為合成精油的重要場(chǎng)所，腺毛的發(fā)育對(duì)薄荷精油的合成和積累具有重要作用。為探索HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子在薄荷腺毛發(fā)育過程中的功能，進(jìn)一步解析其腺毛發(fā)育的分子機(jī)制，作者依據(jù)前期對(duì)薄荷轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果[22]，從薄荷中克隆獲得1個(gè)HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子基因，對(duì)其序列特性、組織表達(dá)特性、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行分析，并通過該基因在煙草(NicotianatabacumLinn.)中的過表達(dá)，分析其對(duì)煙草腺毛發(fā)育的影響，以期為薄荷腺毛發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試薄荷品種‘68-7’由上海日用化學(xué)工業(yè)研究所選育，保存于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所薄荷種質(zhì)資源圃中。于2018年4月，分別選取薄荷植株上生長(zhǎng)狀態(tài)良好的幼葉、老葉、莖和根，每3株的各組織樣品分別混合均勻，共取樣3組，記為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。供試樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃條件下保存、備用。

供試煙草品種‘K326’和本氏煙草(NicotianabenthamianaDomin)種子由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，煙草種子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇表面消毒1 min后置于MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，長(zhǎng)至苗高8 cm左右時(shí)，用于遺傳轉(zhuǎn)化；本氏煙草種子直接播種于營(yíng)養(yǎng)土中，生長(zhǎng)1個(gè)月后用于侵染實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成 稱取薄荷不同組織樣品各1 g，置于液氮中研磨，采用RNAiso Plus試劑〔寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司〕提取總RNA，并采用NanoDrop 1000微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。取1 μg總RNA，用RT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，具體的操作過程詳見試劑盒使用說明書。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)前期對(duì)薄荷轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果[22]，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并以上述薄荷cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積25.0 μL，包含金牌Mix 22.0 μL、模板cDNA 1.0 μL、10 μmol·L-1上游和下游引物各1.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 °C預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸35 s，共35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，切取目標(biāo)條帶，用DNA凝膠回收試劑盒(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)純化回收；連接至pClone007 Blunt Simple Vector載體(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆，交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用BioEdit軟件對(duì)克隆獲得的McHD-Zip3基因序列進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼區(qū)預(yù)測(cè)和氨基酸翻譯；使用ExPASy網(wǎng)站(http：∥web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)預(yù)測(cè)該基因編碼的氨基酸序列的理論相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)；使用NCBI網(wǎng)站BLAST程序(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.)對(duì)該基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)搜索；使用SMART網(wǎng)站(http：∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)該基因編碼的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域；使用Clustal X軟件對(duì)McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子與其他植物的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多重比對(duì)；基于McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子和其他植物的HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，使用MEGA 4.0軟件，采用Neighbor-joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)樹。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)McHD-Zip3基因序列設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的引物，以薄荷肌動(dòng)蛋白基因McActin為內(nèi)參基因[22]設(shè)計(jì)用于qRT-PCR的引物(表1)，以薄荷各組織cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系總體積20.0 μL，包含SYBR?PremixExTaqTMⅡ 10.0 μL、cDNA模板2.0 μL、10 μmol·L-1上游和下游引物各0.4 μL、去離子水7.2 μL。使用qTOWER 2.2熒光定量PCR儀(德國(guó)Analytik Jena公司)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性5 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃采集熒光信號(hào)。使用2-ΔΔCT法[23]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 亞細(xì)胞定位 根據(jù)植物表達(dá)載體p35SGK-GFP以及McHD-Zip3基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，使用同源重組試劑盒TreliefTMSoSoo Cloning Kit(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，并采用同源重組的方法[24]將McHD-Zip3基因的編碼序列與綠色熒光蛋白(GFP)的編碼序列融合，構(gòu)建用于亞細(xì)胞定位的重組載體p35SGK-McHD-Zip3-GFP(其中McHD-Zip3基因不包含終止密碼子)；將重組載體和對(duì)照載體p35SGK-GFP分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，之后挑取單克隆在YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達(dá)到約0.6；收集菌體重懸后分別侵染本氏煙草葉片，培養(yǎng)2 d后，使用LSM710型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)觀察本氏煙草葉片中的熒光信號(hào)并拍照記錄。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄激活檢測(cè) 使用酵母細(xì)胞分析McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性，根據(jù)DNA-BD載體pGBKT7和McHD-Zip3基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，使用同源重組試劑盒TreliefTMSoSoo Cloning Kit(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)構(gòu)建重組載體pGBKT7-McHD-Zip3。用重組載體和空載體pGBKT7(對(duì)照)分別轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞，并在SD/-Trp培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，之后分別在SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade(+3AT)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4 d后觀察其生長(zhǎng)狀況。采用含有β-半乳糖苷酶的菌落印跡法[25]進(jìn)行LacZ活性檢測(cè)，有轉(zhuǎn)錄激活作用的酵母菌株會(huì)激活LacZ基因并產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，分解X-Gal產(chǎn)生5-溴-4-氯靛藍(lán)，酵母細(xì)胞被染為藍(lán)色。

表1 用于薄荷McHD-Zip3基因克隆和功能研究的引物及其序列

Table 1 Primers and their sequences used for cloning and function study ofMcHD-Zip3gene ofMenthacanadensisLinn.

引物 Primer序列(5′→3′)1) Sequence (5′→3′)1)用途 ApplicationMcHD-Zip3-FATGGAGAATCTTGGAGAGATGG基因克隆Gene cloningMcHD-Zip3-RTCAGTTGCATTGAAGCCCAGqMcHD-Zip3-FCCACCTGGCATCGTCTT實(shí)時(shí)熒光定量PCR Real-time quantitative PCRqMcHD-Zip3-RGCTGCTCTGGCTCACATqMcActin-FCCAGGAATTGCTGATAGGATGAG實(shí)時(shí)熒光定量PCR Real-time quantitative PCRqMcActin-RGCGCCACCACCTTAATCTTCMcHD-Zip3-SL-FTGGAGAGGACAGGGTACCATGGAGAATCTTGGAGAGATGG亞細(xì)胞定位Subcellular localizationMcHD-Zip3-SL-RCTTGCTCACCATGGATCCGTTGCATTGAAGCCCAGCTMcHD-Zip3-TA-FGAGGAGGACCTGCATATGATGGAGAATCTTGGAGAGATGG轉(zhuǎn)錄激活檢測(cè)Transcriptional activation detectionMcHD-Zip3-TA-RACGGATCCCCGGGAATTCTCAGTTGCATTGAAGCCCAGMcHD-Zip3-OE-FCGGGATCCATGGAGAATCTTGGAGAGATGGMcHD-Zip3-OE-RACGCGTCGACTCAGTTGCATTGAAGCCCAG煙草細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化Genetic transformation of Nicotiana tabacum cell

1)下劃線字母表示同源臂堿基，斜體字母表示酶切位點(diǎn)The underlined letters represent the bases of homologous arm，and the italic letters represent the restriction sites.

1.2.7McHD-Zip3基因過表達(dá)煙草 根據(jù)植物表達(dá)載體p35SGK和McHD-Zip3基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，利用雙酶切(選擇BamHⅠ和SalⅠ)的方法將McHD-Zip3基因編碼序列插入植物表達(dá)載體p35SGK中，構(gòu)建用于遺傳轉(zhuǎn)化的重組載體p35SGK-McHD-Zip3。將重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，之后挑取單克隆在YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600達(dá)到約0.6，收集菌體后用MS鹽溶液重懸，用葉盤轉(zhuǎn)化法[26]轉(zhuǎn)化煙草葉片。利用抗生素、GUS染色和分子檢測(cè)篩選陽(yáng)性植株移栽至花盆中，待煙草植株開花結(jié)實(shí)后收集種子，與野生型煙草同時(shí)播種，觀察植株生長(zhǎng)過程中葉片表面腺毛的變化；待煙草幼苗長(zhǎng)至4枚葉片時(shí)，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1%鹽基品藍(lán)染料對(duì)葉片表皮腺毛進(jìn)行染色，然后置于Nikon ECLIPSE50i顯微鏡(日本Nikon公司)和Nikon SMZ1000體視顯微鏡(日本Nikon公司)下觀察煙草葉片腺毛發(fā)育狀況。

2 結(jié)果和分析

2.1 McHD-Zip3基因的克隆和生物信息學(xué)分析

對(duì)McHD-Zip3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1，該基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列見圖2。分析結(jié)果顯示：以薄荷cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1條長(zhǎng)度約2 200 bp的條帶(圖1)，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證和分析，將該基因命名為McHD-Zip3。該基因編碼區(qū)(CDS)全長(zhǎng)2 226 bp，其編碼的氨基酸序列有741個(gè)氨基酸殘基(圖2)。另外，該基因編碼的氨基酸序列的理論相對(duì)分子質(zhì)量為81 375.67，理論等電點(diǎn)為pI 5.92。

將McHD-Zip3基因編碼的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，獲得其同源基因序列，并進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示：McHD-Zip3基因編碼的氨基酸序列與一串紅(SalviasplendensKer-Gawl.)的SsHD-Zip基因(TEY86230.1)、芝麻(SesamumindicumLinn.)的SiANL2基因(XP_011076208.1)、猴面花(ErythrantheguttataFisch.ex DC.)的EgANL2基因(XP_012852238.1)、漸狹葉煙草(NicotianaattenuataTorrey ex S.Watson)的NaANL2-like基因(XP_019251816.1)和小粒咖啡(CoffeaarabicaLinn.)的CaANL2-like基因(XP_027110364.1)編碼的氨基酸序列具有一定的序列相似性，且McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子與一串紅SsHD-Zip轉(zhuǎn)錄因子的序列相似度最高，為82.57%。這些基因所編碼的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列都具有保守的Homeodomain、bZip motif、START domain和SAD domain，均為HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子共有的結(jié)構(gòu)域和基序，McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子與其他植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域序列較為保守，表明他們可能具有類似的功能。

M：DNA marker；1：McHD-Zip3.

圖1 薄荷McHD-Zip3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR amplification result ofMcHD-Zip3gene ofMenthacanadensisLinn.

*：終止密碼子Stop codon.

Mc：薄荷MenthacanadensisLinn.；Ss：一串紅SalviasplendensKer-Gawl.；Si：芝麻SesamumindicumLinn.；Eg：猴面花ErythrantheguttataFisch.ex DC.；Na：漸狹葉煙草NicotianaattenuataTorrey ex S.Watson；Ca：小?？Х菴offeaarabicaLinn.

圖3 薄荷McHD-Zip3基因編碼的氨基酸序列與其他植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果

Fig.3 Multiple alignment result of amino acid sequence encoded byMcHD-Zip3gene ofMenthacanadensisLinn.with that of HD-Zip transcription factor of other plants

對(duì)McHD-Zip3基因編碼的氨基酸序列與其他植物的腺毛發(fā)育相關(guān)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果(圖4)表明：McHD-Zip3基因編碼的氨基酸序列與黃花蒿的AaHD1[12](KU744599)、AaHD7[12](KU744600)和AaHD8[20](KX465135)，以及番茄Slwoolly[27](JF518780)、黃瓜CsGL3[21](XP_004134971.1)和甜瓜(CucumismeloLinn.)CmGL[11](XP_008439968.1)等與植物腺毛發(fā)育相關(guān)的HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子聚為同一支，均屬于HD-Zip Ⅳ亞家族，其中McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子與黃花蒿AaHD7轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系最近。

At：擬南芥ArabidopsisthalianaLinn.；Aa：黃花蒿ArtemisiaannuaLinn.；Sl：番茄SolanumlycopersicumLinn.；Cs：黃瓜CucumissativusLinn.；Cm：甜瓜CucumismeloLinn.；Mc：薄荷MenthacanadensisLinn.

圖4 薄荷McHD-Zip3基因編碼的氨基酸序列與其他植物HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的系統(tǒng)樹

Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid sequence encoded byMcHD-Zip3gene ofMenthacanadensisLinn.and that of HD-Zip transcription factor of other plants

2.2 McHD-Zip3基因的組織表達(dá)特性

薄荷不同組織中McHD-Zip3基因的相對(duì)表達(dá)量見圖5。結(jié)果顯示：老葉中McHD-Zip3基因的相對(duì)表達(dá)量最高，根中該基因的相對(duì)表達(dá)量最低，且幼葉和老葉中McHD-Zip3基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于莖和根，而該基因在莖中的相對(duì)表達(dá)量也顯著高于根。

2.3 McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性

2.3.1 亞細(xì)胞定位 亞細(xì)胞定位結(jié)果(圖6)顯示：在轉(zhuǎn)化對(duì)照載體(35S：GFP)的表皮細(xì)胞中，整個(gè)細(xì)胞中均能觀察到熒光信號(hào)；而在轉(zhuǎn)化重組載體(35S：McHD-Zip3-GFP)的表皮細(xì)胞中，僅在細(xì)胞核中觀察到熒光信號(hào)，表明McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中，為核定位蛋白，這與該類轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中行使調(diào)控功能相一致。

組織 Tissue

不同的小寫字母表示在0.05水平上差異顯著Different lowercases indicate the significant difference at 0.05 level.

圖5 薄荷不同組織中McHD-Zip3基因的相對(duì)表達(dá)量比較

Fig.5 Comparison on relative expression ofMcHD-Zip3gene in different tissues ofMenthacanadensisLinn.

A：轉(zhuǎn)化對(duì)照載體(35S：GFP)的表皮細(xì)胞 The epidermal cells of transformed control vector(35S：GFP)；B：轉(zhuǎn)化重組載體(35S：McHD-Zip3-GFP)的表皮細(xì)胞 The epidermal cells of transformed recombinant vector(35S：McHD-Zip3-GFP).1：綠色熒光視野Green fluorescence field；2：明視野Bright field；3：重合視野Merged field.

圖6 薄荷McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子在本氏煙草表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位結(jié)果

Fig.6 Subcellular localization result of McHD-Zip3 transcription factor ofMenthacanadensisLinn.in epidermal cells ofNicotianabenthamianaDomin

2.3.2 轉(zhuǎn)錄激活活性 利用酵母系統(tǒng)檢測(cè)McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)化重組載體pGBKT7-McHD-Zip3的酵母細(xì)胞能在SD/-Trp一缺培養(yǎng)基和SD/-Trp/-His/-Ade三缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，均能使酵母細(xì)胞呈現(xiàn)出藍(lán)色；而轉(zhuǎn)化空載體pGBKT7(對(duì)照)的酵母細(xì)胞只能在SD/-Trp一缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，不能使酵母細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，表明McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

A：酵母細(xì)胞生長(zhǎng)情況Growing of yeast cells；B：LacZ活性檢測(cè)Activity detection ofLacZ.1：SD/-Trp培養(yǎng)基 Culture medium of SD/-Trp；2：SD/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基Culture medium of SD/-Trp/-His/-Ade.培養(yǎng)皿左半邊和右半邊分別為轉(zhuǎn)化空載體pGBKT7(對(duì)照)和重組載體pGBKT7-McHD-Zip3的酵母細(xì)胞The left half and right half of culture dish are yeast cells transformed the empty vector pGBKT7(the control)and the recombinant vector pGBKT7-McHD-Zip3，respectively.

圖7 薄荷McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性分析結(jié)果

Fig.7 Analysis result of transactivation activity of McHD-Zip3 transcription factor ofMenthacanadensisLinn.

2.4 McHD-Zip3轉(zhuǎn)基因煙草的腺毛發(fā)育狀況

野生型煙草與McHD-Zip3轉(zhuǎn)基因煙草的葉片腺毛發(fā)育狀況比較結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示：與野生型煙草相比，McHD-Zip3轉(zhuǎn)基因煙草葉片的腺毛密度明顯增加，說明McHD-Zip3基因能夠在煙草葉片表皮細(xì)胞中過表達(dá)，具有促進(jìn)煙草腺毛發(fā)育的功能。

1，3：野生型植株的葉片 Leaf of wild type individual；2，4：McHD-Zip3轉(zhuǎn)基因植株的葉片 Leaf ofMcHD-Zip3transgenic individual.

圖8 野生型煙草與McHD-Zip3轉(zhuǎn)基因煙草的葉片腺毛發(fā)育狀況比較

Fig.8 Comparison on development of glandular trichomes on leaf between wild typeNicotianatabacumLinn.andMcHD-Zip3transgenicN.tabacum

3 討論和結(jié)論

HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，不同亞家族的保守結(jié)構(gòu)域有所不同，其中HD-Zip Ⅰ亞家族含有保守的Homeodomain和bZip motif[28]；HD-Zip Ⅱ亞家族除含有保守的Homeodomain和bZip motif外，其C端還含有1個(gè)CPSCE motif[29]；HD-Zip Ⅲ亞家族含有Homeodomain、bZip motif、START domain、SAD domain以及C端的MEKHLA motif[30]；HD-Zip Ⅳ亞家族與HD-Zip Ⅲ亞家族類似，但其C端缺少M(fèi)EKHLA motif[31]。作者從薄荷中克隆獲得1個(gè)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子編碼基因McHD-Zip3，該基因編碼的氨基酸序列含有Homeodomain、bZip motif、START domain和SAD domain，符合HD-Zip Ⅳ亞家族的特征，其中，Homeodomain參與DNA的結(jié)合，而bZip motif參與蛋白質(zhì)二聚體的形成[17]。研究表明：McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性，但HD-Zip Ⅳ亞家族行使轉(zhuǎn)錄激活功能的結(jié)構(gòu)域仍存在爭(zhēng)議。相關(guān)研究表明：在玉米(ZeamaysLinn.)的HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子OCL1中，其START domain N端的85個(gè)氨基酸是其轉(zhuǎn)錄激活活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，但是完整的START domain卻不具有轉(zhuǎn)錄激活活性[32]。因此，START domain可能同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制激活的功能，而HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性可能是多個(gè)結(jié)構(gòu)域共同作用的結(jié)果。

HD-Zip Ⅳ亞家族基因可在植物表皮細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)表皮細(xì)胞的分化有重要的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明：McHD-Zip3基因在薄荷的嫩葉和老葉中表達(dá)水平均較高，說明該基因可能主要在葉片中行使功能。HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子是已知調(diào)控多細(xì)胞腺毛發(fā)育的最重要的一類轉(zhuǎn)錄因子。在黃花蒿中，響應(yīng)茉莉酸信號(hào)的HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子AaHD1能夠促進(jìn)腺毛發(fā)生并顯著增加葉片表皮腺毛密度[12]，且多個(gè)HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子存在級(jí)聯(lián)調(diào)控，如AaHD8通過形成蛋白復(fù)合體正向調(diào)控AaHD1[20]，而AaHD1又能夠調(diào)控AaHD7[12]，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)共同調(diào)控腺毛發(fā)育。在前述的系統(tǒng)樹上，McHD-Zip3基因編碼的氨基酸序列與多種植物的腺毛發(fā)育相關(guān)HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子聚為一支，其與黃花蒿AaHD7轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系最近，且后者能夠促進(jìn)腺毛發(fā)育[12]，而薄荷腺毛與黃花蒿腺毛的結(jié)構(gòu)與功能類似，均為分泌型多細(xì)胞腺毛，表明McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)薄荷腺毛發(fā)育具有類似功能。將McHD-Zip3基因轉(zhuǎn)入煙草葉片后，該基因能夠在煙草葉片中過表達(dá)，且煙草葉片的腺毛密度明顯增加，說明McHD-Zip3轉(zhuǎn)錄因子與其他植物的腺毛發(fā)育相關(guān)的HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子具有類似功能。

綜合分析結(jié)果表明：薄荷中存在HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子編碼基因McHD-Zip3，其編碼的氨基酸序列具有HD-Zip Ⅳ亞家族轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域，定位于細(xì)胞核中，并且具有轉(zhuǎn)錄激活活性，是一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄激活子。McHD-Zip3基因在薄荷的嫩葉和老葉的表達(dá)量均較高，具有調(diào)控腺毛發(fā)育的功能。