不同急性低氧條件下SD大鼠肺肥大細胞的變化趨勢※

劉 杰，曹成珠，紀巧榮，周義玲，韓 瑩，袁周陽，張 偉

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心；高原醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室；青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，青海 西寧 810001)

低壓低氧環(huán)境是引發(fā)各種急、慢性高原病的關(guān)鍵因素[1，2]，在眾多的急性高原病中高原肺水腫(HAPE，high altitude pulmonary edema)發(fā)病率高、危害大。AHPH發(fā)生機制涉及血管反應(yīng)、神經(jīng)調(diào)控、免疫應(yīng)答、生化代謝、基因表達和分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等的異常改變[3，4]。低氧應(yīng)激下肥大細胞(Mast cells，MCs)活化、脫顆粒與肺水腫、肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)形成的研究是近期研究熱點，本研究擬探討不同急性低壓低氧條件(模擬不同海拔高度、低氧刺激時間)下SD大鼠肺水腫發(fā)生情況；肺MCs的變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的飼養(yǎng)

健康SD大鼠，72只，SPF級，雄性，體重272.96±15.88 g，由江蘇南京市青龍山動物繁殖場提供，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，合格(蘇州大學(xué)檢測)證號：201803296。大鼠運到青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)室[海拔2260m，通風飼養(yǎng)櫥，清潔；22℃；12：12晝/夜交替；自由攝取標準維持顆粒飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)、水]飼養(yǎng)1 w后隨機分組實驗。動物實驗遵循《實驗動物管理條例(2017年修訂)》。

1.2 主要儀器和試劑選擇

低壓艙(實驗動物低壓模擬艙，HCPⅢD800，西安富康空氣凈化設(shè)備工程有限公司)；HE(蘇木素-伊紅)染色試劑盒(717033，BASO珠海貝索生物技術(shù)公司)，TB染色試劑盒(D034，南京建成公司)，SP檢測試劑盒(SP9001和SP9002，中杉金橋公司)；Tryptase 抗體(ab2378，abcam公司)，Chymase抗體(ab233103，abcam公司)；戊巴比妥鈉(071025，上海泰瑞爾公司)。

1.3 實驗

1.3.1 低壓低氧實驗動物分組

大鼠隨機分成三個大組(每大組N=24)：NC組(常氧對照組，海拔2260m)，H5K組(低壓艙，模擬海拔5000m)，H7K組(低壓艙，模擬海拔7000m)，每大組分別分成四組(每組n=6)：12 h、24 h、48 h、72 h組。各組動物用苦味酸標記后，將NC組動物置于動物飼養(yǎng)室(海拔2260m)，H5K、7K各組動物分別置于低壓艙(分別模擬海拔5000m、7000m)12、24、48、72 h進行造模。

1.3.2 肺組織取材、固定、切片

采用充氣式肺循環(huán)灌注固定后取材：動物造模完成后立即用戊巴比妥鈉(50mg/kg，i.p.)麻醉[5]，采取仰臥位固定、切開頸正中處行氣管插管，給肺臟充氣(10cmH2O)，打開胸腔，剪開心包腔充分暴露心臟，剪開左心房，在右心室插管至肺動脈，用0.9% NS灌注(20cmH2O)至雙肺變白，改用4%多聚甲醛溶液灌注至雙肺變硬，結(jié)扎氣管，完整剪下雙肺浸泡在4%多聚甲醛溶液中過夜，將肺組織切成小塊(約15mm×15mm×2mm)置于4%多聚甲醛溶液浸泡，用1×PBS液洗滌后行梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片(5μm)。

1.3.3 染色、形態(tài)學(xué)觀察

石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、1×PBS浸洗后進行以下實驗：

①行常規(guī)HE染色后觀察肺組織的顯微結(jié)構(gòu)變化。②行TB染色后觀察肺組織MCs的形態(tài)、分布，計數(shù)TB陽性細胞數(shù)(每張切片隨機選取5個含肺細小動脈高倍鏡視野，計數(shù)5個視野中的MCs數(shù))。③通過IHC實驗觀察Tryptase、Chymase表達情況、觀測Tryptase、Chymase陽性細胞數(shù)量(陽性細胞計數(shù)：每張切片隨機選取5個含肺細小動脈高倍鏡視野，計數(shù)5個視野中的核藍染、胞漿黃染的Tryptase、Chymase陽性細胞數(shù))。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺組織HE染色結(jié)果

光鏡40倍下觀察，與NC組比較，H5K各組肺組織未發(fā)現(xiàn)明顯異常；H7K-12、24 h組可見肺泡間隔有增寬，H7K-48、72 h組肺泡間隔有明顯的增寬，肺泡壁腫脹，血管內(nèi)皮細胞可見明顯腫脹，肺間質(zhì)水腫程度重于H7K-12、24 h組，并偶見輕度肺泡內(nèi)肺水腫以及肺泡中出現(xiàn)RBC，見圖1。

紅色箭頭指示肺間隔變寬、滲出、內(nèi)皮細胞腫脹等病理改變情形

圖1 SD大鼠肺組織HE染色圖(40×)

Figure 1 HE Staining in different group of lung tissue in SD rats(40×)

2.2 肺組織TB染色結(jié)果

光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)NC各組肺組織中在微小血管旁偶見MCs，其體積小、數(shù)量少；低氧各組MCs數(shù)量明顯增多，細胞體積較NC組大，且H7K各組多于H5K各組，各低氧組中MCs在肺微小血管旁、氣管粘膜下間質(zhì)、肺被膜上均有分布，其形狀、大小不一，并見部分細胞有明顯的脫顆粒情況，見圖2所示，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

紅色箭頭指示肺間隔變寬、滲出、內(nèi)皮細胞腫脹等病理改變情形

圖2 SD大鼠肺組織TB染色圖(40×)

Figure 2 TB Staining in different group of lung tissue in SD rats(40×)

Table 1 Statistic number of TB positive cells in lung tissue of SD rats at different altitudes and different hypoxic times

*：與12 h比較，P<0.05；a：與CN組比較，P<0.05；b：與H5K組比較，P<0.05；c：與H7K組比較，P<0.05

通過TB陽性細胞計數(shù)并統(tǒng)計學(xué)分析：①同一低氧時間不同海拔高度間比較發(fā)現(xiàn)，TB陽性細胞數(shù)量呈現(xiàn)H7K組>H5K組>NC組的趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；②同一海拔高度不同低氧時間下NC、H5K四組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異；H7K-12 h組>H7K-24、48、72 h組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，H7K-24、48、72 h組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 肺組織IHC結(jié)果

通過IHC法觀察肺組織Tryptase和Chymase陽性細胞表達情況，Tryptase和Chymase陽性細胞均為胞漿著色，光鏡下閱片發(fā)現(xiàn)NC各組肺組織中Tryptase和Chymase陽性數(shù)量少，低氧各組Tryptase和Chymase陽性數(shù)量明顯增多，且H7K 各組多于H5K各組。Tryptase和Chymase陽性細胞在肺微小血管旁、細小支氣管旁、氣管粘膜下間質(zhì)、肺被膜上均有分布，形狀、大小、顏色深淺不一。不同組SD大鼠肺組織Tryptase和ChymaseChymase的表達圖分別見圖3、4。

圖3 不同組SD大鼠肺組織Tryptase的表達圖(40×)

Figure 3 Expression of Tryptase in lung tissue of different groups in SD rats(40×)

圖4 不同組SD大鼠肺組織Chymase的表達圖(40×)

通過Tryptase和Chymase陽性細胞計數(shù)并行統(tǒng)計學(xué)分析：①同一低氧時間不同海拔高度間比較發(fā)現(xiàn)，Tryptase和Chymase陽性細胞數(shù)量呈現(xiàn)H7K組>H5K組>NC組的趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，②同一海拔高度不同低氧時間，Tryptase和Chymase陽性細胞在各自NC四組間、H5K四組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；H7K-12 h組>H-7K24、48、72 h組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，H7K-24、48、72 h組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同海拔高度不同低氧時間SD大鼠的肺組織Tryptase、Chymase陽性細胞數(shù)目分別見表2、3。

組別n12h24h48h72hFPNC組65.33±1.975.83±2.145.72±2.325.06±2.580.100.96H5K組619.50±2.88a21.67±5.01a22.50±5.05a17.33±3.08a1.890.16H7K組659.67±5.85ab40.00±3.58ab?35.67±4.27ab?34.33±4.84ab?37.330.00F 307.94 124.02 81.89 96.52 - -P 0.00 0.00 0.00 0.00 - -

*：與12 h比較，P<0.05；a：與CN組比較，P<0.05；b：與H5K組比較，P<0.05；c：與H7K組比較，P<0.05

Groupn12h24h48h72hFPNC組65.00±1.415.50±2.076.33±3.506.33±2.500.420.74H5K組617.50±3.9418.17±4.8316.50±1.8719.17±3.870.530.67H7K組647.83±5.85ab33.50±3.08ab?34.00±3.90ab?32.67±6.38ab?12.650.00F 169.03 95.21 113.84 50.42 - -P 0.00 0.00 0.00 0.00 - -

*：與12 h比較，P<0.05；a：與CN組比較，P<0.05；b：與H5K組比較，P<0.05；c：與H7K組比較，P<0.05

將TB染色、Tryptase和Chymase 的IHC結(jié)果分別做同一低氧時間、不同海拔高度和同一海拔高度、不同低氧時間的統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果見圖5、6。

a：與CN組比較，P<0.05；b：與H5K組比較，P<0.05

圖5 同一低氧時間、不同海拔高度不同指標變化統(tǒng)計圖

Figure 5 Statistical chart of different indexes in the same hypoxia exposure time at different altitude

圖6 同一海拔高度、不同低氧時間不同指標變化統(tǒng)計圖

通過圖5、6清晰地觀察出海拔7 000 m高度、低氧刺激12 h 時SD大鼠肺組織中MCs數(shù)量最多、Tryptase和Chymase陽性細胞數(shù)最多，反映出此時MCs活性最強。

3 討論

急性低氧是導(dǎo)致AHPE發(fā)生的關(guān)鍵因素，有大量文獻認為通過實驗動物低壓模擬艙即可完成急性低壓低氧動物模型的復(fù)制，但對條件設(shè)置觀點不一。本課題組根據(jù)已有的文獻和本實驗研究中心的條件，選擇低壓艙模擬不同的海拔高度以及不同低氧持續(xù)時間開展實驗，摸索出相對合理、經(jīng)濟、可行的實驗條件。本實驗CN組動物放置于本中心動物飼養(yǎng)房內(nèi)(西寧，海拔2230m)，H5K組、H7K組實驗動物放置于低壓艙內(nèi)(H5K組：模擬海拔5000m，相對青海平均海拔含氧量為14.28%；H7K組：模擬海拔7 000 m，相對青海平均海拔含氧量為10.75%)。大鼠在不同低氧環(huán)境中持續(xù)放置12、24、48、72 h均無死亡情況。各組動物肺組織HE染色后于40倍光鏡下觀察，與CN組比較，H5K-48、72 h有輕度的肺間質(zhì)性改變；H7K各組肺泡間隔均有明顯的肺間質(zhì)型肺水腫，血管內(nèi)皮細胞腫脹，H7K-48、72 h組肺泡內(nèi)有液體及RBC滲出，發(fā)生肺泡型肺水腫并出血。經(jīng)同一時間不同海拔高度和同一海拔高度不同時間兩種方法對比觀察發(fā)現(xiàn)，H7K組肺水腫程度重于H5K組。由以上實驗結(jié)果推斷在低壓艙海拔7 000 m復(fù)制SD大鼠急性肺水腫效果優(yōu)于海拔5 000 m。

AHPE的發(fā)生機制尚不明確，從病理生理學(xué)角度認識AHPE主要涉及肺動脈壓(Pulmonary artery pressure，PAP)過度升高、肺毛細血管通透性增高和肺泡上皮對水清除障礙三方面。目前本課題組主要擬從急性低氧引發(fā)HPV(Hypoxie Pulmonary Vasoconstrietion，缺氧性肺血管收縮)導(dǎo)致PAP過度升高的角度研究AHPE的發(fā)生機制。HPV是由急性低氧應(yīng)激引發(fā)，其生理意義在于減少缺氧肺泡周圍的血流，使血液流向通氣充分的肺泡，甚至可增加肺尖部的血流，促發(fā)肺內(nèi)血流重新匹配，以保證肺換氣的高效完成，可見HPV是維持通氣/血流比(VA/Q)相適應(yīng)的自身代償性保護機制[6]，但肺動脈收縮過強會引發(fā)PAP升高和血流阻力增加，甚至微血栓的形成，成為缺氧性肺血管收縮(Hypoxie Pulmonary Vasoconstrietion，HPV)發(fā)生的重要機制。

本實驗中HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H7K組肺組織中細微動脈的內(nèi)皮細胞腫脹，由扁平形變成橢圓形、圓形，推測可能是由于急性低壓低氧刺激導(dǎo)致內(nèi)皮細胞受損、腫脹，促發(fā)細微動脈管腔變窄，進而可誘發(fā)管內(nèi)血細胞的粘附聚集，甚至發(fā)生管內(nèi)局部DIC，致血流阻力變大，引發(fā)PAP升高。甚至推測此類微小血管壁完整性遭到破壞，是導(dǎo)致急性低壓低氧大鼠肺泡間隙增寬，發(fā)生急性間質(zhì)性肺水腫、肺泡性肺水腫的原因。由此推測急性低氧刺激下內(nèi)皮細胞受損、腫脹，無肌性細微動脈管腔變窄、管壁通透性增高促進了PAH和AHPE的發(fā)生。

HAPE的發(fā)生除了高原低壓低氧引起的PAP升高以外，還與低氧應(yīng)激性免疫反應(yīng)、無菌性炎癥等發(fā)生導(dǎo)致促炎-抗炎介質(zhì)平衡失控、免疫調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)。免疫細胞中的MCs是I型變態(tài)反應(yīng)的核心細胞，是連接變態(tài)反應(yīng)誘導(dǎo)階段與效應(yīng)階段的紐帶，被確定為過敏和炎癥反應(yīng)關(guān)鍵性的受動細胞[7，8]。肺臟是MCs的主要棲居地之一，主要分布于肺血管周圍、支氣管周圍和內(nèi)壁、平滑肌及粘液腺內(nèi)等“門戶”部位，這種特殊的選擇性空間分布提示：MCs可能在肺免疫監(jiān)督方面起著重要的“哨兵”作用[9]。也有學(xué)者認為MCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等多種中介功能，對微觀環(huán)境起著 “一線微調(diào)器”作用[10]。1967年Bergofsky等提出高原低氧時血管周圍出現(xiàn)大量MCs，推測從肺泡彌散來的低濃度的O2刺激MCs，它可能是一種化學(xué)感受器，在適當?shù)慕馄饰恢蒙峡刂浦闻菅醴謮?，MCs釋放的組胺可調(diào)節(jié)肺小血管收縮，對抗低氧反應(yīng)。NovotnT等[11]研究發(fā)現(xiàn)低氧刺激MCs脫顆粒與肺血管重構(gòu)密切相關(guān)，并有明顯的時間相關(guān)性。Montani D等[12]發(fā)現(xiàn)PAH患者重塑的肺血管周圍出現(xiàn)超過50%C-Kit呈陽性的MCs，并通過釋放介質(zhì)參與PAH的發(fā)生。近年來MCs與PAH的形成機制研究得到廣泛重視，在原發(fā)或繼發(fā)的PAH模型動物的肺組織中MCs數(shù)量會增加5～6倍[13，14]，75%的MCs圍繞在肺小動脈周圍，尤其在直徑為20～50 μm的肺血管周圍聚集率較高，并有明顯的脫顆?，F(xiàn)象。MCs被譽為PAH中肺血管重構(gòu)的“催化劑”?？梢娐缘脱醮碳Cs增多促進慢性PAH發(fā)生的報道已較多，本課題組主要研究急性低壓低氧應(yīng)激下AHPE發(fā)生過程中MCs的變化。

本實驗中通過TB染色、MCs計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，低氧各組MCs數(shù)量明顯增多，MCs數(shù)量呈現(xiàn)H7K組>H5K組>NC組的趨勢，H7K-12 h組MCs數(shù)量最多，MCs在肺微小血管旁、氣管粘膜下間質(zhì)、肺被膜上分布增多，其形狀、大小不一，并見部分MCs有明顯的脫顆粒情況。

Tryptase是由MCs生成的四倍體絲氨酸蛋白酶，是MCs所特有的、含量最多的蛋白(Tryptase占MCs分泌顆粒總蛋白量的30 %～50%以上，β-Tryptase占細胞總蛋白含量的20%)，目前Tryptase已作為MCs活化和脫顆粒的特異性激活標志物，可直接反映MCs數(shù)量多少和活性程度。Chymase也是MCs主要的中性絲氨酸蛋白酶家族成員，含量占MCs總蛋白的3%以上(僅次于Tryptase)，也是MCs重要的特異性激活標志物。MCs分為兩類：一類只富含Tryptase，稱為MCT，另一類富含有Tryptase和Chymase，稱為MCTC[15]。有文獻報道，MCT增加在機體免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，MCTC可能主要參與血管生成和組織重塑[16]。本實驗通過IHC法檢測Tryptase和Chymase陽性細胞發(fā)現(xiàn)，H5K、H7K各組Tryptase和Chymase陽性細胞明顯增多，呈現(xiàn)H7K組>H5K組>NC組的趨勢，其中H7K-12 h組Tryptase和Chymase陽性細胞數(shù)目均最多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與TB染色結(jié)果相一致。由IHC實驗結(jié)果可見急性低氧刺激下SD大鼠肺組織MCs數(shù)量增多，主要是MCTC數(shù)量增多，MCs數(shù)量增加并活化脫顆粒釋放胞內(nèi)活性介質(zhì)。由低壓低氧實驗結(jié)果可推測急性低壓低氧可導(dǎo)致AHPE發(fā)生，可刺激MCs(主要是MCTC)數(shù)量增加、活化和脫顆粒，依據(jù)文獻分析本實驗MCs(主要是MCTC)數(shù)量的增加可能原因是，MCs在急性低氧刺激下發(fā)生快速募集和激活的自身放大作用，進而發(fā)生MCs活化、釋放生物活性介質(zhì)的“瀑布效應(yīng)”[17]。

Giaid等[18]研究表明，肺泡缺氧可使肺血管周圍MCs去極化，釋放血管活性物質(zhì)使肺內(nèi)微小血管收縮，這一過程與Ca2+內(nèi)流有關(guān)。本實驗發(fā)現(xiàn)急性低壓低氧刺激MCs數(shù)目增加、活性增強，發(fā)生了脫顆粒。由此實驗結(jié)果推測急性低壓低氧刺激下肺內(nèi)MCs快速募集、活化、脫顆粒釋放了胞內(nèi)的活性介質(zhì)，如5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、組胺(Histamine，His)、Chymase和腎素(Renin)等活性物質(zhì)可直接或間接收縮肺小血管。(1)5-HT：①5-HT作為一種血管收縮因子，可直接引起肺血管收縮[19]。②5-HT可加強NE(Noradrenaline，去甲腎上腺素)等物質(zhì)的縮血管效應(yīng)，使肺小血管嚴重痙攣、PAP升高和血流阻力增大，嚴重者發(fā)生肺水腫、肺出血。(2)His：是一種血管活性物質(zhì)，內(nèi)源性His具有升高PAP的作用。His與H2-R結(jié)合有擴張血管作用，能明顯增加局部血流量和血管通透性，His與肺小血管H1-R結(jié)合，迅速激活G蛋白-PLC(Phospholipase C，磷脂酶C)信號通路，觸發(fā)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高，引起肺血管收縮。(3)Chymase：Chymase是體內(nèi)最強有力、特異的血管緊張素轉(zhuǎn)化因子，可以不依賴ACE(Angiotension converting enzyme，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)促進局部Ang I轉(zhuǎn)化為Ang II，Chymase途徑是Ang I轉(zhuǎn)化成Ang II的三種途徑之一，在人體和大鼠體內(nèi)大約有70%～80%的Ang II由Chymase途徑轉(zhuǎn)化生成，激活RAAS(Renin-angiotension system，腎素-血管緊張素系統(tǒng))[20-22]。(4)Renin：肺MCs可以合成和分泌腎素到組織間隙，腎素裂解生成Ang I，Ang I在ACE、MCs來源的Chymase和/或MMP-9作用下，在局部生成Ang II。Ang II有較強的收縮血管的作用，提高肺血管緊張度，升高PAP。由此，急性低氧刺激致MCs數(shù)量增加、活化并快速爆發(fā)式脫顆粒，釋放胞內(nèi)活性介質(zhì)，進而促進肺血管收縮、PAP升高，嚴重者導(dǎo)致AHPE甚至肺出血的發(fā)生，由此也可解釋本實驗中肺水腫的發(fā)生的時間滯后于MCs增多的時間的現(xiàn)象。

本實驗結(jié)果提示低壓艙模擬海拔7 000 m高度低氧環(huán)境復(fù)制SD大鼠急性肺水腫以及促進MCs(主要是MCTC)數(shù)目增多、活性增強的效果好于海拔5 000 m，并發(fā)現(xiàn)海拔7 000 m高度12 h組MCs數(shù)量最多、活性較高。基于此實驗基礎(chǔ)，為了更進一步探討急性低氧MCs總數(shù)量和脫顆?，F(xiàn)象相對最明顯的時間，以及深入研究肺MCs在進行缺氧性PAH和AHPE發(fā)生中的作用和發(fā)生機制，可在少于低氧刺激12 h的基礎(chǔ)上再逐步減少低壓低氧暴露時間繼續(xù)進行實驗研究。