從氧感知通路的新發(fā)現(xiàn)談未來高原醫(yī)學研究的機遇※

格日力

(青海大學高原醫(yī)學研究中心，西寧 810001)

2019年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者哈佛醫(yī)學院的威廉·凱林(William G.Kaelin)、牛津大學的彼得·拉特克利夫(Peter J.Ratcliffe)和霍普金斯大學的格雷格·塞門扎(Gregg L.Semenza)教授對氧感知通路的新發(fā)現(xiàn)，使得人體如何感受氧濃度的奧秘從分子水平上破解，繼而機體在氧不足環(huán)境下的適應及不適應機制被進一步闡明。本文簡要解讀氧感知通路的相關(guān)內(nèi)容及我國在這個領(lǐng)域的研究簡況。

1 氧感知通路的研究歷程

眾所周知，氧是所有生命體能量代謝過程中必須的元素，生物體的一切生命活動都需要能量，能量的最主要來源是食物，而氧氣則是細胞將食物營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為能量不可缺少的條件。長期以來，人們致力于氧氣對人體的整體作用研究，而我們的細胞如何感知氧、適應氧的機制研究稍顯薄弱。榮獲2019生理醫(yī)學獎的三位科學家經(jīng)過27年的潛心研究，揭示了氧氣是如何在細胞之中起作用的，人體從整體水平上如何適應低氧環(huán)境變化的，從而進一步精準地解釋了有關(guān)新陳代謝、免疫及人體對于高原的適應等科學問題。三位科學家對細胞氧感知通路研究的貢獻既有相互印證，又有各自獨特的發(fā)現(xiàn)。

1.1 Semenza團隊發(fā)現(xiàn)了缺氧誘導因子-1(HIF-1)。1992年，華人學者王廣良在Semenza的實驗室從事博士后研究期間，首次克隆低氧誘導因子蛋白，隨后又分離純化和鑒定了HIF-1，明確提出HIF-1是由含有堿性螺旋—環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)的HIF-1α和HIF-1β亞單位組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子[1，2]，基因分別定位于14q21-24和lq21。1995年，王廣良和Semenza的研究證實了HIF-1是通過紅細胞和血管新生介導了機體在低氧條件下的適應性反應[3]。這些成果分別發(fā)表在生物化學(JBC)和美國科學院院刊(PNAS)等雜志，第一作者均為王廣良先生，他的工作為2019年諾貝爾生理醫(yī)學獎的獲獎成果奠定了重要基礎(chǔ)。

1.2 Ratcliffe團隊闡明了細胞如何感知低氧的機制。1993年，Ratcliffe等利用瞬時基因轉(zhuǎn)染技術(shù)研究促紅細胞生成素(EPO)基因3′(EPO 3′)的轉(zhuǎn)錄增強子，發(fā)現(xiàn)氧氣感知系統(tǒng)不僅在腎臟和肝臟細胞中存在，還在哺乳動物細胞中廣泛存在[4]。1994年，Ratcliffe發(fā)現(xiàn)了在低氧誘導下，糖酵解過程中的重要基因也出現(xiàn)了類似EPO基因被誘導表達的現(xiàn)象[5]，說明HIF-1不僅僅在機體水平上負責調(diào)控缺氧的適應，而且在細胞水平上參與調(diào)節(jié)糖酵解的速率。這個結(jié)果與Semenza團隊的工作有相似之處。

1.3 Kaelin團隊首次揭示了抑癌蛋白(VHL)的功能，發(fā)現(xiàn)了VHL蛋白可以通過氧依賴的蛋白水解作用負性調(diào)節(jié)HIF-1。Kaelin是一位臨床醫(yī)生，專攻希佩爾-林道綜合征(VHL disease)，他發(fā)現(xiàn)這類遺傳性疾病患者，由于VHL基因的突變而導致某些癌癥的發(fā)生。罹患這類腫瘤者常會有異常的新生血管形成，其血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和EPO也明顯增高。因此他自然而然地想到，缺氧通路可能參與這種疾病的發(fā)生。1999年，Kaelin在自然雜志報道了VHL基因突變與HIF基因調(diào)節(jié)之間的關(guān)系[6]。隨后Kaelin和Ratcliffe的研究發(fā)現(xiàn)了脯氨酰羥化酶(PHD)在VHL蛋白識別HIF-1的過程中發(fā)揮著重要作用，并闡明了HIF-1α的基因激活功能可受到氧氣依賴性羥基化作用的調(diào)節(jié)[7]。2001年，Kaelin團隊報道了HIF-1α在氧氣存在的情況下，PHD停止羥基化，隨后通過介導與VHL泛素蛋白連接酶復合體VHL-E3結(jié)合，致HIF-1α被降解，無法誘導低氧基因表達，從而證明機體在常氧下，降解VHL需要通過VHL與HIF-1α的相互作用實現(xiàn)[8]。

2 什么是氧感知通路

當生物體內(nèi)缺氧時細胞需要做出相應的改變，通過調(diào)整細胞內(nèi)的信號，做出積極的反應，避免缺氧造成嚴重的細胞損傷，并且努力恢復氧供應，改變?nèi)毖鯛顟B(tài)。因此，哺乳動物細胞如何感知低氧、適應低氧、恢復供氧，這就是“細胞氧感知通路”的核心。細胞對低氧的適應性調(diào)節(jié)是通過改變一系列基因表達來實現(xiàn)的。調(diào)控這些基因表達最重要的轉(zhuǎn)錄因子是低氧誘導因子-1(HIF-1)，而調(diào)節(jié)HIF-1的關(guān)鍵分子是脯氨酰羥化酶，它作為氧感受器能夠直接感受氧分壓，調(diào)節(jié)HIF-1基因表達。1992年，Semenza等從低氧處理細胞中分離到一種蛋白質(zhì)，該種蛋白廣泛存在于慢性缺氧細胞中，結(jié)合點位于EPO的3′端增強子第一部分；該蛋白質(zhì)低氧時穩(wěn)定，常氧時消失(降解)，故命名低氧誘導因子[1，8]。因此，低氧是穩(wěn)定HIF-1α的關(guān)鍵因素。那么氧究竟是如何影響HIF-1α穩(wěn)定性的呢？2001年，Kaelin和Ratcliffe等發(fā)現(xiàn)[9]，在常氧狀態(tài)下，HIF結(jié)構(gòu)域中的PHD發(fā)生羥基化，羥基化修飾后的 HIF-1α迅速與VHL蛋白結(jié)合，經(jīng)泛素-蛋白酶途徑迅速被降解，無法誘導低氧基因表達。但在低氧狀態(tài)下，PHD羥基化致HIF反應受阻，胞漿內(nèi)HIF-1α積聚增多并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與HIF-1β聚合成異源二聚體，繼而與下游靶基因的低氧反應元件(HRE)結(jié)合，誘導低氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，形成低氧反應調(diào)節(jié)通路(圖2)。氧感知通路，不僅在基礎(chǔ)科學上有其價值，還有望帶來創(chuàng)新的療法。比如通過調(diào)控HIF-1通路促進紅細胞的生成治療貧血。

3 氧感知通路與高原適應機制

青藏高原平均海拔4 000米以上，空氣氧氣量僅為海平面的63%，藏族人群在青藏高原生活了幾萬年，是世界上居住高原時間最長且適應最佳的民族。以往各國科學家對藏族人群低氧適應的生理學機制做了大量研究，但細胞氧感知通路在藏族人高原適應過程中起什么角色仍是未解之謎。近年來，中國科學家在國際上首次報道了藏族人的EGLN1、PPARA、EPAS1等基因發(fā)生高頻序列變異。而這些基因，就是細胞氧氣感知反應通路中的關(guān)鍵基因。

當缺氧狀態(tài)時(左圖)，HIF-1α被保護免于降解，積聚在細胞核中，與低氧調(diào)節(jié)基因中的特定DNA序列(HRE)結(jié)合，以此促進低氧靶基因表達，增加細胞適應性。當正常氧狀態(tài)時(右圖)，HIF-1α被蛋白酶體迅速降解。氧氣通過向HIF-1α添加羥基(OH)來調(diào)節(jié)降解過程，隨后，VHL蛋白可以識別HIF-1α并與之形成復合物，從而導致其以氧依賴性方式降解

圖1 有氧狀態(tài)和缺氧狀態(tài)下的氧感知通路(http：//www.laskerfoundation.org/awards/show/oxygen-sensing-essential-process-survival/)

曾長青等應用全基因組篩選藏族人群中的自然選擇信號，發(fā)現(xiàn)位于2號染色體上的EPAS1基因的選擇信號最強，EPAS1是HIF通路中的重要基因。[10]EPAS1基因單體型頻率在漢族和藏族人群中分別為2%和46%，發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)31個SNP與血紅蛋白濃度相關(guān)，純合基因型個體血紅蛋白濃度比雜合型低0.8±0.15 g/dL。在低氧環(huán)境中，由于激活了EPAS1基因，觸發(fā)生成更多的紅細胞和血紅蛋白，從而導致高原紅細胞增多癥。然而，藏族人由于EPAS1基因發(fā)生了變異，導致藏族人只要輕微提高紅細胞和血紅蛋白水平，便可降低慢性高原性疾病的發(fā)生。筆者的課題組與美國相關(guān)機構(gòu)合作，應用高通量基因組芯片篩選出10個藏族人特有的正選擇信號，其中EGLN1、EPAS1、PPARA等基因與低氧誘導因子通路有關(guān)(圖2)。[11]對這些基因的基因型與表現(xiàn)型關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，EGLN1基因的表達與血紅蛋白濃度呈明顯負相關(guān)，基因每表達1個拷貝，血紅蛋白濃度平均降低1.7 g/dL。藏族人EGLN1基因的D4E和C127S等兩個位點出現(xiàn)高頻率的錯義突變[9]，大約88%的藏族人都攜帶突變的EGLN1基因。對基因功能研究發(fā)現(xiàn)，EGLN1基因D4E位點錯義突變者對低氧耐受性很強，能阻止紅細胞過度增生。因此，藏族人高原病發(fā)病率較低、運動耐力較強可能與EGLN1基因突變有關(guān)。

藏族人群特有的與高原適應相關(guān)的三個(EGLN1、EPAS1、PPARA)低氧適應基因與氧感知通路有關(guān)

圖2 高原低氧適應基因與HIF-1α通路[引自Simonson等，Science(2010)]

4 氧感知通路與高原運動訓練

二十世紀60年代科學家發(fā)現(xiàn)，低氧導致機體內(nèi)紅細胞數(shù)量增加，而紅細胞的增多是由于低氧刺激腎臟分泌大量EPO所致。那么低氧是如何增加EPO含量的？90年代初，Semenza等從低氧培養(yǎng)細胞中分離到一種蛋白質(zhì)，這種蛋白叫做HIF-1α的蛋白[1，3]。在缺氧的環(huán)境下，HIF-1α能夠激活許多哺乳動物細胞內(nèi)的特定基因，如它可調(diào)控EPO、VEGF、GLUT1(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1)等基因的表達。低氧環(huán)境下EPO基因的過度表達，會增加血液中紅細胞數(shù)量和血紅蛋白含量，使機體對氧的攜帶和運輸能力增強。依據(jù)這個原理，科學家在世界范圍廣泛開展高原運動訓練的理論與實踐研究。居住在青藏高原的多布杰(西藏)、切陽什姐(青海)，以及東非高原、阿比西尼亞高原等地的世居高原運動員，在耐力性競賽項目中取得了優(yōu)異成績。說明他們不僅在心肺功能方面，甚至從分子生物及遺傳學方面有著對低氧環(huán)境的最佳適應，使他們具有天生的耐力優(yōu)勢。高原訓練提高運動技能的基本生理學機制是在低氧環(huán)境下，刺激腎臟釋放EPO，增加血紅蛋白濃度和增強氧傳送鏈，以此提高組織對氧的有效利用率和骨骼肌的耐乳酸能力。Hoppeler等通過肌肉活檢[12]測定運動員高原訓練前后的HIF-1和VEGF發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下進行強度訓練時這些因子的基因顯著高表達，而在常氧下增加的程度較低，提示低氧性訓練可促使HIF-1的基因轉(zhuǎn)錄，加速機體在分子生物學和結(jié)構(gòu)上的適應，進而增加骨骼肌氧傳送和氧利用量，提高運動能力。然而，高原訓練的效果存在著很大的個體差異，而這些差異與EPO對低氧反應的個體差異有關(guān)。Richalet發(fā)現(xiàn)[13]，在6452 m高度逗留3周期間，EPO的增加和隨后血紅蛋白的增加均具有顯著個體差異。筆者曾在美國選擇48名運動員暴露于低壓氧艙(模擬海拔1780～2800m)進行間歇性低氧訓練[14]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露低氧6 h和24 h后血清EPO含量的升高存在顯著個體差異(-41%～+400%，圖3)。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，EPO對那些對低氧有反應的運動員，通過高原現(xiàn)場訓練可顯著提高運動成績，而那些無反應者的高原訓練成績無明顯提高甚至下降，提示在高原低氧環(huán)境中HIF-1α誘導EPO基因的表達對提高高原訓練成績起重要作用。

48名運動員暴露低壓低氧6、24h后血清EPO濃度的百分比。顯示EPO對低氧的變化顯著的個體差異

圖3 暴露于不同海拔高度血清EPO濃度變化[引自格日力等，J ApplPhiol(2002)]

5 結(jié)語

低氧感應信號通路的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了一個全新研究領(lǐng)域，具有重要的理論價值和巨大的臨床應用潛力。以前期科研成果為驅(qū)動力，通過對低氧信號通路的深入研究，有望在高原世居人群和平原移居人群對低氧環(huán)境適應機制研究上取得重要成果，為進一步揭示高原性疾病，包括慢性高原病、高原肺水腫、低氧性肺動脈高壓等疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制找到新的方向和途徑，并因此找到能夠預防和治療這類疾病的方法。