頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)法分析不同品種溫州蜜柑汁的香氣成分

周琦，易鑫，歐陽祝，李貴節(jié),2，朱霞建，范佳瑩，李則靈，談安群，黃林華，王華*

1(西南大學(xué)柑桔研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712) 2(重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶第二師范學(xué)院，重慶，400067)

柑橘是我國種植面積和產(chǎn)量均居第一的水果，其產(chǎn)量高達(dá)4 138.14萬t(2018年)，按種類可主要分為寬皮柑橘、橙、柚、檸檬及其他柑橘五大類。寬皮柑橘是一類果皮寬松，易剝皮、汁多肉粒飽滿的柑橘品種。2017年我國寬皮柑橘產(chǎn)量達(dá)1818.77萬t，占當(dāng)年總柑橘產(chǎn)量的47.7%，屬產(chǎn)量最高的柑橘品種。寬皮柑橘在我國品種多樣，資源豐富，主要栽培品種有溫州蜜柑、椪柑和南豐蜜桔，其產(chǎn)量分別占我國柑橘總產(chǎn)量(2017年)的23.4%、10.3%及6%[1]。

溫州蜜柑又名無核蜜橘、溫州柑等，主產(chǎn)于日本、韓國、浙江、廣西、湖南、湖北等區(qū)域，果實(shí)9月中下旬成熟，具有高糖低酸、無核、皮薄等許多優(yōu)良特點(diǎn)，產(chǎn)量占寬皮柑橘總產(chǎn)量的70%左右[2]。我國溫州蜜柑品系諸多，大多從日本引進(jìn)，少數(shù)為自己選育而成。成傳香等[3]通過研究3種中國主栽寬皮柑橘制汁品質(zhì)，結(jié)果表明，相比于南豐蜜桔與椪柑溫州蜜柑不論是色澤、總酚含量還是香氣物質(zhì)總量均表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，是我國最適合制汁用的主栽寬皮柑橘品種；金潤楠等[4]則通過對浙江、湖南和湖北3個產(chǎn)區(qū)的宮川和尾張溫州蜜柑的香氣成分進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)區(qū)的相同品種具有其產(chǎn)區(qū)特有味道，且甜香味為宮川品種的特殊成分。香氣是影響柑橘加工制品品質(zhì)最重要的因素之一[5-6]，且受不同因素的影響，已有研究雖表明不同品種的寬皮柑橘汁的香氣成分是存在差異性[7]，但對溫州蜜柑香氣成分與其品種的研究較少，且有關(guān)溫州蜜柑品種的數(shù)量的研究也較少。

溫州蜜柑雖然是我國產(chǎn)量最大的寬皮柑橘品種，但主要以鮮銷為主，深加工以桔瓣罐頭為主，制汁占比較小[8]，遠(yuǎn)低于其他汁用柑橘品種。本研究以18種的主栽溫州蜜柑為對象，模擬工業(yè)中橙汁的生產(chǎn)對溫州蜜柑進(jìn)行制汁，利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合主成分分析探究其香氣成分的差異性，從而進(jìn)一步對溫州蜜柑汁用提供數(shù)據(jù)支撐以提高我國寬皮柑橘利用率，解決鮮果滯銷難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成熟的溫州蜜柑果實(shí)均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院/西南大學(xué)柑桔研究所國家果樹種植柑橘資源圃(東經(jīng) 106°43′、北緯29°83′)，樣品信息見表1。

表1 柑橘樣品信息Table 1 The information of citrus samples

1.1.2 試劑與耗材

環(huán)己酮(>99.5%,色譜純)，aladdin公司；甲醇、C5～C25正構(gòu)烷烴均為色譜純，美國Honeywell公司。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890 GC-5977 MSD，配備30 m×0.25 mm，0.25 μm的DB-5MS石英毛細(xì)管色譜柱)，美國Agilent公司； H-100-DWBWIA01原汁機(jī)，惠人新生活文化傳媒有限公司；固相微萃取裝置(85 μm，CAR/PDMS)，美國Supelco公司; 50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；SQP十萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司； FiveEasy Plus pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PAL-1型手持糖度計(jì)，日本ATAGO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理及樣品制備

NFC果汁制備：采摘新鮮成熟的果實(shí)，去皮榨汁，經(jīng)過100目紗網(wǎng)精濾，裝瓶備用。

樣品的前處理：取5 mL搖勻后的果汁于 20 mL螺口萃取瓶中，加入配制好的內(nèi)標(biāo)物3 μL(環(huán)己酮采用甲醇稀釋40倍)，充氮20 s，40 ℃平衡 20 min后插入SPME萃取頭于萃取瓶中，并置于40 ℃萃取30 min，樣品在平衡和萃取過程中用磁力攪拌器以240 r/min輕輕渦旋，于250 ℃上機(jī)解析 5 min。

柑橘汁模擬汁配制：參考DREHER的方法[9]并做修改：配制100.0 g糖溶液，含6.0 g蔗糖、3.0 g果糖和3.0 g葡萄糖，檸檬酸1.0 g，其余用水補(bǔ)足；再加入VC使其質(zhì)量濃度為500.0 mg/L，得到模擬柑橘汁[pH 3.5、(11±0.5)°Brix]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)條件

GC-MS升溫程序：起始溫度35 ℃，保持0 min；再以7 ℃/min 升至98 ℃；接著以3 ℃/min升至161 ℃，最后以10 ℃/min升至241 ℃；進(jìn)樣口溫度230 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣(He)流速1.2 mL/min。

EI離子源；電子能量70 eV; 傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z為40～350。

1.3.3 樣品揮發(fā)性有機(jī)物的定性與定量分析

定性分析：各揮發(fā)性成分采用安捷倫系統(tǒng)圖譜庫(W10N14.L)匹配、保留指數(shù)及利用模擬柑橘汁配備部分標(biāo)準(zhǔn)品三者相結(jié)合進(jìn)行準(zhǔn)確定性。

保留指數(shù)線性升溫公式如公式(1)所示[10]：

(1)

式中：t0為待測物質(zhì)的保留時間；tn+1和tn分別表示碳原子數(shù)為n+1和n的正構(gòu)烷烴的保留時間，且式中tn+1>t0>tn

定量分析： 參考SHUI等[11]定量方法稍作修改，以環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法半定量。

各樣品揮發(fā)性有機(jī)物含量計(jì)算如公式(2)所示[12]：

(2)

式中：C待,待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/mL；S待,待測物質(zhì)的峰面積；ρ,環(huán)己酮的密度,即0.95 mg/μL；V1,樣品中加入環(huán)己酮的體積；S1,環(huán)己酮的峰面積；V待,樣品的體積。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)分析軟件采用The Unscrambler X 10.4和Qualitative Workflows B.08.00；數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 365；圖片處理采用Origin 2018；所有樣品平行實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。

PCA分析步驟：以揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compound，VOCs)種類為行，待測樣品種類為列，插入數(shù)據(jù)；通過analyze- Principal Component Analysis，選取Maximum components為4，進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫州蜜柑汁氣相色譜圖流出特性

本實(shí)驗(yàn)采取HS-SPME-GC-MS測定了18種不同成熟期溫州蜜柑汁中香氣成分的種類及含量，定性方式采用保留指數(shù)[13]結(jié)合質(zhì)譜，部分色譜峰結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品定性；其中保留指數(shù)值相差均在千分之五以內(nèi)，質(zhì)譜庫匹配度均高于91%，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性。樣品溫州蜜柑汁共測出60種VOCs，以2003-4和寧紅73-19溫州蜜柑為例，典型的溫州蜜柑汁VOCs的總離子流圖如圖1所示。由圖1可知，溫州蜜柑色譜圖的物質(zhì)流出除去0～6 min和30～38 min(此時間段只有極少物質(zhì)流出且濃度極低)，大致可以分為以下幾個階段(圖中已標(biāo)注)：階段1(RT：8.2～11.5，RI：927～1 062)主要是單萜類化合物以及少量低碳醇醛流出，包含了幾乎占自身總離子響應(yīng)80%以上的D-檸檬烯；階段2(RT：11.6～18.4，RI：1 069～1 277)主要是醇類、醛酮類及少量單萜類化合物流出；階段3(RT：19.5～22.1，RI：1308～1376)主要是酯類物質(zhì)的流出；階段4(RT：22.6～29.1，RI：1 390～1 562)主要是倍半萜類物質(zhì)和其他碳原子數(shù)較大的化合物的流出。

圖1 典型溫州蜜柑汁的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of typical satsuma juice

2.2 不同品種溫州蜜柑汁香氣物質(zhì)種類及含量的比較

柑橘汁的香氣是由單萜類、倍半萜類、醛類、酮類、醇類、酯類等多種VOCs混合后的綜合表現(xiàn)，且不同種類的香氣成分貢獻(xiàn)的作用不同[14]。18種溫州蜜柑經(jīng)SPME富集后進(jìn)行測定，其中單萜類化合物12種(包含D-檸檬烯)，倍半萜類化合物19種，醛類化合物8種，醇類化合物10種，酮類和酯類化合物種類最少，均為4種；此外，還有3種其他化合物被檢出，合計(jì)60種。

由表2可知，在所有的溫州蜜柑樣品中，單萜類和倍半萜類化合物無論是數(shù)量還是含量在所有的香氣成分中均是最高的，這與馮桂蓉[15]的研究結(jié)果相類似；除去D-檸檬烯后，單萜類化合物占總體香氣成分的比例可以達(dá)到58%～88%，總萜類化合物可以占80%以上。2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)的單萜和倍半萜類化合物的含量遠(yuǎn)高于其他品種，分別達(dá)655.7 μg/mL和90.45 μg/mL，但是萜類化合物的檢出數(shù)量與其他樣品幾乎相同，原因是巴倫西亞橘烯、β-月桂烯和γ-松油烯的含量較高，分別為69.71、164.60和367.58 μg/mL；此外，醇類和酯類化合物的種類和含量在所有樣品中也是最高的，分別達(dá)45.93 μg/mL(9種)和31.18 μg/mL(4種)，這也導(dǎo)致了其揮發(fā)性有機(jī)物的種類也是所有樣品中數(shù)量最多的，為42種。寧紅73-19(XVI)、大分1號(Ⅰ)和壽太郎(XVII)的醛類化合物在所有樣品中含量較高，分別達(dá)57.94、32.30 和30.16 μg/mL，原因是寧紅73-19(XVI)中的壬醛(29.73 μg/mL)、大分1號(Ⅰ)和壽太郎(XVII)中的正己醛(分別為17.97 μg/mL和17.98 μg/mL)含量較高，但是這3種溫州蜜柑的醛類化合物數(shù)量與其余品種相差無異，均為5種。所有樣品中酮類化合物和其他成分化合物總體含量和數(shù)量上相近。

對比18種溫州蜜柑香氣成分種類及含量，發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑汁中醛類香氣物質(zhì)主要是正己醛、正辛醛、壬醛和癸醛；醇類香氣物質(zhì)主要是葉醇、芳樟醇、4-萜烯醇和α-松油醇；酮類香氣物質(zhì)主要是甲基庚烯酮和香葉基丙酮；1,3,8-p-薄荷三烯、對傘花烴和百里酚只在少數(shù)幾個溫州蜜柑樣品中檢出。此外，酯類化合物作為主要的1類香氣貢獻(xiàn)成分，在所有溫州蜜柑樣品中檢出量僅為4種，且絕大多數(shù)溫州蜜柑僅含有一種(橙花乙酸酯)或不含有，這也導(dǎo)致了溫州蜜柑汁的香氣成分普遍低于甜橙汁，此結(jié)果與已有研究相類似[16]。

2.3 不同品種溫州蜜柑汁特征香氣成分的比較

柑橘汁中含量高的香氣物質(zhì)其香氣強(qiáng)度不一定高，對總體香氣的貢獻(xiàn)也并不高，如幾乎在所有柑橘品種中均存在的物質(zhì)D-檸檬烯；通常將分析得到的香氣物質(zhì)的含量與其香氣閾值相比，比值被稱為香氣活力值(odor activity value, OAV)。一般OVA值>1則該香氣被認(rèn)為對總體香氣有貢獻(xiàn)，被稱為特征香氣成分或主體香氣成分，且OAV值越高，該香氣物質(zhì)的強(qiáng)度就越大，對總體香氣的貢獻(xiàn)也就越大[17]。通過HS-SPME-GC-MS對樣品香氣物質(zhì)的定量結(jié)果并結(jié)合查閱文獻(xiàn)[5,18-22]及書籍[23]找到的各物質(zhì)香氣閾值，計(jì)算出各香氣的OVA值，表3即為18種溫州蜜柑汁中OAV值>1的香氣物質(zhì)及其香氣活度值。

表2 18個品種溫州蜜柑汁揮發(fā)性有機(jī)物分類匯總表Table 2 Classification summary table of volatile organic compounds in 18 kinds of satsuma juice

注：a：樣品編號對應(yīng)表1中的樣品名稱；表中數(shù)據(jù)未包括D-檸檬烯；括號里的數(shù)字表示香氣物質(zhì)的數(shù)量；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用平均數(shù)表示，保留小數(shù)點(diǎn)后兩位數(shù)，單位為μg/mL；ND表示未檢出

由表3可以看出，18種溫州蜜柑汁中特征香氣成分總共29種，其中單萜類9種、倍半萜類2種、醛類7種、醇類5種、酯類1種、酮類3種、其他成分2種。在所有特征香氣物質(zhì)中，α-蒎烯、β-月桂烯、α-萜品烯、β-順式羅勒烯、γ-松油烯、α-萜品油烯、正己醛、壬醛、芳樟醇的OAV值較高，且在所有柑橘汁樣品中均能檢出，其中大多數(shù)柑橘汁樣品的γ-松油烯、正己醛、壬醛和芳樟醇的OAV值>100，可認(rèn)為這些香氣成分對溫州蜜柑汁總體香氣起一定的調(diào)節(jié)作用，這也與FENG等[24]的研究結(jié)果相對應(yīng)。

此外，別羅勒烯只在2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)中檢出；2-已烯醛和L-香芹酮只在大分1號溫州蜜柑(Ⅰ)和壽太郎溫州蜜柑(XVII)中檢出；十二醛只在寧紅73-19溫州蜜柑(XVI)中檢出；紫蘇醛和香茅醇只在大分1號溫州蜜柑(Ⅰ)中檢出；百里酚只在壽太郎溫州蜜柑(XVII)中檢出，可認(rèn)為這些香氣物質(zhì)是某幾種溫州蜜柑特有的成分；而巴倫西亞橘烯和4-萜烯醇雖在所有溫州蜜柑汁樣品中檢出，但是只有在2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)中OAV值較高，可認(rèn)為其他品種的溫州蜜柑中巴倫西亞橘烯和4-萜烯醇的含量要低于2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)，同時2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)中橙花乙酸酯的OAV也明顯高于檢出品種。

表3 18種溫州蜜柑汁的特征香氣物質(zhì)及香氣活度值Table 3 characteristic aromatic substances and odor activity value of 18 kinds of satsuma juice

注：表中第一行的羅馬數(shù)字對應(yīng)表1中的樣品編號；b表示該香氣物質(zhì)在油中的閾值，未標(biāo)注則是在水中的閾值；該表中剔除了D-檸檬烯；結(jié)果采用平均數(shù)表示，保留小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)；ND表示未檢出

2.4 主成分分析

為進(jìn)一步從整體上反應(yīng)不同品種溫州蜜柑香氣成分構(gòu)的差異，剔除了大部分樣品未檢出的特征香氣(如別羅勒烯、2-已烯醛和紫蘇醛等)，以18種溫州蜜柑樣品為分析對象，采用主成分分析對21種主體香氣成分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2和圖3所示。由二維分值圖(圖2-A)可見溫州蜜柑汁樣品點(diǎn)分別匯聚，4個集合間差異明顯，其中2003-4溫州蜜柑(Ⅱ)和寧紅73-19溫州蜜柑(XVI)自成一個集合，與其余樣品間距明顯，另外2個集合中各成熟期的樣品均包含在內(nèi)；由相關(guān)性載荷圖(圖2-B)可知，葵醛、α-松油醇、4-萜烯醇、橙花乙酸酯、巴倫西亞橘烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、水芹烯、α-萜品烯、β-順式羅勒烯、γ-松油烯、α-萜品油烯在在PC-1上的相關(guān)度分量達(dá)到了0.8～1.0，而α-金合歡烯、壬醛、正辛醛在PC-2上的相關(guān)性分量達(dá)到了0.6～0.8，即這2組VOCs分別在X+和Y-方向上有較大貢獻(xiàn)，且在X+上作較大貢獻(xiàn)的多為單萜類物質(zhì)；酮類物質(zhì)雖在PC-2上的相關(guān)性分量僅達(dá)到0.5～0.6，但其只對Y-方向作貢獻(xiàn)；此外，對X+和Y-方向上起著共同較大貢獻(xiàn)的物質(zhì)是醇類物質(zhì)(芳樟醇和葉醇)，對X+和Y-方向起一定貢獻(xiàn)的是橙花乙酸酯和巴倫西亞橘烯，這也與圖2-A中溫州蜜柑汁樣品點(diǎn)的分布相吻合。由上述結(jié)果可知，特征香氣成分在不同種類的溫州蜜柑中分布具有特征性，可利用主成分分析進(jìn)行放大區(qū)分，且溫州蜜柑的成熟期并不直接影響其特征香氣成分。由圖3可知，Hotelling’s T2檢驗(yàn)僅有1個離群點(diǎn)，遠(yuǎn)小于樣品數(shù)，且均未在較大誤差區(qū)(HotT2>15.96，F(xiàn)Res>1.76)出現(xiàn)；同時4組主成分對解釋方差和驗(yàn)證方差的貢獻(xiàn)度分別達(dá)到了99.8%和97.3%，解釋方差與驗(yàn)證方差基本接近；上述結(jié)果表明模型能夠很好地反映原始樣本的特征。

A-樣品分值圖；B-香氣成分的相關(guān)載荷圖圖2 溫州蜜柑汁主成分分值圖Fig.2 Score plotting of principal components analysis in satsuma juice注：圖1-A中圓形代表特早熟品種、正方形代表早熟品種、菱形代表中熟品種、三角形代表晚熟品種，圖中羅馬數(shù)字與表1中樣品編號相對應(yīng);圖1-B中不同種類的香氣物質(zhì)采用不同的形狀標(biāo)注，中文名與之對應(yīng)

A-檢驗(yàn)結(jié)果；B-主成分累計(jì)可釋方差圖3 溫州蜜柑汁樣品Hotelling’s T2檢驗(yàn)結(jié)果及主成分累積可釋方差Fig.3 Hotelling's T test results and cumulative interpretable variance of the principal components of satsuma juice samples

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法對18種溫州蜜柑汁進(jìn)行測定，共檢測出58種香氣成分，其中有29種為特征香氣(OAV>1)，別羅勒烯、2-已烯醛、L-香芹酮、十二醛、紫蘇醛、茅醇和百里酚為品種特征性成分；此外，溫州蜜柑樣品在主成分分值圖空間分布上具有特征性，分布特征性受品種影響而與成熟期無直接關(guān)系，可利用主成分分析進(jìn)行放大區(qū)分。同時，2003-4溫州蜜柑和寧紅73-19溫州蜜柑香氣種類量與含量較其他品種更佳。

綜上，本研究通過HS-SPME-GC-MS結(jié)合主成分分析比較了不同品種溫州蜜柑汁的香氣成分含量、特征香氣的差異，初步明確了各特征香氣對溫州蜜柑汁總體香氣品質(zhì)的貢獻(xiàn)程度，選出了2種香氣品質(zhì)較佳的品種；基于此，后續(xù)的研究可利用GC-O/MS結(jié)合感官評定設(shè)計(jì)香氣重組及缺失實(shí)驗(yàn)對特征香氣成分進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步分析各品種溫州蜜柑的特征香氣物質(zhì)的差異對總體香氣的影響。