基于金納米粒子粒徑變化的細(xì)菌檢測(cè)方法

許哲瑋，陳坤，胡長(zhǎng)鷹,2*

1(暨南大學(xué) 包裝工程學(xué)院，廣東 珠海，519070)2(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632) 3(華南理工大學(xué) 軟物質(zhì)科學(xué)與技術(shù)高等研究院，廣東 廣州，510640)

目前因食品在生產(chǎn)、運(yùn)輸以及銷售過(guò)程中受污染造成的食物中毒及傳染病造成了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，世界上每年有6億人因食用受污染的食物患病，其中42萬(wàn)人因此而喪命[3]。其中細(xì)菌總數(shù)是反映食品安全的指標(biāo)之一，實(shí)現(xiàn)一類食品微生物的快速檢測(cè)對(duì)食品安全有重要意義。目前，平板計(jì)數(shù)法是細(xì)菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法勞動(dòng)密集且依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)[4]?；诰酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)的細(xì)菌DNA檢測(cè)同樣因假陽(yáng)性以及檢測(cè)廣譜性問(wèn)題而受到限制[5-6]。近年來(lái)，通過(guò)適配體[7-10]、抗生素[11-13]以及抗體[14-16]等對(duì)細(xì)菌或細(xì)菌代謝產(chǎn)物的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的快速靈敏檢測(cè)，其中部分方法對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)依賴性較小且能避免假陽(yáng)性。

溶菌酶(lysozyme, LZM)是一種含有129個(gè)氨基酸殘基的堿性蛋白質(zhì)[17-18]，其在食品保藏中有一定的應(yīng)用[19-21]。通過(guò)對(duì)細(xì)胞壁中N-乙?；谒崤cN-乙?；咸前分g的β-1,4糖苷鍵水解[22-23]，LZM可以使不溶性肽聚糖轉(zhuǎn)化為可溶性糖肽，從而起到殺菌作用[24]。LZM蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中大量的游離氨基使其帶有大量的正電荷，LZM與帶檸檬酸配體金納米粒子(gold nanoparticles, GNPs)之間的靜電作用可以使GNPs聚集從而發(fā)生比色變化。另一方面，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁與LZM的特異性結(jié)合可以屏蔽這一靜電作用。LZM對(duì)GNPs與目標(biāo)微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的定量檢測(cè)。

比色法通過(guò)GNPs粒徑變化產(chǎn)生的顏色變化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的定量[25]，但是目標(biāo)物質(zhì)與識(shí)別分子之間的結(jié)合常數(shù)過(guò)小將可能會(huì)導(dǎo)致GNPs的尺寸變化不夠明顯，檢測(cè)的靈敏度也將受到限制。激光光散射儀可通過(guò)粒子布朗運(yùn)動(dòng)引起的光強(qiáng)波動(dòng)檢測(cè)粒子尺寸信息，目標(biāo)物質(zhì)濃度可通過(guò)與GNPs的流體力學(xué)半徑(Rh)之間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)定量。本研究通過(guò)激光光散射儀以及紫外光譜建立了革蘭氏陽(yáng)性菌的廣譜檢測(cè)方法，并且激光光散射儀法的檢測(cè)靈敏度相比紫外光譜法實(shí)現(xiàn)了一個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

四氯金酸水合物、無(wú)水檸檬酸鈉、溶菌酶(來(lái)源于雞蛋白)、牛血清蛋白，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯，北京索萊寶科技有限公司，實(shí)驗(yàn)用水，實(shí)驗(yàn)室自制一級(jí)水；塑料托盤(pán)，當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

大腸桿菌(ATCC8739)、金黃葡萄球菌(ATCC 6538)、單增李斯特菌(ATCC 19115)、枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)試管斜面菌種，上海魯微技術(shù)有限公司；所用培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)肉湯。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UV-1800 紫外光譜，日本島津公司；BI-200SM 激光光散射儀，美國(guó)布魯克海文儀器公司；TEM 1400透射電子顯微鏡，日本JOEL公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GNPs合成

GNPs根據(jù)BASTUS等報(bào)道的方法合成[26]。將100 mL 5.94 mmol/L檸檬酸鈉水溶液加入燒瓶中，加熱并強(qiáng)力攪拌至溶液沸騰后，向溶液中加入 38 μL 2.94 mol/L四氯金酸水溶液，溶液顏色由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色繼而變?yōu)樽霞t色最終呈現(xiàn)紅色。繼續(xù)加熱反應(yīng)15分鐘后停止加熱，待溶液冷卻后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱。

制得的GNPs通過(guò)紫外-可見(jiàn)光(ultraviolet-visible，UV-Vis)光譜、激光光散射儀(dynamic light scattering，DLS)以及透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)進(jìn)行表征。

1.2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

1.2.2.1 孵育時(shí)間

將500 μL制得的GNPs與50 μL 0.14 mg/mL的LZM水溶液混合，并用純水補(bǔ)充溶液體積至2 mL，并用UV-Vis光譜記錄523、600 nm處吸光值的變化。

1.2.2.2 孵育pH

基于1.2中所優(yōu)化的檢測(cè)條件，將500 μL制得的GNPs與50 μL 0.14 mg/mL的LZM水溶液混合，分別用pH為5.0、6.0、7.0、8.0的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)補(bǔ)充體積至2 mL，孵育15 min后測(cè)試樣品400～800 nm的UV-Vis光譜。

1.2.2.3 孵育溫度

基于1.2中所優(yōu)化的檢測(cè)條件，將500 μL制得的GNPs與50 μL 0.14 mg/mL的LZM水溶液混合，用pH為8.0的10 mmol/L PBS補(bǔ)充體積至2 mL。將溶液分別放置于30、35、40、45、50 ℃條件下孵育15 min后，測(cè)試樣品400～800 nm的UV-Vis光譜，信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A600，A523分別代表樣品在600、523nm處的吸光值。

1.2.2.4LZM添加量

基于1.2中所優(yōu)化的檢測(cè)條件，將500μL制得的GNPs分別與0～70μL0.14mg/mL的LZM水溶液混合，并用pH為8.0的10mmol/LPBS補(bǔ)充體積至2mL。溶液常溫下孵育15min后分別通過(guò)UV-Vis光譜以及DLS測(cè)試各樣品400～800nm的UV-Vis光譜和Rh。

1.2.3 檢測(cè)體系選擇性

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)以及單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,L.monocytogene)在37 ℃下用營(yíng)養(yǎng)肉湯孵育17 h。所得菌液在3 000×g離心15 min后，除去上清液并重懸于pH為8.0的10 mmol/L PBS中，重復(fù)3次并最終控制菌液在波長(zhǎng)為600 nm處的吸光值為1 (109CFU/mL)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步稀釋以達(dá)到所需濃度。

基于文中所優(yōu)化的檢測(cè)條件，取1 mL濃度為108CFU/mLE.coli、S.aureus、B.subtilis、L.monocytogene、0.05 mg/mL的牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)，并以1 mL pH為8.0的PBS作為空白對(duì)照，依次加入40 μL 0.14 mg/mL的LZM溶液以及500 μL GNPs，并用pH為8.0的10 mmol/L PBS補(bǔ)充體積至2 mL。樣品常溫下孵育15 min后測(cè)試各樣品400～800 nm的UV-Vis光譜，測(cè)試結(jié)果通過(guò)公式(1)轉(zhuǎn)化為信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)于通過(guò)DLS檢測(cè)的樣品Rh(信號(hào)強(qiáng)度)，除了LZM溶液添加量為20 μL以及樣品在測(cè)試前以0.22 μL醋酸纖維素濾膜過(guò)濾外，其余操作相同。所得信號(hào)強(qiáng)度通過(guò)公式(2)歸一化：

(2)

式中：In為歸一化后的信號(hào)強(qiáng)度；IB為測(cè)試樣品的信號(hào)強(qiáng)度；ICK為空白對(duì)照組的信號(hào)強(qiáng)度；IH為上述5組中信號(hào)強(qiáng)度的最大值。

1.2.4 線性關(guān)系建立

分別取1 mL細(xì)菌濃度在105～ 108CFU/mL的S.aureus，根據(jù)1.2.3所述的2種方法進(jìn)行檢測(cè)。各細(xì)菌濃度重復(fù)3個(gè)平行樣。

1.2.5 真實(shí)體系檢測(cè)

為確定該體系在真實(shí)樣品檢測(cè)中的可行性及靈敏度，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別取1 mL濃度為107CFU/mL及108CFU/mL的S.aureus涂抹于塑料托盤(pán)表面5 cm×5 cm的矩形內(nèi)，待菌液在常溫下干燥后，通過(guò)棉拭子取樣。用浸泡在pH為8.0的無(wú)菌10 mmol/L PBS中的棉拭子在接種有細(xì)菌的矩形范圍內(nèi)來(lái)回涂抹10次，去除棉拭子木柄后將棉拭子放入含有10 mL pH為8.0的無(wú)菌PBS中。將液體搖勻后通過(guò)1.2.3所述的2種方法進(jìn)行檢測(cè)，各細(xì)菌濃度重復(fù)3個(gè)平行樣并計(jì)算平均濃度、回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GNPs表征

如圖1所示，通過(guò)檸檬酸鈉還原法制得了直徑約為12 nm且單分散的GNPs。由于表面等離子體效應(yīng)，GNPs的UV-Vis光譜在523 nm處有一吸收峰，這為后續(xù)生物傳感器的構(gòu)建提供了良好的基礎(chǔ)。

A-GNPs TEM圖；B-GNPs粒徑分布；C-GNPs UV-Vis光譜圖1 GNPs表征Fig.1 Characterization of GNPs

2.2 GNPs-LZM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)體系可行性

LZM是一種堿性蛋白質(zhì)，通過(guò)靜電作用可以使得帶有負(fù)電的GNPs發(fā)生聚集。由圖2可知，隨著LZM的添加，GNPs半徑逐漸增大，吸收峰由523 nm紅移到570 nm處；而單獨(dú)添加S.aureus并不能引起紫外吸收峰的紅移。當(dāng)體系同時(shí)存在LZM和S.aureus時(shí)，由于細(xì)菌對(duì)LZM的電荷的屏蔽，GNPs的吸收峰無(wú)明顯紅移。這一結(jié)果證明該競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合體系可用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌檢測(cè)。

A-GNPs UV-Vis吸收光譜；B-不同LZM添加量下GNPs粒徑圖2 檢測(cè)體系可行性Fig.2 Feasibility of detection system

2.3 檢測(cè)條件優(yōu)化

對(duì)孵育時(shí)間、孵育pH、孵育溫度以及LZM添加量4個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。吸光度在前3 min內(nèi)快速變化并逐漸趨于平緩(圖3-A)，紫外吸收峰變化在pH為8.0的條件下最顯著(圖3-B)，孵育溫度對(duì)信號(hào)強(qiáng)度無(wú)明顯影響(圖3-C)。因此后續(xù)檢測(cè)條件設(shè)定為孵育時(shí)間15 min，體系pH=8.0，孵育溫度為常溫。

由于細(xì)菌所能結(jié)合的LZM數(shù)量有限，過(guò)多的LZM會(huì)導(dǎo)致體系檢測(cè)限過(guò)高。由圖3-D可知，LZM添加量為40 μL時(shí)吸收峰變化明顯且LZM添加量適中，因此后續(xù)UV-Vis光譜檢測(cè)中LZM的添加量設(shè)定為40 μL。DLS對(duì)GNPs的Rh變化表現(xiàn)出了更高的靈敏度，這一特點(diǎn)可以在產(chǎn)生足夠信號(hào)強(qiáng)度的同時(shí)減少LZM的添加量，因此DLS檢測(cè)中LZM的添加量設(shè)定為20 μL。

2.4 檢測(cè)體系選擇性

在真實(shí)環(huán)境中，革蘭氏陰性與陽(yáng)性細(xì)菌可能同時(shí)存在，因此檢測(cè)體系需要在對(duì)目標(biāo)細(xì)菌有明顯響應(yīng)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)非目標(biāo)細(xì)菌盡可能小的響應(yīng)以實(shí)現(xiàn)選擇性檢測(cè)。2種檢測(cè)方式對(duì)革蘭氏陰性以及陽(yáng)性細(xì)菌檢測(cè)的歸一化信號(hào)強(qiáng)度如圖4所示。相比于革蘭氏陰性菌，2種檢測(cè)方式均體現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌良好的選擇性響應(yīng)，并且能抵抗體系中存在的蛋白質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌的廣譜檢測(cè)。

A-孵育時(shí)間;B-孵育pH;C-孵育溫度;D-不同LZM添加量下GNPs UV-Vis光譜;E-不同LZM添加量下GNPs Rh圖3 檢測(cè)條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of detect condition

2.5 GNPs-LZM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取S.aureus用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)UV-Vis光譜進(jìn)行檢測(cè)的回歸方程為Y=0.69X-3.70，相關(guān)系數(shù)R2=0.993，定量限為1.26×107CFU/mL。通過(guò)DLS進(jìn)行檢測(cè)的回歸方程為Y=-2.28X+30.08，相關(guān)系數(shù)R2=0.954，定量限為6.87×105CFU/mL。

A-UV-Vis光譜檢測(cè)法選擇性，B-DLS檢測(cè)法選擇性圖4 兩種檢測(cè)方法的選擇性Fig.4 Selectivity of the two detections system

2.6 GNPs-LZM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)體系在真實(shí)樣品中的檢測(cè)

為評(píng)估該體系檢測(cè)真實(shí)樣品的可行性及靈敏度，選取S.aureus作為代表，通過(guò)1.2.3所述的檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)，即進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。其中1、3樣品的加標(biāo)細(xì)菌濃度為108CFU/mL，2、4樣品的加標(biāo)細(xì)菌濃度為107CFU/mL，1、2樣品通過(guò)DLS進(jìn)行檢測(cè)，3、4通過(guò)UV-Vis光譜檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，2種檢測(cè)方法均能實(shí)現(xiàn)真實(shí)樣品中細(xì)菌的檢測(cè)，且DLS法體現(xiàn)出了更高的靈敏度。這一結(jié)果也證明了通過(guò)DLS進(jìn)行定量對(duì)實(shí)現(xiàn)更靈敏的檢測(cè)存在價(jià)值。相比于平板計(jì)數(shù)法24 h及以上的培養(yǎng)時(shí)間，該方法僅需15 min孵育時(shí)間，且單個(gè)樣品檢測(cè)可在30 min內(nèi)完成，能夠?qū)崿F(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌總數(shù)的快速檢測(cè)。

表1 GNPs-LZM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)體系在真實(shí)樣品中對(duì)S. aureus的檢測(cè)Table 1 S. aureus detection in real sample

注：-表示通過(guò)該方法未檢出

3 結(jié)論

本研究通過(guò)LZM對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和GNPs的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合建立了革蘭氏陽(yáng)性菌的廣譜檢測(cè)方法。通過(guò)UV-Vis光譜優(yōu)化了孵育時(shí)間、孵育pH以及孵育溫度，并分別通過(guò)UV-Vis光譜以及DLS兩種方法實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌的定量檢測(cè)。相比紫外光譜檢測(cè)的定量限(1.26×107CFU/mL)，DLS體現(xiàn)出對(duì)GNPs尺寸變化更高的敏感性，并實(shí)現(xiàn)定量限一個(gè)數(shù)量級(jí)的降低(6.87×105CFU/mL)。與革蘭氏陰性菌相比，2種檢測(cè)方式對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌均體現(xiàn)出良好的選擇性響應(yīng)，并能用于真實(shí)體系的檢測(cè)。相比于紫外光譜，DLS對(duì)粒子尺寸變化體現(xiàn)出了更高的敏感性，這一策略有助于提高比色法檢測(cè)的靈敏度。此外，細(xì)菌總數(shù)是反映食品新鮮程度的指標(biāo)之一，該方法可實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌的定量檢測(cè)，對(duì)食品安全有一定意義。