產(chǎn)醬香風(fēng)味菌株的分離篩選及鑒定

王小平，黃永光，周文美

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽, 550025)

醬香型白酒具有醬香突出、優(yōu)雅細(xì)膩、醇厚豐滿、空杯留香持久等風(fēng)味特征，以貴州茅臺酒為典型代表，深得消費者青睞[1]。其獨特的酒體風(fēng)格，源于醬香型白酒復(fù)雜的釀造工藝和釀造環(huán)境所形成的特殊微生物區(qū)系[2]。而細(xì)菌是其中最重要且研究最多的微生物菌群，能代謝多種酶類并生成多種風(fēng)味物質(zhì)及其前體，賦予醬香型白酒獨特的酒體風(fēng)格[3-4]。

“高溫制曲”是醬香型白酒釀造工藝的一大特色，也是優(yōu)化、篩選微生物結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，其制曲溫度可高達(dá)65 ℃[5]。高溫大曲中多為嗜熱性細(xì)菌，少量為霉菌[6-7]，形成了以嗜熱芽孢桿菌為主的特殊細(xì)菌群[8-9]。目前，對于醬香風(fēng)味菌株的篩選多采用高溫培養(yǎng)法、熱處理產(chǎn)芽孢法、稀釋平板涂布法等獲得初篩菌株，通過模擬固態(tài)發(fā)酵聞香，從而獲得產(chǎn)醬香風(fēng)味的菌株。如張小龍等[10]運用稀釋平板涂布法并結(jié)合模擬固態(tài)發(fā)酵，從大曲中分離得到2株產(chǎn)醬香濃郁的解淀粉芽孢桿菌；趙興秀等[11]運用稀釋平板涂布法結(jié)合固態(tài)發(fā)酵聞香從大曲中分離得到3株產(chǎn)醬香濃郁的枯草芽孢桿菌；張榮[12]采用高溫培養(yǎng)法、熱處理產(chǎn)芽孢法和高鹽培養(yǎng)法結(jié)合固態(tài)發(fā)酵聞香從大曲中分離得到3株產(chǎn)醬香地衣芽孢桿菌等?？v觀上述研究，產(chǎn)醬香的菌株均為芽孢桿菌類菌群，且發(fā)酵產(chǎn)物中均含有與產(chǎn)醬香風(fēng)味相關(guān)的物質(zhì)即乙偶姻[13-14]、四甲基吡嗪[15]和呋喃扭爾等。但此前的研究大多通過模擬固態(tài)發(fā)酵聞香篩選出產(chǎn)醬香功能菌，極少通過對比固態(tài)、液態(tài)2種發(fā)酵形式而獲得目標(biāo)菌株，因此對產(chǎn)醬香菌株的研究還需考察其液態(tài)發(fā)酵條件下的產(chǎn)醬香特點，這對于解析醬香風(fēng)味的形成具有重要意義。

本研究主要以感官風(fēng)味為導(dǎo)向?qū)Τ鹾Y菌株進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵聞香得到產(chǎn)醬香的菌株，對產(chǎn)醬香菌株進(jìn)一步液態(tài)發(fā)酵聞香試驗，通過對比固、液發(fā)酵兩種形式從而得到產(chǎn)醬香風(fēng)味強(qiáng)的菌株。并對其進(jìn)行液態(tài)溫度梯度發(fā)酵感官聞香剖析，從而獲得最優(yōu)發(fā)酵溫度條件，為后期解析其風(fēng)味成分奠定基礎(chǔ)，對于提升醬香型白酒酒質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品來源：醬香大曲，1～7輪次釀造醬香白酒生產(chǎn)用大曲，采自茅臺鎮(zhèn)GT、DYT等17個釀酒生產(chǎn)企業(yè)。

感官評定參照樣：12種香型白酒感官品評標(biāo)準(zhǔn)酒樣，中國酒業(yè)協(xié)會；88種單體純果蔬、植物花卉聞香單體香標(biāo)樣，法國Aromaster公司；醬香型白酒釀造1～7輪次的堆積酒醅和窖池發(fā)酵酒醅、醬香大曲，采自茅臺鎮(zhèn)GT、DYT等17個釀酒生產(chǎn)企業(yè)。

TAE(50×)，北京索萊寶科技有限公司；核酸染料(Gengreen)，上海賽百盛有限公司；DL2000Marker，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

LB固體培養(yǎng)基：酵母粉5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加水至1 000 mL，pH調(diào)至7.2，121 ℃滅菌30 min。

麩皮固體培養(yǎng)基：將麩皮與水按質(zhì)量比1∶1混合，攪拌均勻分裝于121 ℃濕熱滅菌30 min。

麩皮浸出汁：200 g麩皮，加入800 mL水，蒸煮30 min，3層紗布過濾，分裝于121 ℃滅菌30 min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺,蘇州金凈科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫鼓風(fēng)干燥箱,Thermo Fisher Scientific；電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī),Thermo Fisher Scientific；PCR儀,美國伯樂公司；DYY-8C型電泳儀,北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀,上海培清科技有限公司。SPX-250-II型生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；THZ-98AB型恒溫振蕩器,上海一恒科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 初篩

采用稀釋平板涂布法，將樣品用無菌生理鹽水進(jìn)行系列稀釋，取合適的稀釋度，涂布于LB固體培養(yǎng)基。具體操作步驟如下：

(1)常溫稀釋平板涂布法

在無菌條件下稱取5 g曲樣，加入已滅菌的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)1 h，富集培養(yǎng)，制備菌懸液。

稀釋涂布：取菌懸液1 mL加入9 mL的無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩，再取稀釋液1 mL轉(zhuǎn)入另一支的9 mL無菌生理鹽水試管中，充分振蕩，逐次稀釋到10-2～10-8倍，選取10-4、10-5、10-6濃度梯度，各吸取100 μL直接涂布于LB固體培養(yǎng)基上，每個稀釋濃度3個平行，設(shè)置3個空白對照。菌懸液被培養(yǎng)基完全吸收后，于37 ℃倒置培養(yǎng)1～2 d。從平板上挑取不同菌落形態(tài)的菌株進(jìn)行逐次劃線培養(yǎng)，直至分離純化得到單菌落，將其編號，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)高溫篩選培養(yǎng)

將上述常溫分離得到的菌株，分批制成種子液涂布于LB固體培養(yǎng)基，50 ℃培養(yǎng)1～2 d，觀察平板菌落長勢。選擇生長好的優(yōu)勢菌株作為后續(xù)固態(tài)發(fā)酵試驗。4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 感官聞香復(fù)篩

1.3.2.1 模擬固態(tài)發(fā)酵

將培養(yǎng)好的種子液，在無菌條件下，分別按10%的接種量接入麩皮固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2 d，再55 ℃恒溫發(fā)酵4 d。同時做對照組實驗，培養(yǎng)方法相同。

1.3.2.2 模擬液態(tài)發(fā)酵

將從1.3.2.1中獲得的產(chǎn)醬香好的菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵和感官聞香實驗，按5%的接種量接入裝有50 mL麩皮浸出汁的150 mL三角瓶中，于150 r/min搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃培養(yǎng)2 d而后55 ℃發(fā)酵6 d，同時做對照組實驗，培養(yǎng)方法相同。

1.3.3 感官風(fēng)味評定標(biāo)準(zhǔn)

構(gòu)建感官風(fēng)味評定標(biāo)準(zhǔn)，主要參考醬香型白酒香氣特性[16]以及本課題組對醬香型白酒功能微生物發(fā)酵特性的研究基礎(chǔ)成果。以中國酒業(yè)協(xié)會12種香型白酒標(biāo)樣為參照酒樣、88種單體純果蔬、植物花卉聞香單體香標(biāo)樣為感官聞香的參照實物樣、醬香型白酒釀造1～7輪次的堆積酒醅和窖池發(fā)酵酒醅、大曲為參照樣，經(jīng)感官品評小組3次以上的感官聞香后除去發(fā)酵醅中明顯不存在的冗長特征香氣，再結(jié)合本研究前期大量發(fā)酵預(yù)試驗發(fā)酵產(chǎn)物所表征的香氣，從而制定出如圖1所示的感官評定模塊風(fēng)味輪，作為后期實驗發(fā)酵產(chǎn)物的感官聞香標(biāo)度。每種感官評定的香氣模塊，均以5分計(0～5分)。應(yīng)用構(gòu)建的感官風(fēng)味結(jié)構(gòu)模塊為導(dǎo)向篩選發(fā)酵產(chǎn)醬香的細(xì)菌，并制定本研究固態(tài)發(fā)酵感官評分標(biāo)準(zhǔn)(表1)。本研究對每類別發(fā)酵樣品基質(zhì)進(jìn)行3個平行固、液態(tài)發(fā)酵實驗，每個樣聞香評定3次。根據(jù)文獻(xiàn)方法[17]，建立風(fēng)味感官品評小組，小組由8人組成，年齡在20～45歲。其中有6名研究生，均通過良好的白酒品評專業(yè)培訓(xùn)且具有2年以上白酒品評經(jīng)驗，其中1名國家級評委，1名省白酒評委，均具有國家一級品酒師資格。液態(tài)發(fā)酵評定分?jǐn)?shù)為0～5分，0分為未聞到，5分為聞到的香氣最強(qiáng)，取各分值結(jié)果的平均值作蜘蛛網(wǎng)圖。

圖1 微生物發(fā)酵基質(zhì)聞香感官風(fēng)味模塊結(jié)構(gòu)Fig.1 Microbial fermentation substrate smell sensory flavor module structure

表1 固態(tài)發(fā)酵感官聞香評定方法Table 1 Evaluation method of sensory smell of solid fermentation

注：表中的發(fā)酵香、異香以圖1中的發(fā)酵香和異香為參考；參與聞香評定人員均經(jīng)過香氣識別預(yù)先培訓(xùn);-表示無黏性，+表示有黏性(下同)

1.3.4 菌株的形態(tài)學(xué)特征

將復(fù)篩獲得的菌株接種于LB固體培養(yǎng)皿上，于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，待菌落長勢好時，直接觀察平板上菌落的形態(tài)特征。

1.3.5 菌株分子生物學(xué)鑒定

將菌株接種于LB 肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min 下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h，用TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒提取菌株DNA。具體方法參考 TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒的操作說明書。

PCR引物：細(xì)菌通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

PCR擴(kuò)增：在25.0 μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系中，加上、下游引物1 492r和27f各1.0 μL，Mastermix 12.5 μL，細(xì)菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變形5 min， 94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min， 30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

凝膠電泳：1%瓊脂糖凝膠，1×TAE電泳緩沖液，核酸染料(Gengreen)10 μL，PCR 產(chǎn)物進(jìn)樣量5 μL。

將條帶清晰的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。所得測序結(jié)果輸入美國國家生物信息技術(shù)中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，用MEGA 5.0構(gòu)建目標(biāo)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，獲得目標(biāo)菌株的分類學(xué)地位或系統(tǒng)發(fā)育地位[18-19]。

1.3.6 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香優(yōu)化

為了增強(qiáng)菌株在液態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)生的醬香風(fēng)味，在不改變搖床轉(zhuǎn)速和接種量的情況下優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵溫度條件，具體優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵溫度的設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)醬香型大曲制曲溫度(曲溫達(dá)65 ℃)，并參照余婷婷等[20]、張小龍等[10]、張榮[12]的研究方法。發(fā)酵溫度條件為：55 ℃發(fā)酵6 d(條件1)；37 ℃→45 ℃→55 ℃溫度梯度發(fā)酵，每個溫度下發(fā)酵2 d(條件2)；37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃溫度梯度發(fā)酵，每個溫度下發(fā)酵2 d(條件3)。分別對3個條件下各菌株產(chǎn)生的醬香風(fēng)味進(jìn)行感官聞香，選出產(chǎn)醬香風(fēng)味強(qiáng)的溫度條件。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

將評分?jǐn)?shù)據(jù)在Excel 2010中進(jìn)行整理統(tǒng)計計算，運用Origin 8.6軟件完成相關(guān)圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香功能菌株的初篩

通過常溫稀釋平板涂布法共分離得到202株細(xì)菌，將初篩細(xì)菌通過高溫培養(yǎng)，得到23株能在50 ℃生長且生長狀態(tài)良好的菌株。為得到呈醬香風(fēng)味的細(xì)菌，分別對前述23株菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，并對發(fā)酵結(jié)束樣品進(jìn)行感官評定，如表2所示。

表2 23株細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香風(fēng)味及其發(fā)酵醅感官分析Table 2 Sensory analysis of flavor and fermented grains produced by solid fermentation of 23 strains of bacteria

注：綜合評分是3次重復(fù)樣的綜合評分結(jié)果

由表2可知，初篩細(xì)菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香主要呈醬香、酸臭味、咸菜味、麩皮味、爛紅薯味等香氣，選擇固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生醬香風(fēng)味評分高的細(xì)菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，即菌株MTQ7、MTQ21、MTQ23、MTQ45和MTQ60。發(fā)酵結(jié)果詳如圖2所示。

a-MTQ21、MTQ7；b-MTQ60、MTQ45、MTQ623圖2 菌株液態(tài)發(fā)酵感官風(fēng)味分析Fig.2 Sensory flavor analysis of liquid fermentation strain

通過對比2種發(fā)酵形式下產(chǎn)醬香明顯的菌株，最終選定在固、液態(tài)發(fā)酵條件下均能產(chǎn)生濃郁醬香的3株細(xì)菌即MTQ21、MTQ23、MTQ45為目標(biāo)細(xì)菌。以前對于產(chǎn)醬香風(fēng)味菌株的篩選大多采用逐級溫度梯度升溫模擬固態(tài)發(fā)酵，從而篩選出產(chǎn)醬香風(fēng)味強(qiáng)的菌株，但并沒有研究目標(biāo)菌株在液態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)醬香情況，即固、液結(jié)合并利用感官風(fēng)味導(dǎo)向篩選。如李賢柏[21]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)醬香菌株在小麥固體發(fā)酵基質(zhì)中37 ℃→50 ℃→60 ℃逐級升溫發(fā)酵6 d醬香較突出；余婷婷等[20]將枯草芽孢桿菌菌株在小麥粒固態(tài)發(fā)酵中，按照35 ℃→45 ℃→55 ℃→60 ℃溫度梯度升溫發(fā)酵，每個溫度下發(fā)酵2 d，發(fā)酵結(jié)束后醬香較突出；張小龍等[10]產(chǎn)醬香功能菌以高粱麥粒模擬固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度為35 ℃→40 ℃→45 ℃→50 ℃→55 ℃逐級升溫24 h，靜止培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵基質(zhì)醬香純正。

綜上表明，大多聚焦于研究菌株在固態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)醬香風(fēng)味的能力，對于菌株在液態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)醬香能力的研究較少。如黃永光等[22]對從醬香型白酒生產(chǎn)制曲、堆積酒醅和發(fā)酵期酒醅中分離到的芽孢桿菌于37 ℃液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香分析中，發(fā)現(xiàn)均能產(chǎn)生醬香風(fēng)味等。

本研究通過模擬固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵聞香試驗，最終得到3株均在固、液態(tài)發(fā)酵形式下產(chǎn)醬香濃郁的菌株。但是此液態(tài)發(fā)酵條件下，所產(chǎn)生的醬香風(fēng)味相對較弱，且還存在難聞的風(fēng)味。因此，本研究就此問題對其液態(tài)發(fā)酵溫度條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其最優(yōu)發(fā)酵溫度條件。

2.2 菌株形態(tài)學(xué)特征

對產(chǎn)香菌株MTQ21、MTQ23、MTQ45進(jìn)行形態(tài)學(xué)培養(yǎng)分析，具體形態(tài)特征如表3所示。

表3 三株產(chǎn)醬香功能菌可培養(yǎng)菌落形態(tài)特征Table 3 The colony morphology of three strains of maotai-producing functional bacteria can be cultivated

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

以目標(biāo)菌株的DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出的16S rDNA序列， MTQ21序列大小為1 388 bp；MTQ23序列大小為1 394 bp；MTQ45序列大小為1 388 bp。將MTQ21、MTQ23、MTQ45的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，從中獲得與目標(biāo)菌株序列相近種、屬的16S rDNA序列，利用 MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析。從系統(tǒng)樹可知，菌株均與地衣芽孢桿菌親緣關(guān)系最近，通過序列比對發(fā)現(xiàn)菌株MTQ21與Bacilluslicheniformis(NR 074923.1)相似性為99.86%；菌株MTQ23與Bacilluslicheniformis(NR 118996.1)相似性為99.93%；菌株MTQ45與Bacilluslicheniformis(NR 074923.1)相似性為99.78%。由此可確定3株菌均為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，其電泳檢測結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹詳如3～圖6所示。

圖3 MTQ21、MTQ45、MTQ23菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products of strains MTQ21, MTQ45 and MTQ23

圖4 菌株MTQ21系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of bacterial strain MTQ21

圖5 菌株MTQ23系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of bacterial strain MTQ23

圖6 菌株MTQ45系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of bacterial strain MTQ45

2.4 功能菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香條件優(yōu)化

為增強(qiáng)3株細(xì)菌在液態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)醬香能力，本研究就發(fā)酵溫度條件進(jìn)行探索。如圖7、 圖8所示。

a-條件1；B-條件2圖7 菌株發(fā)酵產(chǎn)物感官風(fēng)味結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Analysis of sensory flavor structure of fermentation products

圖8 條件3菌株發(fā)酵結(jié)束時感官風(fēng)味分析Fig.8 Sensory flavor analysis of strain at the end of fermentation

由圖7可知，在發(fā)酵溫度為55 ℃、150 r/min搖床發(fā)酵6 d，結(jié)果表明這3株細(xì)菌在此條件下產(chǎn)生的醬香風(fēng)味較弱，且發(fā)酵液中伴有青草香、醋酸味、醬油味、生青味、曲香以及麩皮味；在發(fā)酵溫度條件為37 ℃→45 ℃→55 ℃溫度梯度發(fā)酵，每個溫度發(fā)酵2 d 時，逐級跟蹤聞香至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)現(xiàn)醬香風(fēng)味依舊較弱，且還伴有青草香、醋酸味、曲香、霉味、生青味、以及微弱醬油味和麩皮味。由圖8可知，在發(fā)酵溫度為37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃逐級升溫，每個溫度梯度發(fā)酵2 d，150 r/min 搖床培養(yǎng)10 d下，通過感官聞香分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液醬香風(fēng)味突出且空杯留香持久，并伴有曲香、窖底香、生青味、豆豉味以及微弱的麩皮味和青草味，發(fā)酵基質(zhì)呈現(xiàn)深褐色。結(jié)合以上實驗結(jié)果，故選用液態(tài)發(fā)酵條件為37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃逐級升溫，每個溫度梯度發(fā)酵2 d，150 r/min 搖床培養(yǎng)10 d最宜。

3 結(jié)論

本文通過常溫培養(yǎng)法和高溫培養(yǎng)法對醬香大曲中的產(chǎn)醬香風(fēng)味菌株進(jìn)行初步篩選，得到23株形態(tài)差異明顯、可在50 ℃條件下生長且長勢好的菌株；模擬固、液態(tài)發(fā)酵，最終得到3株產(chǎn)醬香風(fēng)味濃郁的菌株，即MTQ21、MTQ23、MTQ45，對這3株菌進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定確定，該3株菌均為地衣芽孢桿菌。通過優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵溫度條件，最終確定最優(yōu)液態(tài)發(fā)酵條件，即以麩皮浸出汁為發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵溫度為37 ℃→50 ℃→55 ℃→60 ℃→65 ℃逐級升溫，每個溫度發(fā)酵2 d，150 r/min 搖床培養(yǎng)10 d產(chǎn)醬香最宜。本課題研究只基于感官風(fēng)味導(dǎo)向?qū)用鎸Ξa(chǎn)醬香功能菌進(jìn)行分離篩選，對于其酶學(xué)結(jié)構(gòu)及代謝風(fēng)味特性正在開展進(jìn)一步的詳細(xì)研究。