鏈格孢、粉紅單端孢通過(guò)降解果皮細(xì)胞壁導(dǎo)致哈密瓜病害

鄭鄢燕，趙力卉,2，王宇濱，馬越，趙曉燕*

1(北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京市果蔬農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100097) 2(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)，110866)

哈密瓜又稱厚皮甜瓜，是我國(guó)西北地區(qū)的特色水果，風(fēng)味獨(dú)特，香氣誘人，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們喜愛，但采后病原菌導(dǎo)致的腐爛非常嚴(yán)重，其中由鏈格孢引起的黑斑病和粉紅單端孢引起的粉霉病是重要的采后病害[1-2]。病原菌的侵染會(huì)影響果實(shí)成熟[3]、活性氧代謝[4]、抗病酶活性和抗病基因的表達(dá)[5-7]以及細(xì)胞壁微觀結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞壁成分的降解[8-9]。目前研究較多的是病害防治方法，SVETLANA等[10]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的殼聚糖均能有效抑制鏈格孢菌的生長(zhǎng)。GE等[11]研究發(fā)現(xiàn)，硫氨酸處理會(huì)提高甜瓜H2O2含量以及過(guò)氧化氫酶(activities of catalase, CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)的活性，誘導(dǎo)抗病相關(guān)酶苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)和過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)的活性，從而增強(qiáng)哈密瓜對(duì)鏈格孢和粉紅單端孢的抵抗能力。乙酰水楊酸采前處理、草酸采后處理可提高甜瓜抗病酶PAL、POD、多酚氧化酶(polyphenoloxidase, PPO)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase, GLU)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，從而減少粉紅單端孢導(dǎo)致的哈密瓜腐爛[12-13]。病害防控技術(shù)非常重要，了解病原菌導(dǎo)致的哈密瓜腐爛機(jī)制同樣重要，可為病害防治提供理論基礎(chǔ)。研究表明，鏈格孢和粉紅單端孢能分泌一系列細(xì)胞壁降解酶，這些細(xì)胞壁降解酶是病原菌克服細(xì)胞壁屏障的重要因素之一，且細(xì)胞壁降解酶活性越高其病原菌侵染能力越強(qiáng)[9，14]。研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢和粉紅單端孢分泌的β-半乳糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶酶活較高。掃描電鏡在果蔬保藏和病原菌侵染果蔬過(guò)程中得到廣泛的應(yīng)用，可以觀察到果蔬細(xì)胞壁降解程度和病原菌的繁殖情況[15-17]。

本研究采用掃描電鏡觀察鏈格孢和粉紅單端孢侵染后病原菌增殖以及哈密瓜細(xì)胞壁降解情況，分析哈密瓜細(xì)胞壁降解酶活性和細(xì)胞壁降解后導(dǎo)致硬度和相對(duì)電導(dǎo)率等變化，探究病原菌導(dǎo)致的腐爛是否通過(guò)細(xì)胞壁降解酶降解哈密瓜細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，為哈密瓜病害防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

哈密瓜，北京市海淀區(qū)彰化路果香四溢水果店；鏈格孢、粉紅單端孢，從自然腐爛的哈密瓜中分離純化并鑒定獲得。

1.2 儀器與設(shè)備

CM-3700d臺(tái)式分光測(cè)色儀，日本柯尼卡-美能達(dá)公司；A11基本型分析研磨機(jī)、T10基本型分散機(jī)，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司(IKA 中國(guó))；GXH-3051便攜式CO2紅外線分析器，上海精密儀器儀表有限公司；UV-1800紫外分光光度儀，日本島津公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)SMS公司；HITACHI SU-8010高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，日本日立高新技術(shù)公司；β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究分兩部分實(shí)驗(yàn)，第一部分以鏈格孢為實(shí)驗(yàn)菌株，探討導(dǎo)致哈密瓜腐爛的最佳接種方式，每個(gè)瓜接種6處，每種接種方式15個(gè)哈密瓜，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病。第二部分是根據(jù)第一部分結(jié)果，以打孔接種方式接種鏈格孢和粉紅單端孢，接種后哈密瓜分為2組，一組用于統(tǒng)計(jì)發(fā)病，一組用于不同時(shí)間取樣測(cè)定指標(biāo)。

1.3.2 病原菌培養(yǎng)與接種

病原菌的培養(yǎng)和孢子制備參考GE等[11]方法，略有改動(dòng)。鏈格孢和粉紅單端孢接種于馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(potato sucrose agar, PSA)，28 ℃培養(yǎng)7 d進(jìn)行產(chǎn)孢。取適量帶有0.01%吐溫80的無(wú)菌水倒入平板中，利用三角棒輕輕刮下病原菌表面的孢子，經(jīng)4層紗布過(guò)濾除去菌絲后，置于顯微鏡下觀察，后將菌懸液濃度調(diào)整到106CFU/mL。

損傷方式和孢子接種參考井敏敏等[7]方法。無(wú)傷接種：將100 μL菌懸液涂在圓形區(qū)域直徑為2 cm的哈密瓜皮上；有傷接種：分別以打孔、畫Z字、刮皮的方式在每個(gè)哈密瓜表皮制造6處損傷，打孔孔徑為0.6 cm × 0.2 cm(寬×深度)，Z字寬度為2 cm，刮皮區(qū)域邊長(zhǎng)為2 cm，將100 μL菌懸液涂在哈密瓜損傷處。28 ℃、85%RH的條件下貯藏7 d，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況并取樣用于指標(biāo)測(cè)定。每組處理10個(gè)瓜用于統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑面積，每個(gè)取樣點(diǎn)10個(gè)瓜用于指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3 發(fā)病率和病斑面積

參考任GUO等[18]方法統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑面積,如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

1.3.4 掃描電鏡觀察貯藏期哈密瓜的超微結(jié)構(gòu)

在哈密瓜接菌處進(jìn)行橫向取樣，取出長(zhǎng)、寬、厚度為0.5 cm × 0.2 cm × 0.1 cm的果皮，放入2.5%戊二醛中固定24 h，送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所進(jìn)行樣品后續(xù)和掃描電鏡觀察。

1.3.5 細(xì)胞壁降解酶的測(cè)定

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-GAL)采用試劑盒測(cè)定。

多聚半乳糖醛酸酶(β-galactosidase，PG)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，β-GLU)、羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase，Cx)的測(cè)定參考曹建康等[19]方法，酶液的提取：稱取5 g哈密瓜皮，經(jīng)10 mL經(jīng)預(yù)冷的95%乙醇、5 mL經(jīng)預(yù)冷的80%乙醇、7 mL經(jīng)預(yù)冷的提取緩沖液于4 ℃、12 000 r/min離心20 min。上清液即為粗酶提取液，4 ℃保存，用于測(cè)定PG、β-GLU、Cx。

粗酶液0.5 mL加入1 mL提取緩沖液，PG測(cè)定加0.5 mL、10 g/L多聚半乳糖醛酸溶液；β-GLU測(cè)定加1.5 mL、10 g/L水楊苷溶液反應(yīng)；Cx測(cè)定加1.5 mL、10 g/L羧甲基纖維素鈉溶液。然后37 ℃的水浴反應(yīng)60 min，立即加入1.5 mL的DNS試劑終止反應(yīng)，煮沸5 min，冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，在540 nm處測(cè)定其吸光度值。

1.3.6 哈密瓜貯藏期色澤的變化

哈密瓜果皮色差采用臺(tái)式色差儀測(cè)量，測(cè)定距病斑1 cm處的色澤，結(jié)果表示為L(zhǎng)＊(亮度)、a＊(紅、綠色)、b＊(黃、藍(lán)色)。

1.3.7 呼吸、失重率、相對(duì)電導(dǎo)率、硬度的測(cè)定

呼吸速率的測(cè)定參考王霞等[20]方法。

失重率以貯藏前后失重差值與貯藏前質(zhì)量的比值計(jì)算，如公式(3)所示：

(3)

相對(duì)電導(dǎo)率參考曹建康等[19]方法，取1 g距病斑1 cm處的哈密瓜皮，放入100 mL的錐形瓶中，倒入20 mL的蒸餾水，浸泡30 min后利用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率L0，然后煮沸5 min，冷卻后測(cè)定其電導(dǎo)率L1，以前后電導(dǎo)率的比值作為相對(duì)電導(dǎo)率。

硬度用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定，探頭為0.8 cm，距病斑1 cm處測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，處理好的數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件繪圖。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間均值比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌接種方式的探索

由圖1-A可知，第7天時(shí)，刮皮接種只在表面有少許菌絲，部分菌絲沒有完全變?yōu)榛疑?；打孔接種的孔內(nèi)部長(zhǎng)滿灰色絲狀的鏈格孢；對(duì)于Z字接種，則在縫隙有極少的菌絲；將菌懸液涂在瓜皮表面的無(wú)傷接種則無(wú)菌絲出現(xiàn)，由此可見，打孔接種的哈密瓜發(fā)病最嚴(yán)重。對(duì)于發(fā)病率(圖1-B)和病斑面積(圖1-C)，刮皮發(fā)病率第7天達(dá)到30%，病斑面積較??；打孔接種第2天開始，發(fā)病率急劇上升，第3天時(shí)發(fā)病率達(dá)到90%，病斑面積也迅速擴(kuò)大，均顯著高于其他接種方式；Z字接種的發(fā)病率從第2天快速增加，第7天時(shí)發(fā)病率為70%，病斑面積與刮皮相似。綜上，打孔哈密瓜發(fā)病率最高；同樣發(fā)病的瓜，打孔的病斑面積也最大，瓜腐爛最快，因此，后續(xù)試驗(yàn)采用打孔方式進(jìn)行接種。

A-哈密瓜腐爛情況；B-發(fā)病率；C-病斑面積圖1 不同方式接種鏈格孢導(dǎo)致的哈密瓜腐爛情況、發(fā)病率、病斑面積Fig.1 The effects of different inoculation methods on disease symptoms、disease incidence and lesion area of Hami melon caused by Alternaria alternata

2.2 接種鏈格孢和粉紅單端孢哈密瓜的腐爛情況

第7天時(shí)，對(duì)照組打孔處有部分菌生長(zhǎng)，但未長(zhǎng)到孔外，也未造成明顯的腐爛；接種鏈格孢和粉紅單端孢的哈密瓜病原菌生長(zhǎng)明顯，已經(jīng)侵染到孔外(圖2-A)。接種鏈格孢和粉紅單端孢的哈密瓜第4天后，發(fā)病率都達(dá)到100%，顯著高于對(duì)照組(圖2-B)。接種鏈格孢后，哈密瓜的病斑面積從第5天開始迅速擴(kuò)大，第7天時(shí)病斑面積是對(duì)照組的15倍(圖2-C)。接種粉紅單端孢后，哈密瓜的病斑面積從第3天開始迅速擴(kuò)大，第7天時(shí)病斑面積是對(duì)照組的16倍(圖2-C)。2株病原菌之間比較發(fā)現(xiàn)，粉紅單端孢引起的發(fā)病率和病斑擴(kuò)增速度均高于鏈格孢(圖2-B和2-C)。

A-哈密瓜腐爛情況；B-發(fā)病率；C-病斑面積圖2 鏈格孢和粉紅單端孢導(dǎo)致的哈密瓜腐爛情況、發(fā)病率、病斑面積Fig.2 The effects of Alternaria alternata and Trichothecium roseum on the disease symptoms，disease incidence and lesion area of Hami melon

2.3 哈密瓜皮超微結(jié)構(gòu)的變化

由圖3-A可知，在第0天時(shí)，哈密瓜皮的細(xì)胞排列非常緊密，細(xì)胞壁堅(jiān)挺，細(xì)胞中無(wú)菌絲生長(zhǎng)，表明無(wú)菌絲侵染。對(duì)照組，在第3天對(duì)照組的哈密瓜細(xì)胞壁有些許塌陷，幾乎看不到菌絲生長(zhǎng)，即隨著貯藏期的增加，果實(shí)正在老化變軟；到第7天時(shí)，哈密瓜皮的細(xì)胞壁降解加重，細(xì)胞塌陷明顯，并且能看到少許菌絲生長(zhǎng)(圖3-B和3-E)。由圖3-C和圖3-F可以看出，接種鏈格孢的哈密瓜皮，第3天細(xì)胞已經(jīng)塌陷，細(xì)胞壁被鏈格孢降解，并且有大量菌絲附著，但還能看到一個(gè)個(gè)細(xì)胞輪廓；到第7天時(shí)，細(xì)胞完全被降解，看不出細(xì)胞形狀，長(zhǎng)滿菌絲，鏈格孢還增殖產(chǎn)生了孢子。由圖3-D和圖3-G可知，接種粉紅單端孢的哈密瓜皮，第3天細(xì)胞大部分塌陷，有大量菌絲附著；第7天時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)完全被降解，表面完全被菌絲侵占，且菌絲生長(zhǎng)旺盛，還導(dǎo)致組織破裂。電鏡圖也能看出粉紅單端孢導(dǎo)致的腐爛現(xiàn)象比鏈格孢嚴(yán)重，這與圖2統(tǒng)計(jì)觀察的結(jié)果一致。

A-0 d；B-3 d對(duì)照；C-3 d鏈格孢；D-3 d粉紅單端孢；E-7 d對(duì)照；F-7 d鏈格孢；G-7 d粉紅單端孢圖3 掃描電鏡觀察哈密瓜接種病原菌后超微結(jié)構(gòu)Fig.3 SEM observation of Hami melon inoculated with spoilage fungi

2.4 貯藏期哈密瓜細(xì)胞壁降解酶的變化

由圖4-A可知，在整個(gè)貯藏期，β-半乳糖苷酶的活性整體呈上升的趨勢(shì)，且接種病原菌的哈密瓜皮酶活性高于對(duì)照組。前5天，接種粉紅單端孢的哈密瓜皮酶活高于接種鏈格孢的哈密瓜皮，從第5天開始，接種鏈格孢的哈密瓜皮酶活高于接種粉紅單端孢的哈密瓜皮，對(duì)照組哈密瓜第5天后酶活略微下降，第7天接種鏈格孢的哈密瓜酶活為對(duì)照組1.54倍，接種粉紅單端孢的哈密瓜酶活為對(duì)照組的1.39倍。

由圖4-B可知，在前6天接種病原菌的哈密瓜皮多聚半乳糖醛酸酶的酶活呈上升趨勢(shì)，在第7天略有下降，對(duì)照組哈密瓜皮多聚半乳糖醛酸酶的酶活先上升后略微下降，總體來(lái)說(shuō)接種病原菌組的酶活性顯著高于對(duì)照組。

由圖4-C可知，貯藏期間，3組哈密瓜皮的β-半乳糖苷酶均呈上升趨勢(shì)，且接種病原菌組的酶活性顯著高于對(duì)照組。兩病原菌組比較，接種粉紅單端孢的哈密瓜皮酶活高于鏈格孢接種組。第7天時(shí)，接種鏈格孢的哈密瓜皮酶活為對(duì)照組的1.39倍，接種粉紅單端孢的哈密瓜皮酶活為對(duì)照組的1.58倍。

由圖4-D可知，貯藏期間，對(duì)照組哈密瓜皮羧甲基纖維素酶的酶活變化呈先上升后下降趨勢(shì)，在第5天有最大值。接種鏈格孢的哈密瓜皮羧甲基纖維素酶的酶活也呈上升趨勢(shì)，第4天后緩慢上升，在第7天有最大值。接種粉紅單端孢的哈密瓜皮羧甲基纖維素酶的酶活呈上升趨勢(shì)，前2 d上升較快，第6天時(shí)有最大值。2個(gè)接種病原菌的處理組的羧甲基纖維素酶的酶活均高于對(duì)照組，同時(shí)，接種粉紅單端孢的哈密瓜皮酶活高于鏈格孢接種組。

2.5 哈密瓜貯藏期色澤的變化

如表1所示，對(duì)于色差L值來(lái)說(shuō)，3種處理的L值在前3 d都呈上升趨勢(shì)，第3天接種鏈格孢的L值顯著高于其他2種處理(P<0.05)，表明哈密瓜表皮顏色越來(lái)越亮。接種鏈格孢的哈密瓜第4天～第7天有略微的變化，在第7天高于對(duì)照組10%。接種粉紅單端孢的哈密瓜皮L除第3天外，均高于對(duì)照組。對(duì)于色差a值，對(duì)照組的a值在前4 d呈上升趨勢(shì)，在第3天到第4天增加較快。接種鏈格孢的哈密瓜皮的a值在前5 d呈上升趨勢(shì)，接種粉紅單端孢的哈密瓜皮的a值在前6 d呈上升趨勢(shì)，都在第7天顯著高于對(duì)照組。對(duì)于色差b值，對(duì)照組總體呈下降趨勢(shì)，第7天低于第0天。接種鏈格孢的哈密瓜皮的b值在前期呈緩慢下降趨勢(shì)，在第7天高于對(duì)照組。接種粉紅單端孢的哈密瓜皮的b值在后4 d顯著高于對(duì)照組。b值越大代表黃色越深，表明病原菌的侵染會(huì)使哈密瓜更快地變黃。

2.6 哈密瓜貯藏期呼吸、失重率、相對(duì)電導(dǎo)率、硬度的變化

貯藏期間3個(gè)組哈密瓜的呼吸速率均呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組哈密瓜的呼吸速率，在第1天和第7天時(shí)快速增加，第2天～第6天增長(zhǎng)趨勢(shì)平緩。接種鏈格孢的哈密瓜的呼吸速率在前3 d與對(duì)照組無(wú)顯著差異，從第3天開始增長(zhǎng)速率高于對(duì)照組，在第7天為對(duì)照組的1.04倍。接種粉紅單端孢的哈密瓜呼吸速率增長(zhǎng)最快，顯著高于其他2組，第7天是對(duì)照組的1.34倍(圖5-A)。

A-β-半乳糖苷酶；B-多聚半乳糖醛酸酶;C-β-葡萄糖苷酶;D-羧甲基纖維素酶圖4 接種鏈格孢和粉紅單端孢對(duì)哈密瓜β-半乳糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶活性的影響Fig.4 The effects of Alternaria alternata and Trichothecium roseum on activities of β-galactosidase，polygalacturonase，β-glucosidase and carboxymethyl cellulase of Hami melon during storage

表1 接種鏈格孢和粉紅單端孢導(dǎo)致的哈密瓜貯藏期色澤的變化Table 1 Changes of color of Hami melon during storage caused by inoculating Alternaria alternata and Trichothecium roseum

注：A～C表示是同一天不同處理之間的比較差異顯著(P<0.05)；a～e表示同一處理不同天之間的比較差異顯著(P<0.05)

整個(gè)貯藏期間3組的哈密瓜失重率都呈上升趨勢(shì)，接種病原菌的哈密瓜失重率顯著高于對(duì)照組。接種鏈格孢的哈密瓜，第7天時(shí)，失重率是對(duì)照組的2倍。接種粉紅單端孢的哈密瓜失重率上升最快，到第7天時(shí)，失重率是對(duì)照組的2.7倍?？梢姴≡那秩究梢詫?dǎo)致哈密瓜失重率上升(圖5-B)。

在貯藏期間3組的哈密瓜的相對(duì)電導(dǎo)率均呈上升趨勢(shì)。對(duì)照組相對(duì)電導(dǎo)率上升緩慢，接種鏈格孢的哈密瓜在第2天下降，在第4天又呈上升趨勢(shì)，到第7天時(shí)有最大值，是對(duì)照組的1.2倍。接種粉紅單端孢的哈密瓜相對(duì)電導(dǎo)率上升速率高于其他2個(gè)處理組，到第7天時(shí)有最大值，是對(duì)照組的1.3倍(圖5-C)。

貯藏期間3組瓜硬度都呈下降趨勢(shì)。對(duì)照組下降較為緩慢，接種鏈格孢的哈密瓜下降較快，在第2、4天迅速下降，最終硬度比對(duì)照組低20%。接種粉紅單端孢的哈密瓜下降較快，硬度比接種鏈格孢的哈密瓜略低，在第2天迅速下降，最終硬度比對(duì)照組低32%(圖5-D)。

A-呼吸；B-失重率；C-相對(duì)電導(dǎo)率；D-硬度圖5 接種鏈格孢和粉紅單端孢對(duì)哈密瓜呼吸、失重率、相對(duì)電導(dǎo)率、硬度的影響Fig.5 The effects of Alternaria alternata and Trichothecium roseum on respiration，weightlessness rate，relative conductivity and firmness of Hami melon during storage

3 討論與結(jié)論

哈密瓜由于含水和含糖量高，是天然的培養(yǎng)基，易受到病原微生物侵染而腐爛。損傷導(dǎo)致的組織破壞，給病原菌提供了重要的侵染路徑。不同接種方式導(dǎo)致的損傷程度不同，為了探討病原菌導(dǎo)致哈密瓜腐爛的最佳損傷方式，本研究以鏈格孢為試驗(yàn)菌株，探討了打孔、畫Z字、刮皮接種哈密瓜的腐爛情況，發(fā)現(xiàn)打孔接種哈密瓜最容易腐爛，這可能是由于打孔接種，病原菌接觸面積大，有利于病原菌侵染，而且打孔損傷更深，會(huì)破壞到果肉，果肉比果皮更有利于病原菌的生長(zhǎng)繁殖。

果蔬細(xì)胞壁主要成分是纖維素和果膠，主要功能是支撐細(xì)胞結(jié)構(gòu)和保護(hù)果蔬抵御外界環(huán)境因素的侵染[20]。病原菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶能使果蔬細(xì)胞壁果膠多聚體降解，破壞組織結(jié)構(gòu)，減少組織細(xì)胞之間的黏性，果蔬能感知細(xì)胞壁完整性的喪失，進(jìn)而激活防御信號(hào)通路，病原菌試圖逃避果蔬的防御，有時(shí)利用果蔬細(xì)胞壁的新陳代謝進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)一步促進(jìn)腐爛[21-22]。本研究采用掃描電鏡觀察到鏈格孢和粉紅單端孢侵染后細(xì)胞壁發(fā)生塌陷，組織結(jié)構(gòu)破裂，且粉紅單端孢侵染對(duì)細(xì)胞壁降解比鏈格孢嚴(yán)重，這可能是因?yàn)榉奂t單端孢比鏈格孢更適應(yīng)哈密瓜環(huán)境，能快速利用哈密瓜營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行繁殖，電鏡結(jié)果和病斑面積都能看出粉紅單端孢生長(zhǎng)更快(圖2和圖3)；粉紅單端孢產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶高于鏈格孢，圖4結(jié)果表明接種粉紅單端孢組哈密瓜β-半乳糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纖維素酶高于鏈格孢組。李慶亮等[23]研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢和粉紅單端孢產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和纖維素酶在蘋果病原菌致病過(guò)程中起重要作用。吳秀[24]研究鏈格孢對(duì)西蘭花品質(zhì)影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)鏈格孢產(chǎn)生的纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和果膠甲基半乳糖醛酸酶綜合作用導(dǎo)致西蘭花病害。YAN等[25]研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢通過(guò)影響哈密瓜細(xì)胞壁代謝相關(guān)酶的活性導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)的破壞，這些研究與我們結(jié)果一致。

病原菌導(dǎo)致果蔬病害時(shí)，果蔬色澤也會(huì)發(fā)生顯著變化。鏈格孢引起的黑斑病和粉紅單端孢引起的紅粉病果蔬顏色會(huì)變黑和變紅，一方面是病原菌自身的顏色導(dǎo)致，另一方面可能是由于病原菌破壞了細(xì)胞，液泡中的酚類底物氧化為醌，醌進(jìn)一步聚合為黑色或褐色的物質(zhì)，導(dǎo)致果皮顏色變暗。研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢和粉紅單端孢侵染促進(jìn)了哈密瓜呼吸，加速代謝活動(dòng)。哈密瓜病害發(fā)生后硬度下降，是由于鏈格孢和粉紅單端孢產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶降解哈密瓜細(xì)胞壁，還可能由于病原菌的侵染促進(jìn)了哈密瓜的成熟。細(xì)胞壁的降解導(dǎo)致組織內(nèi)部物質(zhì)釋放到組織外，電導(dǎo)率相應(yīng)升高。組織破壞以及呼吸代謝加快均會(huì)導(dǎo)致失重的增加。GONG等[3]發(fā)現(xiàn)粉紅單端孢會(huì)誘導(dǎo)乙烯產(chǎn)生，促進(jìn)呼吸，從而促進(jìn)哈密瓜成熟，果實(shí)硬度下降。

綜上，我們把鏈格孢和粉紅單端孢引起哈密瓜病害機(jī)制用圖6總結(jié)。鏈格孢和粉紅單端孢通過(guò)細(xì)胞壁降解酶降解果皮細(xì)胞壁成分，導(dǎo)致細(xì)胞完整性受到破壞，并且病原菌利用哈密瓜營(yíng)養(yǎng)成分不斷生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致哈密瓜腐爛，哈密瓜腐爛后會(huì)使瓜皮顏色變暗，失重率、呼吸速率、電導(dǎo)率增加，硬度下降，并且粉紅單端孢導(dǎo)致的腐爛現(xiàn)象比鏈格孢嚴(yán)重。

圖6 鏈格孢和粉紅單端孢導(dǎo)致哈密瓜腐爛機(jī)制Fig.6 Rotten mechanism of Hami melon caused by Alternaria alternata and Trichothecium roseum