茶多糖在模擬胃腸消化體系的抗氧化作用

韋錚，賀燕，郝麒麟，黃先智，丁曉雯*，陳梅，程鴻

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400716)2(西南大學(xué)科技處，重慶，400716) 3(重慶市巴南區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，重慶，401320)

飲茶在我國有悠久的歷史，大量的研究結(jié)果顯示，茶對(duì)人體健康有益[1-2]。茶的多種功效與其所含的有效成分密切相關(guān)，其中對(duì)茶多酚研究較多而深入[3-5]。茶多糖是由多種單糖組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖，是茶葉中除茶多酚以外的另一活性成分，不同的提取方式得到的茶多糖由于單糖構(gòu)成、分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)等均不同，對(duì)于茶多糖的功能活性有一定的影響[6]。

在正常人體內(nèi)，氧化還原水平是受到嚴(yán)格控制的，機(jī)體氧化和抗氧化作用的平衡對(duì)維持主要的細(xì)胞和生化功能極其重要，從任何方面破壞這種平衡都可能對(duì)細(xì)胞和機(jī)體造成損傷，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化損傷?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)是氧化還原狀態(tài)參數(shù)的重要組成部分，其中包括氧衍生的促氧化劑，可將其分為自由基和非自由基2種化合物，ROS通過對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和 DNA 的不斷攻擊所引發(fā)的相應(yīng)靶分子累積氧化變性或損傷，是造成細(xì)胞代謝紊亂和功能異常的基礎(chǔ)[7]。當(dāng)發(fā)生急性或慢性的氧化應(yīng)激后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，也會(huì)損害各種器官的正常生理功能，進(jìn)而引發(fā)各種疾病甚至癌癥[8]。現(xiàn)有研究表明，茶多糖具有降血糖、預(yù)防肥胖、抗衰老、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能。另有研究通過在體外條件下檢測(cè)茶多糖對(duì)DPPH·清除率、ABTS+·清除率，初步探究茶多糖的抗氧化作用[9-10]。目前對(duì)茶多糖在動(dòng)物體內(nèi)是否具有抗氧化作用還未見研究報(bào)道。因此，本文主要研究不同濃度的茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后的抗氧化能力變化，為后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)及功能性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶多糖，湖南華城生物資源股份有限公司。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、2,4-二硝基苯肼 (2,4-dinitrophenylhydrazine, DNPH)、鹽酸胍，Mackin Biochemical公司;Gene Green核酸染料, 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;豬胰酶、熒光素鈉、β-胡蘿卜素、亞油酸、胃蛋白酶、膽汁鹽、2,4,6-三吡啶基三嗪 (tripyridyltriazine, TPTZ)、水溶性維生素E (Trolox)、2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽 (2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride, AAPH)、牛血清蛋白、哌嗪-N,N′-雙 (2-乙磺酸) (piperazine-1, 4-bisethanesulfonic acid, PIPES)、PUC-19質(zhì)粒DNA、瓊脂糖、10×Loading buffer、50×TAE電泳緩沖液, Solarbio life sciences。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Symergy H1酶標(biāo)儀, 美國伯騰儀器有限公司; 811DK高速冷凍離心機(jī), Eppendorf AG;DYY-6D DNA凝膠電泳儀, 北京六一生物科技有限公司;GenoSens 1860凝膠成像系統(tǒng), 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模擬胃消化[11-12]

模擬胃液的配制：4 g胃蛋白酶溶于100 mL 0.01mol/L鹽酸溶液。

茶多糖溶液配制：稱取一定量的的茶多糖溶于100 mL 0.9%生理鹽水中，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、0.5、1.0、5.0 mg/mL的茶多糖溶液，在沸水浴中加熱15 min后自然冷卻，用1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)pH至2.0后用錫箔紙包好避光保存。

胃消化組：分別取5 mL不同濃度的茶多糖溶液，在通入氮?dú)獾耐瑫r(shí)加入15 mL模擬胃液。

胃酸組：分別取5 mL不同質(zhì)量濃度的茶多糖溶液在通入氮?dú)獾耐瑫r(shí)加入15 mL的0.01 mol/L鹽酸溶液，保持pH=2.0。

胃空白組：分別取5 mL不同濃度的茶多糖溶液在通入氮?dú)獾耐瑫r(shí)加入15 mL生理鹽水。

將上述3組溶液置于37 ℃的恒溫水浴搖床(80 r/min)中搖動(dòng) 2 h，分別在搖動(dòng)0、2 h 時(shí)取出5 mL的上述溶液于10 mL離心管中， 沸水浴5 min滅酶終止消化。自然冷卻后于4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 模擬腸消化[11-12]

腸液的配制：稱取0.4 g胰蛋白酶、2.5 g豬膽鹽，溶于100 mL 0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液中。

將在模擬胃液中消化2 h的1 mg/mL的茶多糖溶液，用1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)pH至7.0后用錫箔紙包好避光保存。

腸消化組：取上述1 mg/mL茶多糖胃消化液，在通入氮?dú)獾耐瑫r(shí)加入20 mL模擬腸液。

腸空白組：取上述1 mg/mL茶多糖胃消化液，在通入氮?dú)獾耐瑫r(shí)加入20 mL 0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液。

將上述腸消化和腸空白2組溶液置于37 ℃的恒溫水浴搖床(80 r/min)搖動(dòng)5 h，分別在消化0、1、3、5 h時(shí)取5 mL溶液于離心管中，于沸水浴中加熱5 min滅酶終止消化。自然冷卻后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 抗氧化活性的檢測(cè)

1.3.3.1 DPPH·清除率的測(cè)定

主要參照SAMANEH等[13]的方法稍作修改。用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，分別取30 μL“1.3.1”和“1.3.2”處理的待測(cè)液和150 μL的DPPH溶液于96孔板中，混勻后暗處放置30 min，在517 nm波長(zhǎng)下以無水乙醇為空白，對(duì)照組用無水乙醇代替待測(cè)樣品測(cè)定吸光度。以抗壞血酸濃度為橫坐標(biāo)，DPPH·清除率為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算出待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的抗壞血酸濃度。DPPH·清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0，對(duì)照組的吸光度；A1，待測(cè)樣或抗壞血酸的吸光度。

1.3.3.2 鐵還原力值(Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)的測(cè)定

主要參照MOHAN等[14]的方法稍作修改進(jìn)行。在96孔板中分別加入10 μL 1.3.1和1.3.2處理的待測(cè)樣液或不同濃度梯度的FeSO4溶液，再加入150 μL于37 ℃水浴預(yù)熱的配制好的FRAP試劑，混勻，37 ℃孵育30 min，于595 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲。

將待測(cè)液的吸光度代入標(biāo)曲計(jì)算對(duì)應(yīng)的FeSO4的濃度。

1.3.3.3 抗氧化能力值(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)的測(cè)定

主要參照MUSCOLO等[15]的試驗(yàn)方法并稍加修改進(jìn)行。在黑色96孔微孔板中分別加入20 μL1.3.1和1.3.2處理的待測(cè)樣液或不同濃度梯度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，20 μL 63 nmol/L的FL使用液，在37 ℃孵育5 min后各加入140 μL 6 mmol/L的AAPH溶液。以激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm，2 min/次，測(cè)定各孔熒光強(qiáng)度，連續(xù)測(cè)定2 h。同時(shí)測(cè)定未添加FL熒光自然衰減對(duì)照(-AAPH)和沒有樣品的溶劑空白對(duì)照(+AAPH)的熒光強(qiáng)度。

1.3.3.4 對(duì) β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化的影響

主要參照朱衛(wèi)東等[16]的試驗(yàn)方法并稍加修改。分別取50 μL 1.3.1和1.3.2處理的待測(cè)樣液和200 μL β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液于96孔微孔板中，以無水乙醇代替待測(cè)樣為對(duì)照，在50 ℃，80 r/min的搖床混勻1 min，于45 ℃、470 nm波長(zhǎng)測(cè)定初始吸光度A0，繼續(xù)在搖床上搖動(dòng)反應(yīng)2 h，測(cè)定吸光度A1，ΔA0對(duì)照=A0對(duì)照-A1對(duì)照；ΔA1樣品=A0樣品-A1樣品。β-胡蘿卜素褪色抑制率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：ΔA0對(duì)照，對(duì)照的吸光度變化；ΔA1樣品，待測(cè)樣的吸光度變化。

1.3.3.5 蛋白質(zhì)羰基含量的測(cè)定

主要參照GEORGIOU等[17]的方法并稍作修改后進(jìn)行。

構(gòu)建氧化體系：FeCl3終濃度為0.1 mmol/L，VC終濃度為1 mmol/L，H2O2終濃度為1 mmol/L，牛血清白蛋白終濃度為40 mg/mL。加入300 μL 1.3.1和1.3.2處理的的待測(cè)樣液，在4 ℃密封氧化12 h后用EDTA(終濃度為1 mmol/L)終止反應(yīng)，以上均在15 mmol/L的PIPES緩沖液中進(jìn)行。隨后按照2，4-二硝基甲苯法測(cè)定蛋白質(zhì)羰基的含量。計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A，370nm波長(zhǎng)下測(cè)定的吸光度；V反總，反應(yīng)體系總體積,1 mL；ε,羰基毫摩爾消光系數(shù)，22 L/(mmol·cm)；d,96孔板光徑,0.5 cm；V樣，加入樣本的體積，mL。

1.3.3.6 DNA保護(hù)潛力的測(cè)定

主要參照RUSSO等[18]的試驗(yàn)方法并稍加修改。在1.5 mL離心管中加入5 μL質(zhì)量濃度為60 ng/μL 的pUC19質(zhì)粒DNA，3 μL 30%的H2O2及5 μL 1.3.1和1.3.2處理的待測(cè)樣液，經(jīng)310 nm紫外光照射10 min，以蒸餾水代替待測(cè)樣為空白組，以蒸餾水代替H2O2且不經(jīng)紫外光照射為對(duì)照組，通過瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定至少3次, 結(jié)果以X±SD表示;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;采用Origin 9.0軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多糖的成分分析

測(cè)定了實(shí)驗(yàn)用茶多糖的組成，結(jié)果見表1。

表1 茶多糖中各成分含量Table 1 Contents of each component in tea polysaccharides

2.2 茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后對(duì)DPPH·清除率的影響

人體中ROS的存在會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生多種疾病，許多天然物質(zhì)對(duì)ROS具有較強(qiáng)的清除作用。DPPH·是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基，其清除率是檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)對(duì)自由基清除和抗氧化能力最常用的指標(biāo)[19]。人體胃消化時(shí)間一般為2 h[11]，根據(jù)胃消化0 h和2 h后茶多糖對(duì)DPPH·清除率，考察胃消化時(shí)間對(duì)不同濃度茶多糖的抗氧化活性的影響，結(jié)果見圖1。

A-0 h；B-2 h圖1 不同濃度茶多糖經(jīng)模擬胃消化0 h、2 h對(duì)DPPH·清除率Fig.1 Different concentrations of tea polysaccharides on simulated gastric digestion for 0 h 2 h on DPPH free radical scavenging rate

由圖1可知，同濃度的茶多糖分別經(jīng)胃空白(生理鹽水)、胃酸(pH=2.0的鹽酸)、胃消化(pH=2.0的鹽酸+胃蛋白酶)同一時(shí)間(0 h或者2 h)處理后，對(duì)DPPH·清除率無顯著差異(P>0.05)，即茶多糖對(duì)DPPH·清除率不受pH、胃蛋白酶、作用時(shí)間的影響，只是隨茶多糖濃度的增加而增加，當(dāng)茶多糖質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)DPPH·清除率達(dá)到(34.21±2.72)%，與茶多糖質(zhì)量濃度5 mg/mL時(shí)相比，DPPH·清除率差異顯著(P<0.01)。苗愛清等[20]檢測(cè)了不同濃度的茶多糖對(duì)DPPH·清除率的影響，也得出了類似的結(jié)果，即茶多糖濃度越高對(duì)DPPH·的清除力越強(qiáng)。

將經(jīng)過模擬胃液消化2 h后的1.0 mg/mL茶多糖在腸液中繼續(xù)消化，考察DPPH·清除率的變化，結(jié)果見圖2。

圖2 1 mg/mL的茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后對(duì)DPPH·的清除率Fig.2 1 mg/mL tea polysaccharides on simulated gastrointestinal digestion on DPPH free radical scavenging rate

由圖2可知，1.0 mg/mL的茶多糖經(jīng)過胃消化后再經(jīng)過腸消化，DPPH·清除率顯著下降，最高只有(6.06±0.21)%，即基本沒有清除作用。這與SHU等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。

2.3 茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后對(duì)FRAP值的影響

鐵還原力是一種快速且簡(jiǎn)單的抗氧化能力檢測(cè)指標(biāo)，能夠檢測(cè)物質(zhì)的總還原力[22-23]。FRAP值越大，還原能力越強(qiáng)。考察不同濃度茶多糖在模擬胃消化條件下對(duì)FRAP值的影響。結(jié)果見圖3。

A-0 h；B-2 h圖3 不同濃度茶多糖經(jīng)模擬胃消化0h,2h的FRAP值Fig.3 Different concentrations of tea polysaccharides on simulated gastric digestion for 0 h、2 h on FRAP

由圖3可知，茶多糖經(jīng)胃消化液、胃酸、胃空白組分別處理0、2 h后，F(xiàn)RAP值無顯著差異(P>0.05)，即茶多糖的FRAP值不受pH、胃蛋白酶、作用時(shí)間的影響，只隨茶多糖質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)(P<0.01)。當(dāng)茶多糖的質(zhì)量濃度分別為0.1、5 mg/mL，其FRAP值分別為(135.89±3.15)μg/mL、(1 035.89±34.36) μg/mL。

將經(jīng)過模擬胃液消化2 h后的1.0 mg/mL的茶多糖在腸液中繼續(xù)消化，考察其FRAP值的變化，結(jié)果見圖4。

圖4 1 mg/mL的茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化的FRAP值Fig.4 1 mg/mL tea polysaccharides on simulated gastrointestinal digestion on FRAP

由圖4可知，腸消化組的鐵還原力顯著低于腸空白組(P<0.01)；與胃消化的FRAP值比較，1 mg/mL茶多糖的FRAP值降低了78.72%(P<0.01)，即茶多糖經(jīng)過腸消化后對(duì)鐵的還原力大大降低。SHU等[21]的研究也得到了類似的結(jié)果。

2.4 茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后對(duì)ORAC值的影響

ORAC值測(cè)定包括過氧化自由基、羥自由基、過氧亞硝基、單線態(tài)氧、超氧陰離子自由基5種人體最主要的活性氧自由基，能有效了解待測(cè)樣的實(shí)際抗氧化能力[24-25]。ORAC值越大，抗氧化能力越強(qiáng)?？疾觳煌瑵舛炔瓒嗵窃谀M胃消化條件下對(duì)ORAC值的影響，結(jié)果見圖5。

A-0 h；B-2 h圖5 不同濃度茶多糖經(jīng)模擬胃消化0 h、2 h的ORAC值Fig.5 Different concentrations of tea polysaccharides on simulated gastric digestion for 0 h,2 h on ORAC

由圖5可知，茶多糖經(jīng)胃消化、胃酸、胃空白組處理0、2 h后，ORAC值無顯著差異(P>0.05)，只是隨茶多糖質(zhì)量濃度的增加，ORAC值增加，當(dāng)茶多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，達(dá)(8.58±0.15) μmol/L。

將經(jīng)過模擬胃液消化2 h后的1.0 mg/mL的茶多糖在腸液中繼續(xù)消化，考察其ORAC值的變化，結(jié)果見圖6。

圖6 1 mg/mL的茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化的ORAC值Fig.6 1 mg/mL tea polysaccharides on simulated gastrointestinal digestion on ORAC

由圖6可以看出，質(zhì)量濃度為1 mg/mL的茶多糖經(jīng)胃、腸消化后，ORAC值保持在(7.45±0.15)μmol/L，經(jīng)腸消化和腸空白處理其ORAC值間無顯著差異，且消化時(shí)間對(duì)其無顯著影響(P>0.05)，表明腸消化對(duì)茶多糖的氧化還原能力無影響。

2.5 茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后對(duì)β-胡蘿卜素褪色抑制率的影響

β-胡蘿卜素褪色抑制率可以用于衡量待測(cè)樣品對(duì)脂質(zhì)過氧化的抵抗[26]。抑制率越高，對(duì)脂質(zhì)保護(hù)作用越強(qiáng)?？疾觳煌|(zhì)量濃度茶多糖經(jīng)模擬胃液消化后β-胡蘿卜素褪色抑制率的變化，結(jié)果見圖7。

A-0 h；B-2 h圖7 不同濃度茶多糖經(jīng)模擬胃消化0 h、2 h對(duì)β-胡蘿卜素褪色抑制率Fig.7 Different concentrations of tea polysaccharides on simulated gastric digestion for 0 h， 2 h on β-carotene fading inhibition rate

由圖7可知，茶多糖經(jīng)胃消化液、胃酸、胃空白處理0、2 h后，β-胡蘿卜素褪色抑制率無顯著差異(P>0.05)，而β-胡蘿卜素褪色抑制率與茶多糖的質(zhì)量濃度成正相關(guān)，茶多糖質(zhì)量濃度為0.1、5 mg/mL時(shí)，β-胡蘿卜素褪色抑制率分別達(dá)到(71.73±0.48)%、(90.88±1.41)%(P<0.01)。

將經(jīng)過模擬胃液消化2 h后的1.0 mg/mL的茶多糖在腸液中繼續(xù)消化，考察其β-胡蘿卜素褪色抑制率的變化，結(jié)果見圖8。

圖8 1 mg/mL的茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化對(duì)β-胡蘿卜素褪色抑制率Fig.8 1 mg/mL tea polysaccharides on simulated gastrointestinal digestion on β-carotene fading inhibition rate

由圖8可知，1 mg/mL的茶多糖經(jīng)胃、腸消化作用后，β-胡蘿卜素褪色抑制率升高至(96.11±0.16)%，且隨處理時(shí)間基本保持不變。相比于同濃度茶多糖在胃消化后的β-胡蘿卜素褪色抑制率增加了10%(P<0.01)，表明經(jīng)過腸液消化可以增強(qiáng)對(duì)β-胡蘿卜素褪色的抑制率。

2.6 茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后對(duì)蛋白質(zhì)羰基含量的影響

氧化應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)損傷有可逆修復(fù)或不可逆修復(fù)2種，羰基化合物的形成屬于不可逆修復(fù)的蛋白質(zhì)損傷。蛋白質(zhì)羰基含量增加會(huì)引起機(jī)體疾病如動(dòng)脈硬化、糖尿病等，因此蛋白質(zhì)羰基含量被認(rèn)為是重要的蛋白質(zhì)損傷標(biāo)志，同時(shí)也可作為抗氧化劑抗氧化能力的標(biāo)志[27-28]。考察不同濃度茶多糖在模擬胃消化后蛋白質(zhì)羰基含量的變化，結(jié)果見圖9。

A-0 h；B-2 h圖9 不同濃度茶多糖經(jīng)模擬胃消化0 h、2 h對(duì)蛋白質(zhì)羰基含量的影響Fig.9 Different concentrations of tea polysaccharides on simulated gastric digestion for 0 h, 2 h on carbonyl content of protein

由圖9可知，未氧化的牛血清白蛋白的羰基含量?jī)H為(0.015±0.001) μmol/mL，經(jīng)氧化后達(dá)(0.183±0.001) μmol/mL，說明H2O2和紫外線顯著導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的氧化損傷(P<0.01)；加入茶多糖后雖經(jīng)胃消化液、胃酸、胃空白處理0、2 h后，蛋白質(zhì)羰基的含量同濃度、同時(shí)間無顯著差異(P>0.05)，說明蛋白質(zhì)羰基含量與胃蛋白酶、胃液的pH、作用時(shí)間無關(guān)，但茶多糖濃度越高，蛋白質(zhì)羰基含量越低，當(dāng)茶多糖質(zhì)量濃度分別為0.1、5 mg/mL時(shí)，蛋白質(zhì)羰基含量分別為(0.126±0.003) μmol/mL、(0.054±0.002) μmol/mL(P<0.01)，后者與前者相比降低了57.14%。

將經(jīng)過模擬胃液消化2 h后1 mg/mL的茶多糖在腸液中繼續(xù)消化，考察其蛋白質(zhì)羰基的變化，結(jié)果見圖10。

圖10 1 mg/mL的茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化對(duì)蛋白質(zhì)羰基含量的影響Fig.10 1 mg/mL tea polysaccharides on simulated gastrointestinal digestion on carbonyl content of protein

由圖10可知，經(jīng)過胃、腸消化后的茶多糖仍對(duì)蛋白質(zhì)具有保護(hù)作用，消化時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)保護(hù)潛力無顯著影響(P>0.05)。與胃消化2 h的比較，經(jīng)腸消化后的蛋白質(zhì)羰基含量減少了12.82%(P<0.05)，表明經(jīng)胃腸消化后茶多糖對(duì)牛血清白蛋白的保護(hù)力增加。

2.6 茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后對(duì)DNA保護(hù)潛力的影響

DNA是自由基攻擊的主要目標(biāo)之一，DNA在H2O2和紫外線照射的作用下，雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，單鏈和雙鏈均斷裂，形成了線性和開放環(huán)狀形態(tài)的DNA[29]。在抗氧化劑存在的情況下，能夠有效抑制DNA結(jié)構(gòu)的破壞。通過瓊脂糖凝膠電泳，可明顯觀察到保護(hù)作用的強(qiáng)弱。因此，DNA保護(hù)潛力是一種明顯的判斷待測(cè)樣抗氧化作用的指標(biāo)?？疾觳煌瑵舛炔瓒嗵窃谀M胃消化后對(duì)DNA保護(hù)潛力的變化，結(jié)果見圖11。

A-0 h；B-2 h圖11 不同濃度茶多糖經(jīng)模擬胃消化2h對(duì)DNA的保護(hù)作用Fig.11 Different concentrations of tea polysaccharides on simulated gastric digestion for 2 h on DNA protection注：0：未氧化DNA；1：氧化DNA；2～4：0.1 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；5～7：0.3 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；8～10：0.5 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；11～13：1.0 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；14～16：5.0 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；17～19：0.1 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；20～22：0.3 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；23～25：0.5 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；26～28：1.0 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組；29～31：5.0 mg/mL茶多糖胃消化組、胃酸組、胃空白組

由圖11可知，與未經(jīng)H2O2氧化和紫外線照射的DNA的泳道(圖11-A的0號(hào)泳道)相比，不添加茶多糖的、經(jīng)H2O2氧化和紫外線照射的DNA的泳道(圖11-A的1號(hào)泳道)中看不到條帶，這可能是因?yàn)檠趸笵NA雙螺旋結(jié)構(gòu)受損斷裂，降解成了極小分子質(zhì)量的碎片。茶多糖經(jīng)胃液消化、胃酸、胃空白處理后，對(duì)DNA有保護(hù)作用但組間無顯著性差異，表明茶多糖對(duì)DNA的保護(hù)作用不受胃液作用時(shí)間和pH的影響，但隨茶多糖質(zhì)量濃度增加，條帶亮度越強(qiáng)即其對(duì)DNA的保護(hù)作用越強(qiáng)。

將經(jīng)過模擬胃液消化2 h后的1 mg/mL茶多糖在腸液中繼續(xù)消化，考察其DNA保護(hù)潛力的變化，結(jié)果見圖12。

圖12 1 mg/mL的茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化對(duì)DNA的保護(hù)作用Fig.12 1 mg/mL tea polysaccharides on simulated gastrointestinal digestion on DNA protection注：1:未氧化DNA；2:氧化DNA；3～4:0 h腸消化組、腸空白組；5～6:1 h腸消化組、腸空白組；7～8:3 h腸消化組、腸空白組；9～10:5 h腸消化組、腸空白組

由圖12可知，經(jīng)胃、腸消化后，茶多糖對(duì)DNA的保護(hù)仍保持較強(qiáng)的水平且消化時(shí)間對(duì)這種保護(hù)能力無影響(P>0.05)。顧艷耿等[30]探究了不同濃度的茶多糖對(duì)DNA損傷的保護(hù)性能，研究表明DNA損傷保護(hù)作用具有濃度依賴性，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果類似。

3 結(jié)論與討論

本文探究了茶多糖經(jīng)模擬胃、腸消化后抗氧化活性的變化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，茶多糖經(jīng)模擬胃、腸消化的條件下，仍然具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且這種抗氧化能力只與茶多糖的濃度有關(guān)，與作用環(huán)境的pH、作用時(shí)間無關(guān)。研究結(jié)果說明胃腸消化對(duì)茶多糖的抗氧化活性無影響，這可能是因?yàn)椴瓒嗵且纸獬尚》肿佣嗵呛蟛拍鼙憩F(xiàn)更強(qiáng)的抗氧化作用，茶多糖需要進(jìn)入大腸后由腸道微生物作用才能分解成小分子物質(zhì)，而茶多糖在胃和小腸中幾乎不被消化分解。陳貴杰等[31]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，茯磚茶茶多糖經(jīng)體外模擬口腔、胃腸消化前后，其分子質(zhì)量、單糖、還原糖含量均無顯著性變化，應(yīng)證了這一假設(shè)。

經(jīng)胃液消化后再經(jīng)腸消化的1 mg/mL的茶多糖的DPPH·清除率和鐵還原力與胃消化比較顯著下降，這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所采用的茶多糖中含有其他成分，這些物質(zhì)與茶多糖之間具有相互作用，SHU等[21]的研究得出了相同的結(jié)果并驗(yàn)證了這一假設(shè)。此外，可能是因?yàn)檫@些物質(zhì)經(jīng)胃腸消化產(chǎn)生的降解物對(duì)茶多糖的DPPH·清除率和鐵還原力產(chǎn)生了影響，而β-胡蘿卜素褪色抑制率有所上升，氧自由基吸收能力(ORAC)、蛋白質(zhì)及DNA保護(hù)潛力則與胃消化的無顯著性差異，DPPH·清除率和鐵還原力的作用機(jī)理主要是電子轉(zhuǎn)移，ORAC的主要機(jī)理為氫原子轉(zhuǎn)移，β-胡蘿卜素褪色抑制率、蛋白質(zhì)及DNA保護(hù)潛力的主要作用機(jī)理則是保護(hù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)不受損壞，當(dāng)物質(zhì)處于氧化應(yīng)激環(huán)境時(shí)，β-胡蘿卜素的雙鍵會(huì)斷裂，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)會(huì)改變，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)破壞，因此各個(gè)指標(biāo)在胃腸消化后產(chǎn)生不同趨勢(shì)的原因可能與各指標(biāo)反應(yīng)的抗氧化機(jī)理不同，茶多糖對(duì)各指標(biāo)的敏感性不同有關(guān)[32]，也可能是由于茶多糖由不同的單糖構(gòu)成，單糖的含量、種類、空間結(jié)構(gòu)不同，構(gòu)成的多糖功能性質(zhì)也不同，對(duì)不同指標(biāo)發(fā)揮作用也可能存在差異，具體的機(jī)理有待進(jìn)一步研究探討。