不同糧食曲的理化特性及其微生物群落結(jié)構(gòu)

李媛媛，羅碧霞，張?zhí)m蘭，姚亞林，郭燕，黃治國,2*,任志強(qiáng),2*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓， 644000)2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓， 644000)

大米、糯米、玉米、高粱和小麥這5種糧食是常用的釀酒原料，它們都含有較為豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但是所含物質(zhì)的種類和含量卻各有差異，使得它們釀造出的酒質(zhì)也各有千秋[1-2]。酒質(zhì)的差異除了糧食本身的理化特性不同之外，還與酶制劑——即酒曲，有很大的關(guān)系[3-4]。

酒曲實(shí)際上是一種微生物培養(yǎng)基，可富集環(huán)境中的釀造微生物[5]。這些微生物所分泌的一些具有生物催化作用的酶如淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，可以將谷物中的營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖和蛋白質(zhì)等轉(zhuǎn)變成糖、氨基酸，糖分再在酵母菌的作用下，分解成乙醇，即酒精[6-8]。酒曲的制作原料通常為小麥、大麥、豌豆或者米粉。目前鮮有以高粱、玉米等釀酒原料為制曲原料的相關(guān)報(bào)道，僅有劉國英等[9]報(bào)道過以豌豆、小麥和大麥為原料的多糧制曲，但是對多種不同釀酒原料制曲的研究還很少。

不同的糧食有各自不同的特點(diǎn)，利用原料本身富集微生物，可能更加利于利用原料。因此本文將常用的5種釀酒糧食制作成曲，并對曲的一些理化性質(zhì)、風(fēng)味物質(zhì)和曲中所含的微生物進(jìn)行了檢測及分析，以期為進(jìn)一步提升白酒質(zhì)量尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米，市售東北秈大米；糯米，市售南方圓糯米；高粱，市售南方散穗型紅高粱；小麥，市售紅皮小麥；玉米：市售黃玉米。

NaCl、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、可溶性淀粉、L-酪氨酸、干酪素、己酸、無水乙醇、葡萄糖 (均為分析純)，成都市科龍化工試劑廠;H2SO4、HCl(均為分析純)，重慶川東化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；GC7890-5975MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糧食的理化指標(biāo)測定

水分的測定，烘干法；淀粉的測定，斐林試劑法[10]；直鏈淀粉和支鏈淀粉的測定，雙波長法[11]；蛋白質(zhì)含量的測定，雙縮脲法[12]；脂肪的測定，參照GB/T 5512—2018糧油檢驗(yàn)糧食中粗脂肪含量的測定[13]中的方法步驟。

1.3.2 曲的制作工藝

參照文獻(xiàn)[8]中的制曲工藝：

糧食粉粹→加水糊化(控制水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%～38%)→冷卻后用磨具壓成型→送入酒廠曲房培養(yǎng)30 d→儲藏

操作要點(diǎn)：5種糧食分別稱取6 kg，每種糧食各制作3塊曲；糊化過程中，水的溫度為100 ℃。

1.3.3 曲的理化性質(zhì)測定

曲的糖化力、發(fā)酵力、酯化力均參照參考文獻(xiàn)[14]中的方法步驟，其中糖化酶活力的定義為1 g絕干曲在40 ℃，pH 4.6的環(huán)境下反應(yīng)1 h后，將淀粉分解成葡萄糖的毫克數(shù)，1 mg即1個(gè)酶活單位(U/g)[15]。

1.3.4 曲的GC-MS成分分析

頂空固微相萃取操作過程:稱取3 g曲粉和1 g NaCl于頂空瓶中，將頂空瓶放入全自動(dòng)固相微萃取儀中，55 ℃平衡10 min后，萃取30 min。

GC-MS的風(fēng)味分析條件：DB-WAX色譜柱(60.0 m×0.25 mm×0.25 μm) 毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比20∶1；程序升溫為初始溫度40 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫至130 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持4 min；色譜-質(zhì)譜接口溫度為240 ℃；離子源溫度為200 ℃；四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲3 min；離子化方式為電子電離(electron ionization，EI)；電子能量為70 eV；掃描方式為全掃描。

1.3.5 曲的基因組提取

本試驗(yàn)采用改良的十六烷基三甲基溴化胺(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法[16]提取曲中微生物的基因組。

1.4 數(shù)據(jù)分析

曲的理化指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型單因素Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。將高通量測序所得序列與Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得操作分類單位 (operational taxonomic units, OTU) 分類。再利用SPSS 20.0軟件對曲的質(zhì)量指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 五種糧食的理化特性

糧食中的營養(yǎng)成分是曲中微生物生長的必要條件，其中淀粉是由葡萄糖分子聚合而成，為微生物的生長提供碳源；蛋白質(zhì)是由氨基酸分子聚合而成，為微生物的生長提供氮源；脂肪是由甘油和脂肪酸組合成的三酰甘油酯，可以較好地調(diào)節(jié)微生物生長環(huán)境的pH[17]。白酒曲除了要求有一定數(shù)量的微生物之外，還須累計(jì)多種胞內(nèi)酶和胞外酶，其中最主要的是淀粉酶，而此類酶多為誘導(dǎo)酶，故要求制曲原料含有較多的淀粉；蛋白質(zhì)也是產(chǎn)酶的必要成分，故制曲原料應(yīng)含有適宜的蛋白質(zhì)。因此考察不同釀酒糧食中的這些成分含量是必要的。如表1所示，5種釀酒糧食的成分含量，其中5種糧食的水分含量都低于14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，符合《白酒生產(chǎn)全書》中所提及的原料水分含量要求，說明糧食沒有霉變；并且5種糧食都含有微生物生長和繁殖所需的營養(yǎng)成分，表明這5種釀酒原料制曲是可行的。

表1 不同糧食的營養(yǎng)成分 單位：%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

2.2 不同糧食曲的糖化酶活力

糖化酶活力是曲的重要指標(biāo)，曲中的糖化酶可以將淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，糖分再由酵母分解成酒精，較高的糖化酶活力可以大大提升原料利用率和出酒率，因此檢測曲的糖化酶活力是有必要的。如圖1所示，不同糧食曲的糖化酶活力高低依次為大米曲>小麥曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，且都達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，大米曲的糖化酶活力最高，為180.9 U/g，高粱曲的糖化酶活力最低，為80 U/g。同為米類的大米和糯米在糖化酶活力上差距很大，可能是由于糯米中脂肪含量過高，使得曲中pH過低，不利于霉菌的生長；大米曲的酶活力高可能是因?yàn)榇竺字械矸酆枯^高，曲中分泌糖化酶的霉菌生長較其余4種曲更好，這可能也是糖化力較高的小曲常用大米為原料的原因之一。高粱曲酶活力過低，可能也與高粱中脂肪含量有關(guān)，此外，高粱在粉碎時(shí)，皮殼與其一同粉碎，由于當(dāng)中皮殼的影響，在制曲過程中使得高粱曲不易成型，水分較易散失，曲中的微生物含量少，導(dǎo)致其酶活力較低。

圖1 不同糧食曲的糖化酶活力Fig.1 Glycosylase activity of different grain kojis注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 不同糧食曲的發(fā)酵力

曲的發(fā)酵力是反映曲產(chǎn)酒的重要指標(biāo)，是酵母將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精的能力。如圖2-a所示，5種不同糧食曲的發(fā)酵力高低依次為大米曲>小麥曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，且都達(dá)到了顯著差異水平(P<0.05)，大米曲的發(fā)酵力最高，達(dá)到了0.86 g/(g·36 h)，可能是由于大米的淀粉含量高，碳源充足，酵母生長繁殖快，產(chǎn)氣多造成；糯米的淀粉含量高，但糯米曲的發(fā)酵力卻很低，其原因可能是糯米中支鏈淀粉的含量過高，在制曲時(shí)不易成型，水分散失過快，酵母數(shù)量少；1 g曲中酵母數(shù)量如圖2-b所示，與發(fā)酵力的高低相符合，證明了酵母是產(chǎn)發(fā)酵力的主要來源，與以上猜測不同糧食曲的發(fā)酵力不同的原因是一致的。

a-不同糧食曲的發(fā)酵力；b-不同糧食曲中酵母數(shù)量圖2 不同糧食曲的發(fā)酵力和不同糧食曲中酵母數(shù)量Fig.2 Fermentation capacity and the number of yeast in different grain kojis

2.4 不同糧食曲的酯化力

曲的酯化力是曲中微生物所代謝的酯化酶催化酸和醇合成酯類物質(zhì)的能力，而酯類化合物是白酒主要風(fēng)味物質(zhì)，因此酯化力也是曲的一個(gè)重要指標(biāo)[18]。如圖3所示，不同糧食曲酯化力的高低為小麥曲>高粱曲>大米曲>糯米曲>玉米曲；糯米曲與玉米曲的酯化力分別為10.5、10.3 mg/(g·100 h)，兩者差異不顯著(P>0.05)，而大米、小麥和高粱曲的酯化力分別為16.4、26.4、20.5 mg/(g·100 h)，且都顯著高于(P<0.05)糯米曲與玉米曲，它們之間也呈顯著差異(P<0.05)。小麥中蛋白質(zhì)的含量高，有充足的氮源，小麥曲中芽孢桿菌屬(Bacillus)的數(shù)量較高，而這一菌屬與酯化力的相關(guān)系數(shù)為0.421，這就使得小麥曲的酯化力高于其余4種糧食曲。

圖3 不同糧食曲的酯化力Fig.3 Esterification capacity of different grain kojis

2.5 不同糧食曲中的揮發(fā)性物質(zhì)

酒曲除了是白酒釀造中的糖化發(fā)酵劑以外，也是生香劑。在釀造過程中，曲中原料的分解產(chǎn)物和微生物的代謝產(chǎn)物，直接或間接地構(gòu)成了白酒的風(fēng)味物質(zhì)；并且對酒曲的感觀鑒評除了對其外觀的判定以外，聞香也是鑒評的方式之一，即對酒曲中香氣成分所表現(xiàn)的綜合香氣進(jìn)行感官評價(jià)。因此，測定酒曲中的風(fēng)味物質(zhì)不僅有助于了解該曲釀造出的白酒中香氣成分，還有助于對酒曲質(zhì)量的判別。

5種不同糧食制作的曲總共測出了66種組分，按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，分為醇類(5種)、酯類(17種)、酸類(2種)、芳香類(11種)、吡嗪類(4種)、烷烯類(12種)、醛酮類(9種)、雜環(huán)類(6種)。每種曲中的揮發(fā)性組分的種類數(shù)量和不同種類化合物的含量如圖4、圖5所示。

圖4 不同糧食曲揮發(fā)性物質(zhì)中不同化合物的種類數(shù)量Fig.4 Types of different compounds of different grain kojis volatile substances

圖5 不同糧食曲揮發(fā)性物質(zhì)中不同種類化合物的含量Fig.5 Contents of different kinds of compounds in volatile materials of different grains

從曲的感觀香味來看，小麥曲的麥香味比其余4種曲要重一些，但是另外4種曲的其他香味卻要比小麥曲更濃厚，并且也各有不同；5種不同糧食曲中的揮發(fā)性組分的種類數(shù)量和含量是有所不同的，在高粱曲、糯米曲、大米曲、小麥曲和玉米曲的樣品中分別檢測到了27、35、24、37、21種物質(zhì)；其中小麥曲檢測到的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，更為復(fù)雜、豐富；但是小麥曲的物質(zhì)種類雖多，總含量卻很少，遠(yuǎn)不及大米曲、糯米曲和高粱曲，使得這3種曲的氣味比小麥曲更加濃郁。

2.6 不同糧食曲微生物群落分析

2.6.1 不同糧食曲中真菌屬的分類

如圖6所示，除去豐度低于1%的菌屬(others)，在5種糧食曲里總共檢測出了5種優(yōu)勢真菌菌屬類。

圖6 不同糧食曲中真菌屬的分類Fig.6 Classification of fungal genus in different grain kojis

大米曲的優(yōu)勢菌屬為嗜熱子囊菌屬(Thermoascus，93.02%)和曲霉屬(Asporgillus，6.11%)；曲霉屬(Asporgillus，96.37%)在糯米曲中所占比例最高；高粱曲中占主導(dǎo)地位的菌屬為嗜熱子囊菌屬(Thermoascus， 38.62%)、曲霉屬(Asporgillus， 34.94%)、嗜熱真菌屬(Thermomyces， 16.54%)以及Rasamsonia屬(8.94%)；小麥曲中大都為嗜熱子囊菌屬(Thermoascus， 96.03%)；嗜熱子囊菌屬(Thermoascus， 61.74%)和曲霉屬(Asporgillus， 36.87%)為玉米曲的優(yōu)勢菌屬。白酒釀造中菌類的作用大致為糖化動(dòng)力——霉菌，發(fā)酵動(dòng)力——酵母菌；由圖1和圖2可知，不同糧食曲的糖化酶活力和發(fā)酵力的高低依次為大米曲>小麥曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，這可能與曲中嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)和曲霉屬(Asporgillus)的占比含量有關(guān)，大米曲的糖化力和發(fā)酵力高，而高粱曲低，可能就是由于高粱曲除去以上所述的2種菌屬以外，其余作用不大的菌屬占比也很高，才會導(dǎo)致其發(fā)酵力和糖化力低。

2.6.2 不同糧食曲中細(xì)菌屬的分類

如圖7所示，除去豐度<1%的菌屬(others)，在5種曲中共檢測出了12種優(yōu)勢細(xì)菌屬類，其中大米曲檢測出10種，糯米曲5種，高粱曲4種，小麥曲6種，玉米曲10種，大米曲和玉米曲的細(xì)菌屬類最多。其中大米曲的優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus， 25.38%)、Kosakonia屬(15.70%)，腸桿菌屬(Enterobacter，7.82%)，鏈霉菌屬(Streptomyces，6.32%)；糯米曲中芽孢桿菌屬(Bacillus，70.52%)、Kosakonia屬(11.98%)、腸桿菌屬(Enterobacter，8.94%)所占比例較高；高粱曲中占主導(dǎo)地位的菌屬主要為芽孢桿菌屬(Bacillus，63.97%)、Kosakonia屬(23.63%)；而小麥曲中大都為芽孢桿菌屬(Bacillus，79.93%)；此外，芽孢桿菌屬(Bacillus，51.46%)、魏斯式菌屬(Weissella，23.26%)、Kosakonia屬(6.25%)為玉米曲的優(yōu)勢菌屬。整體來看，5種曲的優(yōu)勢菌屬都很相似，不同糧食曲中細(xì)菌屬類和而不同，細(xì)菌是酒曲培制和白酒釀造的生香動(dòng)力；例如，芽孢桿菌屬(Bacillus)因能形成芽孢而對環(huán)境有強(qiáng)耐受能力，是白酒釀造中產(chǎn)酶生香的重要微生物之一[19]；魏斯式菌屬(Weissella)屬于乳酸菌屬，能代謝產(chǎn)乳酸，從而形成乳酸乙酯，為白酒提升香味，也是白酒釀造中重要的微生物之一[20]?？赡苁且?yàn)椴煌形⑸锏牟町悓?dǎo)致不同糧食曲釀造出的白酒各具特色。

圖7 不同糧食曲中細(xì)菌屬的分類Fig.7 Classification of bacterial genus in different grain kojis

由圖3所知，小麥曲的酯化力最高，大米曲和玉米曲都相對較低；小麥曲中細(xì)菌屬類雖少，但其芽孢桿菌屬(Bacillus)所占比例特別高，而芽孢桿菌屬(Bacillus)具有蛋白質(zhì)的分解能力和形成少量的雙乙酰，可能是此原因才使得小麥曲的酯化力比其他的糧食曲高。

2.7 不同糧食曲的微生物群落與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

利用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件，將樣品中屬類下豐度>1%的菌屬與糖化力、發(fā)酵力和酯化力進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，研究不同糧食曲中微生物群落與這3個(gè)質(zhì)量指標(biāo)之間的相互關(guān)系，真菌群落關(guān)系如表2所示。

表2 不同糧食曲的真菌群落與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between fungal communities and physical and chemical indicators of different grain kojis

由表2可知，在考察的菌屬當(dāng)中，沒有顯著相關(guān)的菌屬，但是嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)與糖化力和發(fā)酵力的相關(guān)系數(shù)分別為0.793和0.842，說明糧食曲的糖化力和發(fā)酵力與嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)的確有一定的相關(guān)性，這與之前猜測大米曲糖化力和發(fā)酵力高的原因跟這一菌屬有關(guān)不謀而合。

細(xì)菌群落關(guān)系如表3所示。由表3可知，在所考察的菌屬當(dāng)中沒有與酯化力呈顯著相關(guān)的菌屬，但是芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)與酯化力還是有一定的正相關(guān)性，并且芽孢桿菌屬(Bacillus)的相關(guān)系數(shù)為0.421，較其余2種菌屬的相關(guān)系數(shù)高，這也與之前猜測小麥曲酯化力高的原因不謀而合；另外發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬(Streptomyces)和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)與糖化力和發(fā)酵力有極顯著相關(guān)關(guān)系，這可能是由于這2種菌在糖化過程與某些真菌有相協(xié)同的作用，使得它們與這2種力有相關(guān)性。

表3 不同糧食曲的細(xì)菌群落與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between bacterial communities and physical and chemical indicators of different grain cultivars

注：*表示差異顯著；**表示差異極顯著

3 結(jié)論

對不同糧食的理化特性進(jìn)行測定，結(jié)果顯示,5種糧食的水分含量都低于14%，達(dá)到了糧食無霉變的要求，大米的淀粉含量最高，小麥的蛋白質(zhì)含量高，玉米的脂肪含量在5種糧食中最高；總體來說，5種糧食都具有微生物所需要的碳源和氮源等營養(yǎng)物質(zhì)，符合制曲原料的要求。5種糧食曲的理化特性研究表明5種糧食曲的糖化酶活力和發(fā)酵力高低依次為大米曲>小麥曲>玉米曲>糯米曲>高粱曲，酯化力高低依次為小麥曲>高粱曲>大米曲>糯米曲>玉米曲。從微生物群落結(jié)構(gòu)中得知，5種糧食曲的糖化力和發(fā)酵力可能與曲中嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)的含量占比有關(guān)，而它們的酯化力可能與芽孢桿菌屬(Bacillus)的含量占比有關(guān)。5種糧食曲的風(fēng)味物質(zhì)，小麥曲所檢測到的物質(zhì)最多。整體看來，大米曲的效果較好，但是大米的成本會較小麥高出很多，在實(shí)際生產(chǎn)中，可以用大米曲釀造一些高品質(zhì)的酒。雖然大米曲的糖化力和發(fā)酵力高，但酯化力卻還不如小麥曲和高粱曲，可能是因?yàn)榇竺字械鞍踪|(zhì)含量較低，以至于大米曲中一些產(chǎn)酯細(xì)菌少。各個(gè)糧食的營養(yǎng)成分各有所長，因此在以后制曲原料的選擇中，可以以多種糧食的形式制作成多糧曲，各個(gè)糧食取長補(bǔ)短，博采眾長，以富集對原料作用效果更好的微生物，為提升白酒質(zhì)量提供一個(gè)新方向。